一种制备花青素苷标准品的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物化学领域，具体涉及一种制备花青素苷标准品的方法。
【背景技术】
[0002] 花青素苷（anthocyanin)是由花青素（anthocyanidin)和糖经糖苷键缩合而成的 水溶性色素，存在于植物表皮细胞的液泡中，呈现橙色、红色至蓝色，是决定被子植物花、果 实、种子、叶等器官颜色的重要色素之一。在花瓣中，花青素苷伴随着花的发育进程逐渐积 累，在花瓣发育的晚期，花青素苷大量生成。营养缺乏、紫外辐射、低温、霜冻、干旱等环境因 子都会诱导花青素苷的合成和积累。花青素苷易吸收可见光和紫外光、有效消除光合电子 传递系统产生的活性氧自由基、调节细胞渗透势、保护细胞膜，减缓可见光和紫外光引起的 光抑制、光损害，在植物光破坏等逆境防御中起到重要作用。国内外许多研宄表明，花青素 苷不仅可呈现出红、黑、兰、紫、橙等多种艳丽的颜色，还具有抗氧化、抗突变、抗癌、抗炎、降 血糖、降血脂、减肥、改善视力等多种活性功能，在食品、保健品、医药、生物工程及化工领域 有广阔的应用前景。随着人们生活水平的提高和对天然植物性来源的无毒无害的有利于保 护人们身体健康、防病治病的天然有机物质的追求，以及人工合成色素对人体有较大的毒 副作用，高效无毒的天然阳离子花青素活性苷元及其提取方法已成为21世纪新兴前沿研 宄课题。
[0003] 红山茶组（Sectioncamellia)物种多，已发表的名称有72种、1亚种、7变种和1 变型，是山茶属（GenusCamellia)中种类最多的类群。滇山茶（Camelliareticulata)、 怒江山茶（C.saluenensis)和山茶（C.japonica)是红山茶组植物中分布面积和被人类作 为观赏植物开发利用最早最多的物种。开红花的茶梅（C.sasanqua)也是山茶属中较早得 到利用的物种。目前，世界各国以上述4个物种为育种材料，已选育出上万个山茶花园艺品 种。这些山茶花的花色艳丽多彩，花朵优雅多姿，冬春开放，花期长，是世界闻名的观赏花 丼，目前为止仅供观赏绿化利用。
[0004] 山茶花的寿命长达数百年，耐贫瘠土壤，可在山区、半山区种植。花瓣大、数量多， 红色花瓣中含有种类丰富的花青素苷色素，是制备花青素苷标准品的理想材料。但是现有 利用红花山茶提取分离花青素苷的技术一般只是得到含花青素的原液产物或粗提取物，无 法对不同种类的花青素苷进行区别化分离纯化，提取物中，非花青素苷杂质太多，总花青素 苷含量低，各种花青素苷组分的构成不清楚，虽然可以作为食品天然色素食用，但很难充分 发挥花青素苷固有的生理功能，无法直接应用于医药、生物工程、化工等领域。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种制备花青素苷标准品的方法，本发明采用红花山茶的花瓣为主要 原料，可针对不同种类的山茶花对应的提取分离不同类型的花青素苷，获得花青素苷单体 种类丰富，同时，本发明制备的花青素苷单体纯度高，稳定性好，可作为标准品直接应用于 食品、医药、生物工程、化工等领域。
[0006] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
[0007] -种制备花青素苷标准品的方法，制备花青素苷标准品的方法按照以下步骤进 行：
[0008] 1)红花山茶的花瓣采集
