专利名称：微波提取葡萄细胞中花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷方法
技术领域：
本发明涉及植物有效成分提取领域，特别是涉及一种微波提取葡萄细胞中花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷方法。
背景技术：
几十年前科学工作者在葡萄科植物中发现一种为防止葡萄腐烂而产生的一种植物抗毒素，即白藜芦醇(Resveratrol，简称Res)及其葡萄糖苷白藜芦醇苷(Piceid)。现代药理研究表明，这类化合物具有抗肿瘤、抗心血管疾病、治疗突变、抗氧化、抗菌抗炎、保肝、 诱导细胞凋亡及雌激素调节等生物药理活性，被广泛应用于医药、食品、化妆品等行业。现在至少在21个科、31个属的72种植物中发现有白藜芦醇存在(Jang Μ,Cai L,Udeani G 0， et al. Cancer chemo-preventive activity of resveratrol,a natural product derived from grape [J] . Science, 1997, 275 (10) :218-220.)。但从文献报道情况来看，目前研究最多，最被关注的只有葡萄、花生等少数几种可食用的植物和虎杖等中药材。有一些白藜芦醇是从葡萄皮、籽等天然植物资源中提取得到。但天然植物的种植占用大量耕地，容易造成水土流失及生态环境恶化；种植过程中使用的农药、化肥会在提取物中残留，直接影响产品的安全性；同时植物中的白藜芦醇含量很低，导致提取纯化成本偏高；因植物生长受环境影响较大，白藜芦醇的含量不稳定，导致提取获得的产品质量不稳定。目前天然白藜芦醇多以中药材虎杖(根)为原料提取得到，但从虎杖中提取的白藜芦醇存在大黄素毒性的问题， 同时由于白藜芦醇诱人的市场前景，世界各地都在争夺虎杖资源，可以预见不久的将来，虎杖资源将面临萎缩，造成与药争源的严重局面。因此，资源问题将是制约白藜芦醇产业发展的巨大障碍。花青素(anthocyanin)是葡萄中一种重要的次生代谢产物，为肉眼可见的水溶性色素，结构上属于总酚中的类黄酮物质(参见Kong JM, Chia LS, Goh NK, Chia TF and BrouillardR. Analysis and biological activities of anthocyanins. Phytochem,2003, 64 :923-933.)。花青素提取物一般为不同花青素分子的混合物，它们具有不同的羟基化、 甲基化禾口酉先基化禾呈度(# JAL Zhangff and Furusaki S. Production of anthocyanins by plant cell cultures. Biotechnol Bioprocess Eng,1999,4:231-252 ；Kong JM, Chia LS, Goh NK, Chia TF and Brouillard R. Analysis and biologicalactivities of anthocyanins.Phytochem,2003,64 :923-933 ；Nyman NA and Kumpulainen JT.Determination of anthocyanins in berries and red wine by High-Performance LiquidChromatography. J Agric Food Chem，2001，49 :4183-4187.)。葡萄细胞培养物中积累的花青素是矢车菊素(cyanidin)、飞燕草素(delphinidin)、芍药色素(peonidin)、 牵牛花素(petimidin)、锦葵色素(malvidin)的各种糖苷，主要为矢车菊素_3_葡萄糖苷(cyanidin-3-glucoside)、芍药色素 _3_ 葡萄糖苷(peonidin-3-glucoside)、锦葵色素-3-葡萄糖苷(malvidin-3-glucoside)以及矢车菊素_3_对香豆酰葡萄糖苷(cyani din-3-p-coumaroylglucoside)、苟药色素 _3_ 对香豆酉先葡萄 Ρ (peonidin-3-p-coumaroylglucoside)禾口 奏色素 _3_ 对香豆酉先葡萄糖昔(malvidin-3-p-coumaroylglucosi de)(参见Curtin C, Zhang W and Franco C. Manipulating anthocyanincomposition in Vitis vinifera suspension cultures by elicitation with jasmonic acid and lightirradiation. Biotechnol Lett, 2003, 25 :1131-1135.)。