6 (香显酸分子量）]+、449. 4[ (M-H) -278 (香显酸+木糖分子量）]+、 287. 4[ (M-H) -440 (香显酸+芸香糖分子量）]+出现呙子峰，与分子C35H35017的分子量相吻 合。根据上述实验结果，化合物14鉴定为矢车菊素-3-0- (2-0- 0 -木糖基-6-0- (Z)-香豆 酰葡萄糖苷。
[0125] 15、矢车菊素-3-0-(6-〇_(E)-p-香酰）-13-半乳糖苷（Cy3GaEpC)(15)鉴定
[0126] 红色粉末，溶于水、甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现红色圆斑，推测 为花青素苷化合物。表1所示1H-NMR结果看出，与化合物4相比，化合物15在低磁场 区多了 1个E型香豆酸。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比（m/z) 595. 2 [M-H]+、 449. 2[(M-H)-146(香豆酸酸分子量）]+、287. 2[(M-H)-308(香豆酸+半乳糖分子量）]+出 现离子峰，与分子(：3(|1127013的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物12鉴定为矢车菊 素-3-0- (6-0- (E) -p-香豆酰）-0 -半乳糖苷。
[0127] 16、矢车菊素-3-〇-(2-〇-|3 -木糖基-6_〇-(E)-p-香豆酰）-|3 -半乳糖苷 (Cy3GaEpCX) (16)鉴定
[0128] 红色粉末，溶于水、甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现红色圆斑，推测为 花青素苷化合物。表1所示1H-NMR结果看出，与化合物15相比，化合物16在高磁场区多 了 5个木糖质子。2D-HMBC图谱表明，木糖1位质子S4.66(lH，d，J= 7. 5Hz)与半乳 糖2位S79. 3(C-2")有强的互作信号，说明木糖1位碳与半乳糖2位碳连接。ESI-MS/ MS分析结果，质谱中在荷质比（m/z) 727. 3 [M-H] +、581. 3 [ (M-H) -146 (香豆酸分子量）]+、 449. 3[(M-H)-278(香豆酸+木糖分子量）]+、287. 3[(M-H)-440(香豆酸+香豌豆糖分子 量）]+出现离子峰，与分子C35成5017的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物16鉴定为 矢车菊素-3-0- (2-0- 0 -木糖基-6-0- (Z)-香豆酰）-0 -半乳糖苷。
[0129] 17、飞燕草色素-3-0-(6-(E)_p-香豆酰葡萄糖苷（Dp3GEpC) (17)鉴定
[0130] 紫红色粉末，溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现紫红色圆 斑，推测为花青素苷化合物。表1所示1H-NMR结果看出，与化合物2相比，化合物17在低 磁场区多了 6个E型香豆酸的质子。2D-HMBC图谱中，葡萄糖6位质子S4. 39(lH，dd，J =12. 0,7. 52Hz)与香豆酸C= 0位碳S169. 2(C= 0)有强的互作信号，说明香豆酸C= 0位碳与葡萄糖6位碳连接。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比（m/z)611.2[M-H]+、 465. 2 [ (M-H) -146 (香显酸分子量）]+、303. 2 [ (M-H) -162 (香显酸+葡萄糖分子量）]+出现 离子峰，与分子(：3(|1127014的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物17鉴定为飞燕草色 素-3-0- (6- (E) -p-香豆酰）-0 -葡萄糖苷。
[0131] 18、矢车菊素-3-〇-(2-〇_f3 -木糖基-6-0-(E)_p-香豆酰葡萄糖苷 (Cy3GEpCX) (18)鉴定
[0132] 深红色粉末，易溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现红色圆 斑，推测为花青素苷化合物。表1和表2所示1H-NMR和13C-NMR结果看出，化合物18与 14的质子数和碳原子数完全相同，但化合物18的葡萄糖6位碳上两个质子和香豆酸a、 b位碳上质子的化学位移与化合物14的有差异。化学位移S6. 20 (1H，d，J= 15. 9Hz)和 S7. 39(1H，d，J= 15.9Hz)说明香豆酸为E型。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比 (m/z)727. 4[M-H]+、581. 1[(M-H)-146(香豆酸分子量）]+、449. 4[(M-H)-278(香豆酸 + 木 糖分子量）]+、287. 4[ (M-H) -440 (香显酸+芸香糖分子量）]+出现呙子峰，与分子C35H35017 的分子量相吻合。根据上述实验结果，化合物18鉴定为矢车菊素-3-〇-(2-〇-f3-木糖 基-6-0- (E)-香豆酰）-0 -葡萄糖苷。
[0133] 19、矢车菊素-3-0-(6-(E)_p-香豆酰）-0_ 葡萄糖苷（Cy3GEpC) (19)鉴定