[0009] 在山茶花的开花期间，采集红色、颜色鲜艳的花朵，剔除雌雄蕊和花瓣以外的杂 质，待提取花青素苷用，在花瓣采集精选的过程中，尽量防止花瓣受到损伤、褐化；
[0010] 2)制备花青素苷原液
[0011] ①将采集到的花瓣放入带盖的玻璃或塑料容器中，稍微用手压实后，再继续加入 花瓣，加到容器口下方2-3cm处；
[0012] ②用纯度为98%以上的醋酸和乙醇，以1:1的比例混合均匀获得50%醋酸乙醇溶 液；向盛有花瓣的容器中加入50%醋酸乙醇溶液，加入到容器高度的四分之三位置处；溶 液加好后用竹棒搅动花瓣，使花瓣充分浸泡在溶液中，将盖子盖好后在室温下浸泡12-24h， 滤出提取液；
[0013] ③再在容器中加入50%醋酸乙醇溶液，按步骤②的方法对容器内的山茶花的花瓣 再进行浸提2次，并收集每次的滤液；
[0014] ④将3次浸提收集的滤液充分混合，在40°C下减压浓缩，蒸发提取液中的水、乙醇 和醋酸，在蒸馏瓶中残留的物质即为花青素苷原液，作为柱层析分离花青素苷单体使用；
[0015] 3)花青素苷的分离和纯化
[0016] 根据所提取标准物质的需要，选择不同的山茶花野生种或或园艺品种为提取原 料，对不同化学结构花青素苷类型进行分离和纯化。
[0017] 作为优选，所采用的山茶花的提取原料为滇山茶、怒江山茶、山茶和茶梅及其园艺 品种中的任一种。
[0018] 作为优选，所采用的山茶花种类为滇山茶、山茶、或茶梅的野生种或园艺品种中的 任一种，在第3)步中花青素苷的分离和纯化的过程中，其对应的Cy3G型或Dp3G型或Cy3GX 型花青素苷的提取步骤如下：
[0019] ①配制流动相
[0020] 流动相以A液和B液按比例配制成线性关系的混合溶液:A液为5 %醋酸水溶液 (5mL食用醋酸溶解于95mL纯净水中），B液为5%醋酸乙醇溶液（5mL食用醋酸溶解于95mL 食用酒精中）；
[0021] ②进行柱层析
[0022] 以MCIgelCHP-20P(三菱化学）为填料，酸性A、B液为流动相，采用反相开口柱 层析法，将花青素苷原液进行分离，获得5-6组份花青素苷粗精制馏分物；
[0023]将此粗制馈分物经SephadexLH-20(GEHealthcareBiosciencesAB)反相柱层 析分离纯化，可获得5-6组分花青素苷含量达80 %左右的粗精制馏分物；
[0024]将上述粗精制馈分物经ChromatorexODS(Fuji SilysiaChemicalLTD)反相柱 层析纯化，可获得纯度为90%以上的各种花青素苷精制产品；
[0025] 最后再用S印hadex和0DS为填料的层析柱经过反复层析纯化，即可获得纯度为 98%以上的Cy3G型或Dp3G型或Cy3GX型的各种花青素苷标准物质；
[0026] 在柱层析中，流动相的母液A、B液以100 :0比例混合的缓冲溶液作为起始浓度； 根据层析柱的大小，加入300-500mL的混合缓冲溶液，然后等梯度逐步增加流动相中B液的 比例达到100%进行洗脱，直到花青素苷全部得到洗脱为止。
[0027] 作为优选，所采用的山茶花种类为怒江山茶野生种或园艺品种，在第3)步中花青 素苷的分离和纯化的过程中，其对应的Cy3G5G型花青素苷的提取步骤如下：
[0028] ①配制流动相
[0029] 流动相以A液和B液按比例配制成线性关系的混合溶液:A液为5 %醋酸水溶液 (5mL食用醋酸解于95mL纯净水中），B液为5%醋酸乙醇溶液（5mL食用醋酸溶解于95mL 食用酒精中）；
[0030] ②进行柱层析
