专利名称：单一单元离子交换色谱抗体纯化的制作方法
单一单元离子交换色谱抗体纯化本发明涉及单一单元纯化抗体的方法以及可以用在该方法中的装置。用于医药应用的由细胞培养物生产的单克隆抗体的纯化是包含大量步骤的过程。这种抗体必然要摆脱所有潜在有害的污染物，诸如源自生产这些抗体的细胞的蛋白质和DNA、培养基组分诸如胰岛素、PEG醚类和消泡剂以及任何可能存在的感染试剂如病毒和朊病毒。从生产这些蛋白质的细胞的培养物中纯化抗体的典型过程在BioPharmInternational Junl,2005, “Downstream Processing of Monoclonal Antibodies:fromHigh Dilution to High Purity” 中有所描述。因为抗体由诸如为杂交瘤细胞或转化宿主细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠骨髓瘤衍生的NSO细胞、幼年仓鼠肾细胞、人类视网膜衍生的PliR.(:’6K:细胞)的细胞产生，所以必须从细胞培养液中优选在纯化过程初期去除颗粒状细胞材料。该过程的这个部分在本文中被称为“澄清”。随后或者作为澄清步骤的一部分，抗体被粗略纯化至至少约80%，通常是通过“结合加洗脱”色谱步骤(在IgG的情况下通常使用固定的蛋白质A)。这个在本文中被称为“捕集”的步骤不仅导致抗体的初期大幅纯化，还可以导致体积大幅下降，因而产物浓缩。用于捕集的其他替代方法例如为膨胀床吸附(EBA)、2_相液体分离(利用例如聚乙二醇)或采用易溶盐(lyotropic salt,诸如硫酸铵)的分级沉淀。澄清和捕集之后，对抗体进行进一步纯化。通常，为了充分去除残余杂质，在捕集之后需要至少2个色谱步骤。捕集 之后的色谱步骤通常被称为中间纯化步骤，而最终的色谱步骤通常被称为精提纯(polishing)步骤。这些步骤中的每一个通常以间歇模式作为单一单元操作进行，并且这些步骤中的至少一个以“结合加洗脱”模式进行。此外，每一个色谱步骤都需要特定的负载条件，例如pH、电导率等等。因此，为了将负载调节至所需要的条件，在每个色谱步骤之前必须进行额外的处理。上述所有这些使得该过程耗时耗力。在这些步骤中通常被基本去除的杂质都是过程衍生污染物，诸如宿主细胞蛋白质、宿主细胞核酸、培养基组分(如果存在)、蛋白质A(如果存在)、内毒素(如果存在)和微生物(如果存在)。目前的专利出版物中已经描述了许多这样纯化抗体的方法。WO 2010/062244.该发明涉及用于分离和纯化蛋白(如单克隆抗体)的双水相萃取加强的沉淀方法。对于随后的进一步纯化抗体，描述了两种备选方案:(I)以结合和洗脱的方式的阳离子交换色谱，然后以流经模式的阴离子交换，或(2)首先是以流经模式的多模式色谱，然后是以流经模式的阴离子交换色谱。WO 2010/048183.该发明涉及通过在酸性pH下连续的离子交换和HIC色谱从抗体中去除HCP。WO 2009/138484.首先从说明书和权利要求书中阅读该发明并不明确。它涉及通过在蛋白质A(衍生物)柱上捕集抗体并随后从该柱释放抗体来从混合物中纯化抗体。这种后者含抗体材料能够通过例如连续的阴离子色谱和阳离子色谱来进一步纯化。EP 2027921该发明涉及基于聚合物伯胺的膜离子交换色谱的介质，以及其在诸如抗体的纯化中的使用。
WO 2005/044856涉及使用羟基磷灰石树脂(任选地结合阴离子交换色谱)从抗体制剂中去除高分子量聚集体。W02008/145351描述了均以流经模式的相继的阴离子交换色谱和阳离子交换色