花青素具有重要的生理作用，它赋予了植物花瓣和果实以颜色，可以吸引动物进行授粉和种子传播；花青素又是一种强效的自由基清除剂，其抗自由基氧化能力是维生素C的20倍，是维生素E的50倍，具有提高人体免疫力、预防各种心脑血管疾病、预防癌症、美容护肤之功效(参见Kong JM, Chia LS, Goh NK, Chia TF andBrouillard R. Analysis and biological activities of anthocyanins. Phytochem, 2003,64 :923-933 ；Springob K, Nakajima J, Yamazaki M and Saito K. Recent advances in the biosynthesis andaccumulation of anthocyanins. Nat Prod Rep, 2003, 20 :288-303 ；Fauconneau B,ffaffo-TeguoP. Huguet F,Barrier L,Decendit A,Merillon JM. Compounds from Vitis vinifera cell cultures using invitro tests. Life Sci, 1997,61 :2103-2110 ；Kamei H, Kojima Τ, Makato H, Koide Τ, Umeda Τ, Yukawa Tand Terabe K.Suppression of tumor cell growth by anthocyanins in vitro. Cancerlnvest,1995,13:590-594 ；Lugasi A.Potential health-protective effects of food-derived flavonoids. OrvHetil,2000,141(32) :1751-1760 ；Martinez-Valverde I， Periago MJ and Ros G. . Nutritional importanceof phenolic compounds in the diet. Arch Latinoam Nutr,2000,50(1) :5-18 ；Karakaya S.Bioavailabilityof phenolic compounds. Crit Rev Food Sci Nutr，2004，44 (6) :453-464)。目前，花青素已被广泛用作葡萄酒、饮料中的添加剂，并应用于化妆品、保健品和医药领域中。植物细胞培养技术是上世纪50年代基于高等植物细胞全能性及具有合成积累次生代谢产物潜力的理论而发展起来的一种生物技术。迄今为止，全世界已对近1000种植物进行过细胞培养方面的研究，生产的天然产物产品包括药品、香料、色素、食品、化妆品等 500多种。利用植物细胞培养技术生产珍惜名贵药用植物的替代品或其活性成分，是一条可以获得珍惜名贵中药材资源的行之有效的重要途径。通过植物细胞培养生产植物次生代谢产物具有如下突出优点不对自然资源和环境产生破坏；不会发生种植原料的人为污染如农药、重金属残留；不受自然环境的影响如地域、气候、种植时间等；不会由于植物资源的逐渐减少而引起成本波动；可以工厂化生产，因而供应、产量、质量、价格等都有保障。通过查阅国内外文献资料，发现关于“白藜芦醇和白藜芦醇苷提取”方面的文献和专利已有报道。如中国专利CN1251361与法国专利FR2795964的提取工艺为在粉末状虎杖原料中加入复合酶在恒温下进行酶解反应，48-72小时获得酶解原料，再用溶剂萃取、 浓缩获得白藜芦醇的半成品，放置M-120小时，并搅拌，然后用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，再经进一步纯化处理，制得白藜芦醇和白藜芦醇苷。中国专利CN1621401A的提取方法是将经过浸泡处理48-72小时后的虎杖干燥根茎粗粉加入一定量的有机溶剂回流提取2 次，回收溶剂后，采用不同极性的溶剂进行回流操作，回收部分溶剂，离心，沉淀经水和吸附剂处理后得到高纯度白藜芦醇结晶。《天然产物研究与开发》(2007*-12-19)发表的“虎杖中白藜芦醇、白藜芦醇苷及大黄素的综合提取工艺研究”是将虎杖粗粉以80%乙醇为提取剂，液固比为12 1，在70°C下加热回流提取2次，每次提取池。总的来说，这类方法工艺操作复杂，周期长，产品质量较低。
目前国内外多采用传统的加热回流提取方法，未见有采用微波法提取葡萄细胞中白藜芦醇及白藜芦醇苷的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微波提取葡萄细胞中花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷方法。本发明的技术方案概述如下一种微波提取葡萄细胞中花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷方法，包括如下步骤按料液质量比为1 1-10的比例，向以植物细胞培养方式得到的葡萄细胞中加入体积浓度为 0% -50%的乙醇水溶液，使用微波提取设备，在温度为30-90°C，功率为100-1000W的条件下搅拌提取0. 5-lOmin，提取1_4次，得到的提取液在45_70°C，在真空度< -65cmHg的条件下减压浓缩，得提取物浸膏，干燥，得到含有花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷的粉末。优选的是植物细胞培养方式为固体培养或悬浮培养。料液质量比为1 5。乙醇水溶液的体积浓度为20 %。提取功率为600W。提取温度为45-75°C。提取时间为anin。提取次数为1次。减压浓缩的温度为60°C。本发明的方法克服了传统方法存在的溶剂提取时间长、溶剂消耗量大，溶剂残留量多，能耗高，成本高，操作过程复杂，难以扩大化，生产实用性差，提取率相对较低，产品质量不高等缺点。本发明的方法加热均勻，提取时间缩短，节能，溶剂消耗量少，提取效率高， 选择性较好，工艺简单，污染小并且设备简单，投资少。
