花的Cy3G型和Dp3G型花青素苷的化学结构；
[0039] 图3为滇山茶花青素苷原液MCI柱层析馏分液的TLC图谱；
[0040]图4为滇山茶花青素苷粗制馏分MIV经Sephadex柱层析馏分液的TLC图谱；[0041]图5为滇山茶花青素苷粗制馏分SII经ODS柱层析馏分液的TLC图谱；
[0042] 图6为部分花青素苷单体TLC图谱；
[0043] 图7为部分花青素苷单体的HPLC图谱。 图7a为Cy3G5G单体HPLC图谱； 图7b为Cy3GaEpCX单体HPLC图谱； 图7c为Cy3GX单体HPLC图谱； 图7d为Cy3GEpCX单体HPLC图谱； 图7e为Cy3G单体HPLC图谱； 图7f为Cy3GEpC单体HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0044] 实施例lCy3GX型花青素苷的分离和纯化
[0045] -种制备花青素苷标准品的方法，制备该型花青素苷标准品的方法按照以下步骤 进行：
[0046] 1)红花山茶的花瓣采集
[0047] 采用滇山茶野生种、园艺品种或含滇山茶血缘的杂交品种为制备原料，在山茶花 的开花期间，采集红色、颜色鲜艳的花朵，剔除雌雄蕊和花瓣以外的杂质，待提取花青素苷 用，在花瓣采集精选的过程中，尽量防止花瓣受到损伤、褐化；
[0048] 2)制备花青素苷原液
[0049] ①将采集到的花瓣放入容器中，稍微用手压实后，再继续加入花瓣，加到容器口下 方2-3cm处；
[0050] ②用纯度为98%以上的醋酸和乙醇，以1:1的比例混合均匀获得50%醋酸乙醇溶 液，向盛有花瓣的容器中加入50%醋酸乙醇溶液，加入到容器高度的四分之三位置处，溶液 加好后用竹棒搅动花瓣，使花瓣充分浸泡在溶液中，将盖子盖好后在室温下浸泡12_24h，滤 出提取液；
[0051] ③再在容器中加入50%醋酸乙醇溶液，按步骤b的方法对容器内的山茶花的花瓣 再进行浸提2次，并收集每次的滤液；
[0052] ④.将3次过滤收集的滤液充分混合，在40°C下减压浓缩，蒸发提取液中的水、 乙醇和醋酸，在蒸馏瓶中残留的物质即为作为柱层析分离花青素苷单体使用的花青素苷原 液；
[0053] 3)花青素苷的分离和纯化
[0054] ①配制流动相
[0055] 流动相以A液和B液按比例配制成线性关系的混合溶液:A液为5 %醋酸水溶液 (51^醋酸溶解于951^纯净水中），8液为5%醋酸乙醇溶液（51^醋酸溶解于9511^食用酒 精中）；
[0056] ②进行柱层析
[0057] 以MCIgelCHP-20P(三菱化学）为填料，酸性A、B液为流动相，采用反相开口柱 层析法，把花青素苷原液中的花青素苷分离。用17个三角瓶收集馏分液，然后在铝制薄层 层析板上点样，在展开剂中展开，再根据各个样点展开情况（图3)形成MI、MII、MIII、MIV、 MV、MVI等6组份花青素苷粗制馏分物。
[0058] 图3中看出，1与2与其它馏分液的TLC图谱差异较大，可鉴定为独立的两个馏 分，即MI和MII，但3和4的TLC图谱比较相似，可以合并确定为另一个花青素苷粗制馏分 Mill;同样，6、7、8、9、10、11、12和13的11(：图谱比较相似，合并后确定为馏分[￥，15、16和 17合并后确定为馏分MV，而5和14处于两馏分组分间，且无明显的斑点，可合并确定为混 合馏分MVI。
[0059]将此粗制物经Sephadex LH-20 (GE Healthcare Biosciences AB)反相柱层析分 离纯化，可获得5-6组分花青素苷含量达80%左右的粗精制馏分组分；
[0060] 如以Sephadex为填料，前述酸性A、B液为流动相，采用反相开口柱层析法，把MIV 花青素苷粗制馏分物中的花青素苷分离，收集到13瓶馏分液，经TLC层析后，获得图4所示 TLC图谱。由图4看出，经Sephadex填料层析后，获得的馏分液的TLC图谱中的斑点较图3 清晰，且数量减少，说明各馏分中的化合物种类减少，主成分的含量提高。根据主成分的不 同，可划分为5个粗精制馏分组分，1单独确定为馏分SI，但2、3和4的TLC图谱比较相似， 合并后确定为馏分SII，5、6和7的TLC图谱比较相似，合并确定为馏分SIII，同样，8、9、10 和11合并后确定为馏分SIV，12和13合并确定为馏分SV。
[0061]将粗精制物经Chromatorex ODS(Fuji Silysia Chemical LTD)反相柱层析纯化， 可获得纯度为90%以上的各种花青素苷精制物；
[0062] 将粗精制馏分SII经0DS开口柱反相层析后，收集到13瓶馏分液，其TLC层析图 谱见图5。由图5看出，经0DS反相层析后，馏分液的TLC图谱中的斑点比图4中更加少且 清晰，说明各馏分液中化合物的纯度更高。根据TLC图谱，可把馏分液划分为6个精制馏分 组分，即，2和3合并后确定为馏分CI，4和5合并确定为馏分CII，6和7合并确定为馏分 CIII，8和9,10、11和12分别合并并依次确定为馏分CIV、CV，13单独为馏分CVI。
[0063] 最后再用Sephadex和0DS为填料的层析柱经过反复层析纯化，即可获得纯度为 98%以上的各种花青素苷标准物质；