-1'TfeP曰。上述方法的缺点是操作时间长、可变成本高(例如由于在“结合加洗脱”步骤本身所必然需要的大的柱容量，因此需要大量昂贵的树脂)和固定成本高(由于劳动力成本)。根据本发明的一个实施方式，通过使用均采用流经模式并且优选地作为单一单元操作的串联、联机的阴离子交换色谱(AEX)和阳离子交换色谱(CEX)，能够实现从细胞培养物产生的抗体中非常有效地去除残留杂质。因此，在AEX色谱步骤后和CEX色谱步骤前，合适的缓冲液的联机混合用于调节对于CEX色谱的关于pH和电导率的适合条件。根据本发明的另一个实施方式，通过使用均采用流经模式并且优选地作为单一单元操作的串联、联机的阳离子交换色谱(CEX)和阴离子交换色谱(AEX)，能够实现从细胞培养基产生的抗体中非常有效地去除残留杂质。因此，在CEX色谱步骤后和AEX色谱步骤前，合适的缓冲液的联机混合用于调节对于AEX色谱的关于pH和电导率的适合条件。这种新方法的优点是大大减少了操作时间和劳动，并从而降低运行成本。此外，由于所有的单元以仅要求对杂质而非产物的足够的结合能力的流经模式操作，所以需要的色谱单元较小(因而成本较低)。因此，本发明可以被定义为从生物反应器中生产的细胞培养液中纯化抗体的方法，其至少包含中间纯化步骤和精提纯步骤，其中新的纯化步骤包含组合的串联、联机的AEX和CEX色谱。这可以以两种备选方式中的一种进行(I)先是阴离子交换(AEX)色谱，作为流出级分得到分离混合 物，然后是串联联机的阳离子交换(CEX)色谱，作为流出级分得到经纯化的抗体制剂，或(2)先是阳离子交换(CEX)色谱，作为流出级分得到分离混合物，然后是串联联机的阴离子交换(AEX)色谱，作为流出级分得到经纯化的抗体制剂，并且其中由这些可选方式得到的经纯化的抗体制剂至少经过一个进一步纯化步骤。W02008/145351也描述了以任意顺序的均采用流经模式的顺序的阴离子交换色谱和阳离子交换色谱。然而，该公开与本发明的区别在于，对于来自第一分离步骤的分离混合物为使其准备好用于第二分离步骤而进行的调节是离线进行的。令人惊奇的是，根据本发明，能够非常好地完成两个色谱过程的整合，以使两个离子交换的工艺流程可以相互协调，并且同时针对第二色谱步骤的缓冲条件的调节可以被精确地进行，从而实现聚集体的完全清除。在本发明的上下文中，“分离混合物”是指从本发明的第一离子交换步骤中得到的溶液，“经纯化的抗体制剂”是指从本发明的第二离子交换步骤中得到的溶液。本申请通篇采用这样的术语。在第一离子交换色谱步骤之前，通常对在生物反应器中生产的细胞培养液进行澄清(即除去所有细胞材料，诸如全细胞和细胞碎片)。而且，在第一离子交换色谱步骤之前，为了确保用于该第一离子交换步骤的关于pH和电导率方面的最佳条件，可以将调节溶液添加到细胞培养液中或含抗体溶液中。在具体的实施方式中，本发明的方法包括作为单一单元操作运行的组合AEX和CEX 了的色谱。
“流出级分”在本文中是指以与洗脱流体基本上相同的速度离开色谱柱的所加载的含抗体级分的至少一部分。该级分在洗脱过程中基本上不在柱上保留。因此，选择条件以使杂质而不是抗体与阴离子交换材料和阳离子交换材料结合。例如在上述WO 2009/138484中已经公开了使用利用阴离子交换和阳离子交换相互作用色谱的蛋白质混合物的顺序色谱分离来分离蛋白质。其中，两个离子交换步骤作为两个单独的步骤来进行。业已发现，为了大规模生产的目的，本发明的方法(采用流经模式)与现有的公开方法(采用所需抗体的结合并洗脱)相比提供远远更快的分离。