[0134] 深红色粉末，易溶于水，易溶于甲醇和乙醇。可见光下TLC层析板上呈现红色圆 斑，推测为花青素苷化合物。同样，表1和表2所示1H-NMR和13C-NMR结果看出，化合物 19与12的质子数和碳原子数完全相同，不同点在于化合物19的香豆酸为E型。ESI-MS/MS分析结果，质谱中在荷质比（m/z) 595. 2 [M-H]+、449. 2 [ (M-H) -146 (香豆酸酸分子量）]+、 287. 2 [ (M-H) -308 (香显酸+葡萄糖分子量）]+出现尚子峰，与分子C3(IH27013的分子量相吻 合。根据上述实验结果，化合物19鉴定为矢车菊素-3-0- (6-0- (E) -p-香豆酰）-0 -葡萄 糖苷。
[0135] 表1花青素苷1H-NMR分析结果
[0136]
【主权项】
1. 一种制备花青素苷标准品的方法，其特征在于，制备花青素苷标准品的方法按照以 下步骤进行： 1) 红花山茶的花瓣采集 在山茶花的开花期间，采集红色、颜色鲜艳的花朵，剔除雌雄蕊和花瓣以外的杂质，待 提取花青素苷用，在花瓣采集精选的过程中，尽量防止花瓣受到损伤、褐化； 2) 制备花青素苷原液 ① 将采集到的花瓣放入带盖的玻璃或塑料容器中，稍微用手压实后，再继续加入花瓣， 加到容器口下方2-3cm处； ② 用纯度为98%以上的醋酸和乙醇，以1:1的比例混合均匀获得50%醋酸乙醇溶液； 向盛有花瓣的容器中加入50%醋酸乙醇溶液，加入到容器高度的四分之三位置处；溶液加 好后用竹棒搅动花瓣，使花瓣充分浸泡在溶液中，将盖子盖好后在室温下浸泡12_24h，滤出 提取液； ③ 再在容器中加入50 %醋酸乙醇溶液，按步骤②的方法对容器内的山茶花的花瓣再进 行浸提2次，并收集每次的滤液； ④ 将3次浸提收集的滤液充分混合，在40°C下减压浓缩，蒸发提取液中的水、乙醇和醋 酸，在蒸馏瓶中残留的物质即为花青素苷原液，作为柱层析分离花青素苷单体使用； 3) 花青素苷的分离和纯化 根据所提取标准物质的需要，选择不同的山茶花野生种或园艺品种为提取原料，对不 同花青素苷类型进行分离和纯化。
2. 根据权利要求1所述的一种制备花青素苷标准品的方法，其特征在于，所采用的山 茶花的提取原料为滇山茶、怒江山茶、山茶和茶梅及其园艺品种中的任一种。
3. 根据权利要求2所述的一种制备花青素苷标准品的方法，其特征在于，所采用的山 茶花种类为滇山茶、山茶、或茶梅的野生种或园艺品种中的任一种，在第3)步中花青素苷 的分离和纯化的过程中，其对应的Cy3G型或Dp3G型或Cy3GX型花青素苷的提取步骤如下： ① 配制流动相 流动相以A液和B液按比例配制成线性关系的混合溶液：A液为5%醋酸水溶液（5mL食用醋酸溶解于951^纯净水中），8液为5%醋酸乙醇溶液（51]^食用醋酸溶解于951]^食 用酒精中）； ② 进行柱层析 以MCIgelCHP-20P(三菱化学）为填料，酸性A、B液为流动相，采用反相开口柱层析 法，将花青素苷原液进行分离，获得5-6组份花青素苷粗精制馏分物； 将此粗制馈分物经SephadexLH-20(GEHealthcareBiosciencesAB)反相柱层析分 离纯化，可获得5-6组分花青素苷含量达80%左右的粗精制馏分物； 将上述粗精制馏分物经Chromatorex0DS(FujiSilysiaChemicalLTD)反相柱层析 纯化，可获得纯度为90%以上的各种花青素苷精制广品； 最后再用Sephadex和ODS为填料的层析柱经过反复层析纯化，即可获得纯度为98 %以 上的Cy3G型或Dp3G型或Cy3GX型的各种花青素苷标准物质； 在柱层析中，流动相的母液A、B液以100 :0比例混合的缓冲溶液作为起始浓度；根据 层析柱的大小，加入300-500mL的混合缓冲溶液，然后等梯度逐步增加流动相中B液的比例 达到100%进行洗脱，直到花青素苷全部得到洗脱为止。
4.根据权利要求2所述的一种制备花青素苷标准品的方法，其特征在于，所采用的山 茶花种类为怒江山茶野生种或园艺品种，在第3)步中花青素苷的分离和纯化的过程中，其 对应的Cy3G5G型花青素苷的提取步骤如下： ① 配制流动相 流动相以A液和B液按比例配制成线性关系的混合溶液：A液为5 %醋酸水溶液（5mL食用醋酸解于951^纯净水中），8液为5%醋酸乙醇溶液（51^食用醋酸溶解于95 1^食用 酒精中）； ② 进行柱层析 先后以MCI和Sephadex为填料，酸性A、B液为流动相，采用反相开口柱层析法，将花青 素苷原液进行分离，可获得5-6组份花青素苷粗精制馏分物； 再将此粗精制物经ODS反相柱层析分离，可获得纯度为90%以上的各种花青素苷精制 产物； 最后再用Sephadex和ODS为填料的层析柱把上述花青素苷精制产物反复层析纯化，即 可获得纯度为98 %以上的Cy3G5G型各种花青素苷标准物质。
【专利摘要】本发明公开了一种制备花青素苷标准品的方法，属于植物化学领域，本发明以山茶花的红色新鲜花瓣（或干花瓣）为原料，室温下用酸性乙醇水溶液浸提12-24h，浸提液过滤后减压浓缩，再用酸性食用酒精和水为流动相，经大孔树脂、凝胶、ODS等填料依次进行柱层析，最终可以分离获得19种花青素苷单体；本发明还可以从其它植物的花瓣中提取和分离更多的花青素苷单体，结合结晶技术，从叶片或花瓣中分离非水溶性多酚单体的效果更佳。本发明制备的花青素苷单体纯度高，稳定性好，可作为标准品应用于医药、保健品、化妆品、食品、生物工程、化工等领域。
【IPC分类】C09B61-00, C07H1-08, C07H17-065
【公开号】CN104761596
【申请号】CN201510050328
【发明人】李建宾, 希从芳, 薛英利, 赵庆师, 李纪元
【申请人】云南农业大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年2月1日