[0064] 在柱层析中，流动相为A、B液以100 :0比例混合的溶液开始，根据层析柱的大小， 加入300-500mL的流动相，然后等梯度逐步增加流动相中B液的比例进行洗脱，直到花青素 苷全部得到洗脱为止。
[0065] 用此法分离和纯化获得的Cy3GX型花青素苷主要有：Cy3GX(5)、Cy3GZpCX(14)、 Cy3GEpCX(18)、Cy3GaX(3)和Cy3GaEpCX(16);以滇山茶的花瓣作为原料，同时还可以分 离获得Cy3G5G(l)、Cy3Ga(4)、Cy3G(6)、Cy3GEpC5G(10)、Cy3GECaf(ll)、Cy3GZpC(12)、 Cy3GaEpC(15)、Cy3GEpC(19)等花青素苷单体。
[0066] 实施例2Cy3G5G型花青素苷的分离和纯化
[0067] -种制备花青素苷标准品的方法，制备该型花青素苷标准品的方法按照以下步骤 进行：
[0068] 1)红花山茶的花瓣采集
[0069] 采用怒江山茶或含怒江山茶血缘背景的山茶花园艺品种为制备原料，在山茶花的 开花期间，采集红色、颜色鲜艳的花朵，剔除雌雄蕊和花瓣以外的杂质，待提取花青素苷用， 在花瓣采集精选的过程中，尽量防止花瓣受到损伤、褐化；
[0070] 2)制备花青素苷原液
[0071] ①将采集到的花瓣放入容器中，稍微用手压实后，再继续加入花瓣，加到容器口下 方2-3cm处；
[0072] ②用纯度为98%以上的醋酸和乙醇，以1:1的比例混合均匀获得50%醋酸乙醇溶 液，向盛有花瓣的容器中加入50%醋酸乙醇溶液，加入到容器高度的四分之三位置处，溶液 加好后用竹棒搅动花瓣，使花瓣充分浸泡在溶液中，将盖子盖好后在室温下浸泡12_24h，滤 出提取液；
[0073] ③再在容器中加入50%醋酸乙醇溶液，按步骤b的方法对容器内的山茶花的花瓣 再进行浸提2次，并收集每次的滤液；
[0074] ④.将3次过滤收集的滤液充分混合，在40°C下减压浓缩，蒸发提取液中的水、 乙醇和醋酸，在蒸馏瓶中残留的物质即为作为柱层析分离花青素苷单体使用的花青素苷原 液；
[0075] 3)花青素苷的分离和纯化
[0076] ①配制流动相
[0077] 流动相以A液和B液按比例配制成线性关系的混合溶液:A液为5 %醋酸水溶液 (51^醋酸溶解于951^纯净水中），8液为5%醋酸乙醇溶液（51^醋酸溶解于9511^食用酒 精中）；
[0078] ②进行柱层析
[0079] 先后以MCI和S印hadex为填料，酸性A、B液为流动相，采用反相开口柱层析法，将 花青素苷原液进行分离，可获得5-6组份花青素苷粗精制馏分物；
[0080] 再将此粗精制物经ODS反相柱层析分离，可获得纯度为90%以上的各种花青素苷 精制物；
[0081] 最后再用Sephadex和ODS为填料的层析柱经过反复层析纯化，即可获得纯度为 98%以上的各种花青素苷标准物质。
[0082]用此法分离和纯化获得的Cy3G5G型花青素苷单体主要有Cy3G5G(l)、 Cy3GEpC5G(10)、Cy3G(6)、Cy3GZpC(12)和Cy3GEpC(19)，同时还可以分离获得Cy3Ga(4)、 Cy3GECaf(11)、Cy3GaEpC(15)等花青素苷单体。
[0083] 实施例3Cy3G型花青素苷的分离和纯化
[0084] 采用山茶，或山茶的园艺品种为制备原料，其具体离和纯化方法与实施例1中 Cy3GX型花青素苷的分离纯化方法和步骤一致。
[0085]此制备法主要可获得Cy3G(6)、Cy3Ga(4)、Cy3GZpC(12)、Cy3GaEpC(15)、 Cy3GECaf(ll)和Cy3GEpC(19)等花青素苷标准品。
[0086] 实施例4Dp3G型花青素苷的分离和纯化
[0087]采用茶梅，或茶梅园艺品种的花瓣为原料，也可用香港红山茶（C.hongkongensis) 的花瓣为制备原料，其具体分离和纯化方法与实施例1中Cy3GX型花青素苷的分离纯化方 法和步骤一致。
[0088] 用此制备法主要获得Dp3G(2)、Dp3GEpC(17)、Cy3G(6)、Cy3Ga(4)、Cy3GECaf(11)、 Cy3GZpC(12)、Cy3GaEpC(15)和Cy3GEpC(19)等花青素苷标准品。
[0089] 实施例5实验分析（以从滇山茶的花瓣中提取花青素苷标准品为例）
[0090] 一、鉴定馏分组分
[0091] 经柱层析获得的洗脱液，可用TLC和高效液相色谱法（HPLC，HighPerformance LiquidChromatography)进行鉴定，确定馏分组分。
[0092]TLC鉴定：层析板以错制层析板（如 25TLCaluminiumsheets20X20Silicagel 60F254)为优，展开剂用C、D液配制。C液为苯：甲酸乙酯：甲酸=1 :7 :1(V/V)，D液为甲酸 乙酯：甲酸：蒸馏水=3 :1 :1 (V/V)。C、D比例在2 :1-3 :2间，洗脱液样点经展开剂展开后， 用20 %硫酸甲醇溶液喷洒层析板，加热显色。
[0093]Cy3G5G、Cy3GX、Cy3G、Cy3GaEpCX