有利的是，含有抗体的分离混合物被补充适量的溶液，以调节pH和电导率，以在本发明的第二离子交换色谱步骤中获得最佳性能。令人惊奇地发现，在进入第二离子交换步骤前采用流体的联机调节可以实现非常好的分离结果。当AEX色谱为第一步时，通常在弱碱性pH和低电导率下进行AEX。我们发现采用流经模式的CEX的性能在弱酸性条件、低电导率下最好。因此，用酸性溶液联机补充来自AEX色谱的流出产物，从而在使得所述流出产物进行CEX色谱之前，将pH降低至所需值并调节和保持最佳电导率。任何将 实现适当的PH降低和电导率调节的溶液或缓冲液可用于这一目的。优选地，PH被校正至至少约3.5的值、更优选地至至少约4的值、更优选地至至少约5的值。优选地，pH被校正至约7的最大pH值。电导率优选地保持在或校正到至少约2mS且最大约10mS。优选地，溶液含有需要少的补充量的酸性组分，导致产物的最小稀释。酸性组分可以从下述化合物中选择，例如柠檬酸(或其一元或二元钠盐或钾盐)、磷酸(或其一元或二元钠盐或钾盐)、乙酸、盐酸或硫酸。优选地，在这种情况下用适量的pH和电导率调节溶液补充分离混合物是单一单元操作的一部分，例如通过在CEX色谱步骤前在过程流(如在混合室中)中联机混合上述酸性溶液。“适量的酸性溶液”在本文中是指，足以使大部分的相关杂质吸附到CEX材料上的酸性溶液，但该用量足够低，不会导致产物的结合。对于每个纯化过程来说，需要确定酸性组分的最佳用量和优选类型。或者，可以改变AEX和CEX的顺序。在这种情况下，方法以CEX色谱单元开始，并且应该在该采用流经模式的CEX单元中进行最优纯化的pH和电导率下预调节来自该CEX色谱的含有抗体的溶液。通常，这将是在弱酸性PH和低电导率下。必须在对于该特定步骤的最优纯化条件下进行随后的AEX步骤。优选地，校正pH至最大约9的值、更优选至最大约9.5的值。优选地，校正pH至至少约7的pH值。电导率优选地保持在或校正至至少约2mS并且最大约10mS。通常，这将是在弱碱性pH和低电导率下。出于该目的，在CEX后且AEX色谱前用适量的溶液联机补充含有抗体溶液，从而调节用于最佳AEX性能的pH和电导率。因此，实际上，用碱性溶液来联机补充来自CEX色谱的流出产物，以提高分离混合物的PH至所需值，并调节或保持对于AEX色谱单元的操作的最佳电导率。任何将导致适当的pH降低和电导率调节的溶液或缓冲液可用于这一目的。优选地，溶液含有需要少的补充量的碱性组分，导致产物的最小稀释。这种碱性组分的一些例子为氢氧化钠或氢氧化钾(或其一元或二元钠盐或钾盐)或三(羟甲基)氨基甲烷，但是任何其他本领域已知的碱性组分可以用于该目的。
根据本发明的AEX色谱可以在AEX单元中进行，AEX单元可以通过经典的含有树脂的填充床柱子、含有整块材料的柱子、含有适当色谱介质的径向柱子、吸附膜单元、或者本领域已知的具有起阴离子交换剂作用的配体和适当介质的任何其他阴离子交换色谱装置来实现。在AEX柱中，色谱材料可作为其上附着或强或弱的阳离子配体的颗粒状支撑材料存在。膜型阴离子交换剂由以其上附着或强或弱的阳离子配体的一个或多个片材形式的支撑材料组成。支撑材料可以由有机材料或无机材料或有机材料与无机材料的混合物组成。合适的有机材料为琼脂糖基介质和甲基丙烯酸酯。合适的无机材料为硅石、陶瓷和金属。膜形阴离子交换剂可由含AEX配体的亲水性聚醚砜组成。合适的强AEX配体例如基于季铵基团。合适的弱AEX配体例如基于伯、仲或叔胺基团或本领域中已知的任何其他合适配体。