图1为微波输出功率对提取率的影响；图2为微波处理时间对提取率的影响；图3为乙醇浓度对提取率的影响；图4为料液比对提取率的影响。
具体实施例方式下面的实施例可以使本领域的技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明所使用的原料可选用任何含花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷的葡萄细胞，也可选用天津艾赛博生物技术有限公司生产的葡萄细胞；所用的细胞株为葡萄细胞株(Vitisvinifera)，是从幼小的葡萄果实诱导愈伤组织，将愈伤组织转入液体培养基悬浮培养，经过多年的细胞株筛选和代谢调控，获得一系列可高产花青素、白藜芦醇苷和白藜芦醇的细胞株和培养条件。葡萄细胞的诱导方法参见Cormier F, Do CB, NicolasY.Anthocyanin production inselected cell lines of grape (Vitis νinifera L )· In-vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 1994 ；30 :171_173。葡萄细胞悬浮培养的方法参见Zhang W, Curtin C，Kikuchi M，Franco C. Integration of jasmonicacid and light irradiation for enhancement of anthocyanin biosynthesis in Vitis vinifera suspensioncultures. Plant Sci. 2002 ；162 :459_468。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以助于理解而非限制本发明的内容。实施例1—种微波提取葡萄细胞中花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷方法，包括如下步骤将固体培养方式得到的新鲜葡萄细胞进行抽滤，按料液质量比为1 4的比例，将葡萄细胞与体积浓度为30%乙醇水溶液混合，使用微波提取设备，在80°C，微波功率500W 条件下，提取5min，过滤，重复提取4次，合并4次提取液在60°C，真空度< -65cmHg条件下， 减压浓缩成浸膏，干燥，得到含有花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷的粉末。实施例2一种微波提取葡萄细胞中花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷方法，包括如下步骤将固体培养方式得到的新鲜葡萄细胞进行抽滤，按料液质量比为1 7的比例，将葡萄细胞与水混合，使用微波提取设备，在90°C，微波功率1000W条件下，提取lOmin，过滤， 重复提取2次，合并2次提取液，在60°C，真空度< -65cmHg条件下，减压浓缩成浸膏，干燥， 得到含有花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷的粉末。实施例3 一种微波提取葡萄细胞中花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷方法，包括如下步骤将悬浮培养方式得到的新鲜葡萄细胞进行抽滤，按料液质量比为1 10的比例， 将葡萄细胞与体积浓度为40 %的乙醇水溶液混合，使用微波提取设备，在60°C，微波功率 200W条件下，提取lmin，过滤，重复提取3次，合并3次提取液，在60°C，真空度彡-65cmHg 条件下，减压浓缩成浸膏，干燥，得到含有花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷的粉末。实施例4 一种微波提取葡萄细胞中花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷方法，包括如下步骤将悬浮培养方式得到的新鲜葡萄细胞进行抽滤，按料液质量比1 8的比例，将葡萄细胞与体积浓度为50%的乙醇水溶液混合，使用微波提取设备，在50°C，微波功率300W 条件下，提取8min，过滤，提取液在60°C，真空度< -65cmHg条件下，减压浓缩成浸膏，干燥， 得到含有花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷的粉末。实施例5 一种微波提取葡萄细胞中花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷方法，包括如下步骤将悬浮培养方式得到的新鲜葡萄细胞进行抽滤，按料液质量比1 5的比例，将葡萄细胞与体积浓度为20%的乙醇水溶液，使用微波提取设备，在75°C，微波功率600W条件下，提取2min，过滤，重复提取1次，提取液在60°C，真空度< -65cmHg条件下，减压浓缩成浸膏，干燥，得到含有花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷的粉末。实施例6:一种微波提取葡萄细胞中花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷方法，包括如下步骤