[0031] 先后以MCI和S印hadex为填料，酸性A、B液为流动相，采用反相开口柱层析法，将 花青素苷原液进行分离，可获得5-6组份花青素苷粗精制馏分物；
[0032] 再将此粗精制物经ODS反相柱层析分离，可获得纯度为90%以上的各种花青素苷 精制广物；
[0033] 最后再用S印hadex和ODS为填料的层析柱把上述花青素苷精制产物反复层析纯 化，即可获得纯度为98%以上的Cy3G5G型各种花青素苷标准物质。
[0034] 本发明的有益效果：
[0035] 1、应用本发明可以从红花山茶的花瓣中制备19种以上的花青素苷标准物质；本 发明可以从各种红花山茶花的野生种和园艺品种的新鲜或干燥花瓣中，用醋酸水溶液或 醋酸乙醇溶液提取出花青素苷原液、花青素苷粗精制物、花青素苷精制物和19种花青素苷 单体化合物，即矢车菊素-3, 5-〇_ |3 -二匍萄糖苷（Cy3G5G) (1)、飞燕草色素-3-0-13 -匍 萄糖苷（Dp3G)(2)、矢车菊素-3-〇-(2-〇-f3-木糖基）-f3-半乳糖苷（Cy3GaX)(3)、矢车 菊素_3_〇-|3 -半乳糖苷（Cy3Ga) (4)、矢车菊素_3-〇-(2-〇-|3 -木糖基）-|3 -匍萄糖苷 (Cy3GX) (5)、矢车菊素-3-0-13 -葡萄糖苷（Cy3G) (6)、矢车菊素-3-0- (2-13 -葡萄糖基 6- (Z) -p-香豆酰）-5-0- 0 -葡萄糖苷（Cy3GZpC5G) (7)、矢车菊素-3-0- (6-0- (Z) -p-香 豆酰）-0_半乳糖苷（Cy3GaZpC) (8)、矢车菊素-3-0- (2-0- 0 -木糖基-6-0- (Z) -p-香 豆酰半乳糖苷（Cy3GaZpCX) (9)、矢车菊素-3-0- (2- 0 -葡萄糖基-6- (E) -p-香豆 酰）-5-0- 0 -葡萄糖苷（Cy3GEpC5G) (10)、矢车菊素-3-0- (6-0- (E)-咖啡酰）-0 -葡萄 糖苷（Cy3GECaf) (11)、矢车菊素-3-0-(6-〇-(Z)-p-香酰）-|3 -葡萄糖苷（Cy3GZpC) (12) 、矢车菊素-3-0- (2-0- 0 -木糖基-6-0- (E)-咖啡酰）-0 -葡萄糖苷（Cy3GECafX) (13) 、矢车菊素-3-0- (2-0- -木糖基-6-0- (Z) -p-香豆酰）--葡萄糖苷（Cy3GZpCX) (14) 、矢车菊素-3-0- (6-0- (E) -p-香豆酰）--半乳糖苷（Cy3GaEpC) (15)、矢车菊 素-3-0- (2-0- 0 -木糖基-6-0- (E) -p-香豆酰）-0 -半乳糖苷（Cy3GaEpCX) (16)、飞燕草色 素-3-0- (6- (E) -p-香豆酰）-0 -葡萄糖苷（Dp3GEpC) (17)、矢车菊素-3-0- (2-0- 0 -木糖 基-6-0- (E) -p-香豆酰）-0 -葡萄糖苷（Cy3GEpCX) (18)和矢车菊素-3-0- (6- (E) -p-香豆 酰）-0 _葡萄糖苷（Cy3GEpC) (19)，其化学结构式如图1和图2所示。
[0036] 2、本方法可制备含8种以上花青素苷的粗提取物、含1-2种花青素苷的粗精制物， 而且可以制备纯度达98%以上的花青素苷单体化合物。制备的花青素苷单体纯度高，水溶 性强，可作为标准品用于科研，也可直接作为针剂注射药品使用，还可应用于食品、保健品、 化妆品、生物工程和化工等领域。
【附图说明】
[0037] 图1为来源于山茶花的Cy3GX型和Cy3G5G型花青素苷的化学结构；
[0038] 图2为来源于山茶