根据本发明的CEX色谱可以在CEX单元中进行，CEX单元可以通过经典的含有树脂的填充床柱子、基于整块材料的柱子、含有适当色谱介质的径向柱子、吸附膜单元、或者本领域已知的具有起阳离子交换剂作用的配体和适当介质的任何其他阳离子交换色谱装置来实现。在CEX柱中，色谱材料可作为其上附着CEX配体的颗粒状支撑材料存在。膜状色谱装置由以其上附着CEX配体的一个或多个片材形式的支撑材料组成。支撑材料可以由有机材料或无机材料或有机材料与无机材料的混合物组成。合适的有机支撑材料包括例如亲水性碳水化合物(如交联琼脂糖、纤维素或右旋糖苷)或合成共聚物材料(诸如聚(烷基天冬酰胺)、甲基丙烯酸2-羟基乙酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚物、或酰基化聚胺)。适当的无机支撑材料例如为硅石、陶瓷和金属。膜形CEX可由含有CEX配体的亲水聚醚砜构成。CEX配体的适当例子是硫酸、羧酸、膦酸或本领域中已知的任何起或强或弱阳离子交换剂作用的其他合适配体。根据本发明的方法能够纯化的抗体为具有6.0或更高、优选地7.0或更高、更优选
7.5或更高的等电点pH的抗体。这些抗体可以是G类、A类或M类的免疫球蛋白。抗体可以是人的或非人的(如啮齿动物)或嵌合抗体(例如“人类化的”)的抗体，或可以是上述免疫球蛋白的亚基，或者可以是由免疫球蛋白部分和衍生自或等同于另一蛋白质(非免疫球蛋白)的部分组成的杂交蛋白质。令人惊讶地，由组合的AEX和CEX色谱得到的抗体材料通常具有至少98%、优选至少99%、更优选至少99.9%、甚至更优选至少99.99%的非常高的纯度(参照蛋白质含量)。
根据本发明的阴离子交换色谱步骤优选地在中性或弱碱性pH下实施。其将去除带负电荷的杂质，如DNA、宿主细胞蛋白质、蛋白质A(如果存在)、病毒(如果存在)、蛋白质类培养基组分诸如胰岛素和胰岛素类生长因子(如果存在)。在阳离子交换色谱步骤中，将去除大部分剩余的大分子杂质(主要是产物聚集体)，该步骤利用如下的性质:当采用恰当的PH和电导率条件时，当产物流经时杂质结合到色谱装置上。随后，(高度)纯化的抗体制剂将需要通过超滤和渗滤(diafiltration)进行处理从而除去所有残余的低分子量杂质，用最终的配制缓冲液替代所用缓冲液，并且调节所需要的最终产物浓度。此外，该纯化的材料通常还需要进行处理以确保可能存在的感染性试剂(诸如病毒和/或朊病毒)的完全去除。本发明还涉及含有阴离子交换色谱部分(AEX)和阴离子交换色谱部分(CEX) 二者的单一操作单元，这两个部分串联连接。这个单一操作单元还包括在第一离子交换色谱部分的上游端的入口和在第二离子交换色谱部分的下游端的出口。这个单一操作单元还包括位于第一离子交换色谱部分和第二离子交换色谱部分之间的连接部，该连接部进一步包括用于将调节溶液供应给分离混合物的入口。因此，在一个实施方式中，本发明涉及能够用于根据本发明的方法的单一操作单元，其包含阴离子交换色谱部分和阴离子交换色谱部分二者，这两个部分以该顺序串联连接，其中阴离子交换色谱部分的出口与阳离子交换色谱部分的入口相连，其中所述单元包括在阴离子交换色谱部分的上游端的入口和在阳离子交换色谱部分的下游端的出口，并且其中所述单元还包括位于阴离子交换色谱部分和阳离子交换色谱部分之间的入口，用于供给酸性调节溶液到分离混合物。