将悬浮培养方式得到的新鲜葡萄细胞进行抽滤，按料液质量比1 5的比例，将葡萄细胞与体积浓度为10%的乙醇水溶液，使用微波提取设备，在75°C，微波功率900W条件下，提取2min，过滤，提取液在60°C，真空度< -65cmHg条件下，减压浓缩成浸膏，干燥，得到含有花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷的粉末。实施例7 一种微波提取葡萄细胞中花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷方法，包括如下步骤将悬浮培养方式得到的新鲜葡萄细胞进行抽滤，按料液质量比1 2的比例，将葡萄细胞与体积浓度为40%的乙醇水溶液，使用微波提取设备，在30°C，微波功率400W条件下，提取0. 5min,过滤，重复提取2次，合并2次提取液，在60°C，真空度彡-65cmHg条件下， 减压浓缩成浸膏，干燥，得到含有花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷的粉末。实施例8 一种微波提取葡萄细胞中花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷方法，包括如下步骤将悬浮培养方式得到的新鲜葡萄细胞进行抽滤，按料液质量比1 5的比例，将葡萄细胞与体积浓度为20%的乙醇水溶液，使用微波提取设备，在75°C，微波功率800W条件下，提取6min，过滤，提取液在70°C，真空度< -65cmHg条件下，减压浓缩成浸膏，干燥，得到含有花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷的粉末。实施例9 一种微波提取葡萄细胞中花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷方法，包括如下步骤将悬浮培养方式得到的新鲜葡萄细胞进行抽滤，按料液质量比1 6的比例，将葡萄细胞与体积浓度为50%的乙醇水溶液，使用微波提取设备，在45°C，微波功率700W条件下，提取3min，过滤，重复提取3次，合并3次提取液，在45°C，真空度< -65cmHg条件下，减压浓缩成浸膏，干燥，得到含有花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷的粉末。实施例10 一种微波提取葡萄细胞中花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷方法，包括如下步骤将悬浮培养方式得到的新鲜葡萄细胞进行抽滤，按料液质量比1 1的比例，将葡萄细胞与体积浓度为10%的乙醇水溶液，使用微波提取设备，在60°C，微波功率100W条件下，提取細in，过滤，提取液在60°C，真空度< -65cmHg条件下，减压浓缩成浸膏，干燥，得到含有花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷的粉末。试验例1.微波输出功率对提取率的影响在选取提取最高温度为75°C，微波处理时间为2min，乙醇浓度为20% (乙醇浓度是指乙醇水溶液的体积浓度，下同)，料液质量比1 5的条件下，分别考察微波输出功率 (以下简称功率)为100、200、300、400、600、800、10001对白藜芦醇、白藜芦醇苷和花青素提取率的影响，结果见图1-1，图1-2和图1-3。从图1-1，图1-2和图1-3，可以看出白藜芦醇，白藜芦醇苷提取率均随着微波功率的增加而增加，在600W是达到最大值。再增加微波功率，提取率都在最大值附近，花青素的提取率在400W即达到最大值，再增加微波功率，提取率都在最大值附件，从节能、安全角度考虑，又兼顾三种活性成分的提取率，故优选600W作为微波提取功率。2.微波处理时间对提取率的影响
选取微波输出功率600W，提取最高温度为75°C，乙醇浓度为20%，料液质量比 1 5的条件下，分别考察微波提取时间为l、2、3、5、6、8、10min对白藜芦醇、白藜芦醇苷和花青素提取率的影响，结果见图2-1，图2-2和图2-3。微波处理时间对白藜芦醇、白藜芦醇和花青素的提取密切相关。处理时间短，提取不充分；时间过长，由于三种活性成分是热不稳定性物质，会导致活性成分分解而使提取率下降。如图2-1，图2-2和图2-3所示，随着萃取时间的延长，白藜芦醇、白藜芦醇苷和花青素的提取率增加，当达到anin时，提取率达到最大值，直到5min提取率都在最大值附近，时间再延长，提取率下降，从节能角度考虑选择aiiin作为微波最佳提取时间。3.乙醇浓度对提取率的影响选取微波输出功率600W，萃取最高温度为75°C，料液质量比1 5的条件下，微波处理2min、分别考察水、体积浓度为10%乙醇水溶液、20%乙醇水溶液、30%乙醇水溶液、 40%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液对白藜芦醇、白藜芦醇苷和花青素提取率的影响，结果见图3-1，图3-2和图3-3。不同的乙醇浓度具有不同的极性，根据相似相溶原理可知，不同极性的溶液势必会影响到三种活性成分的提取效果，同时极性不同的溶液会影响微波加热过程。从图3-1、 图3-2和图3-3可以看出，随乙醇浓度增加，提取率逐渐增大，乙醇浓度在20-50%时，提取率都在96%以上，之后随着浓度的增加提取率下降，本着节约溶剂的考虑，故优选乙醇水溶液浓度为20%。4.料液质量比对提取率的影响选取微波输出功率600W，萃取最高温度为75°C，20%乙醇，微波处理aiiin，分别考察料液质量比1 1、1 2、1 5、1 8、1 10对白藜芦醇、白藜芦醇苷和花青素提取率的影响，结果见图4-1，图4-2和图4-3。由图4-1，图4-2和图4-3可知，随着料液比的增加，白藜芦醇、白藜芦醇苷和花青素提取率随之增加，料液质量比达到1 5时提取率最大，之后随着料液质量比的增加，提取率变化不大，考虑节约成本，确定料液质量比为1 5是最好的。5.最佳方案选择根据单因素实验的结果，综合考虑各种因素，本着节能、安全、高效的原则，确定最佳的工艺条件为乙醇水溶液体积浓度为20%，输出功率为600W，微波处理时间为2min，提取温度为75°C，料液质量比为1 5。优化工艺验证(以白藜芦醇和花青素为例)准确称取抽滤的新鲜细胞10. OOg,加入20%乙醇50ml，设定微波输出功率为 600W,提取最高温度为75。C，搅拌提取2min，过滤，定容，稀释，HPLC测定，白藜芦醇提取率大于98%，紫外可见分光光度法测定提取物中花青素的色度值达到40多CV/g。准确称取抽滤的新鲜细胞10. 00g，加入20%乙醇50ml，加热回流提取lh，过滤，定容，稀释，HPLC测定，白藜芦醇提取率为96. 37%，紫外可见分光光度法测定提取物中花青素的色度值达到30多CV/g。可见微波提取aiiin与有机溶剂加热回流提取Ih的提取效果相当，微波提取法可大大缩短提取时间，提高提取效率。浓缩时温度对花青素、白藜芦醇及白藜芦醇苷的稳定性有很大影响，经试验，本发明确定浓缩温度为45°C -60°C，真空度彡-65cmHg。
权利要求
1.微波提取葡萄细胞中花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷方法，其特征是包括如下步骤 按料液质量比为1 1-10的比例，向以植物细胞培养方式得到的葡萄细胞中加入体积浓度为0% -50%的乙醇水溶液，使用微波提取设备，在温度为30-90°C，功率为100-1000W的条件下搅拌提取0. 5-lOmin，提取1_4次，得到的提取液在45_70°C，在真空度< -65cmHg的条件下减压浓缩，得提取物浸膏，干燥，得到含有花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷的粉末。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于所述植物细胞培养方式为固体培养或悬浮培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述料液质量比为1 5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述乙醇水溶液的体积浓度为20%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述提取功率为600W。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是提取温度为45-75°C。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是提取时间为aiiin。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是提取次数为1次。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征是减压浓缩的温度为60°C。
全文摘要
本发明公开了一种微波提取葡萄细胞中花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷方法，包括如下步骤向以植物细胞培养方式得到的葡萄细胞中加入乙醇水溶液，使用微波提取设备，在温度为30-90℃，功率为100-1000W的条件下搅拌提取，得到的提取液减压浓缩，得提取物浸膏，干燥，得到含有花青素、白藜芦醇和白藜芦醇苷的粉末。本发明的方法克服了传统方法存在的溶剂提取时间长、溶剂消耗量大，溶剂残留量多，能耗高，成本高，操作过程复杂，难以扩大化，生产实用性差，提取率相对较低，产品质量不高等缺点。本发明的方法加热均匀，提取时间缩短，节能，溶剂消耗量少，提取效率高，选择性较好，工艺简单，污染小并且设备简单，投资少。
文档编号C07H15/203GK102351830SQ20111023489
公开日2012年2月15日 申请日期2011年8月16日 优先权日2011年8月16日
发明者吕昕泽, 吴秀祯, 张卫, 石万利, 胡雪艳, 龚卫东 申请人:天津艾赛博生物技术有限公司