在另一个实施方式中，本发明涉及能够用于根据本发明的方法的单一操作单元，其包含阳离子交换色谱部分和阴离子交换色谱部分，两部分以该顺序串联连接，其中阳离子交换色谱部分的出口与阴离子交换色谱部分的入口相连，其中所述单元包括在阳离子交换色谱部分的上游端的入口和在阴离子交换色谱部分的下游端的出口，并且其中所述单元还包括位于阳离子交换色谱部分和阴离子交换色谱部分之间的入口，用于供给碱性调节溶液到分离混合物。在根据本发明的处理过程中，液体流可以通过任何商用双泵色谱系统例如AKTA explorer (GE)、B10PR0CESS (GE)、任何双泵HPLC系统、或者符合图1或2的图示的任何定制的装置来建立。这些色谱装置中的大部分被设计来操作单一色谱单元(即柱或膜)。采用简单的适配，可以进行额外连接以将第一离子交换单元放置在泵A之后、混合室之前。图1和2表示基本结构。两个色谱装置的串联联机连接加上在图1和2中所示位置上的任选预过滤器可能 导致不希望的压力累积。因此，在一些条件下，额外的技术适配(例如在AEX单元之后的额外的泵和在AEX单元之前的减压装置)可能需要包含在该图中。
图1:包含阴离子交换色谱部分和阳离子交换色谱部分二者的单一操作单元。缓冲液A是适用于AEX步骤的最佳操作的调节和冲洗缓冲液。缓冲液B包含酸性溶液，并且以为了获得用于CEX步骤的操作的最佳条件所需的与负载/缓冲液A的比率混入。该混合比可以利用固定的体积混合流量来实现或者可以基于例如PH输出通过反馈回路自动控制。MC是任选的混合室，其可以包含任何类型的静态混合器。L=负载PA =M APB =M BAEX=阴离子交换单元CEX=阳离子交换单元pH = pH 传感器
σ =电导率传感器PF =任选的预过滤器图2:包含阳离子交换色谱部分和阴离子交换色谱部分二者的单一操作单元。缓冲液A是适用于CEX步骤的最佳操作的调节和冲洗缓冲液。缓冲液B包含碱性溶液，并且以为了获得用于AEX步骤的操作的最佳条件所需的与负载/缓冲液A的比率混入。该混合比可以利用固定的体积混合流量来实现，或者可以基于例如PH输出通过反馈回路自动控制。MC是任选的混合室，其可以包含任何类型的静态混合器。L=负载PA =M APB =M BAEX=阴离子交换单元CEX=阳离子交换单元pH = pH 传感器σ =电导率传感器PF=任选的预过滤器
实施例材料和方法所有实验采用通过人细胞系产生的IgGl来进行。利用化学上确定的培养基采用XD 培养基进行培养(见GeneticEngineering&Biotechnology News, Aprl2010Vol.30, N0.7),此后稀释所获物，并通过三步深层过滤用过滤器序列 ZetaPlusl0M02P、ZetaPlus60ZA05 和 SterAssure PSA020 (都来自Cuno (3M))除去细胞。这样澄清后的收获物包含约4.0g/L IgG，并被分装储存在_20°C下。在蛋白质A纯化前，解冻并平衡至室温。首先，利用MabSelect (GE)采用标准过程(加载经澄清的收获物、用20mMTris+150mM NaCl的头次冲洗、用ρΗ5.5的IOOmM乙酸钠缓冲液的二次冲洗并用ρΗ3.0的IOOmM乙酸缓冲液洗脱)进行通过标准蛋白质A色谱的初步纯化。在MabSelect洗脱之后，收集被洗脱的峰，并将其保持在ρΗ3.5下I小时。此后，用2Μ Tris ρΗ9.0将样品中和至ρΗ7.4，并将样品通过0.22 μ m过滤。采用由此得到的材料，进行3个系列的实验:1.确定采用流经模式的AEX色谱的HCP去除性能(实验I) ；2.确定使用流经模式的CEX色谱的最佳条件(实验2) ；3.在一个单一单元操作实验中组合优化的AEX和CEX条件(实施例1)。HCP通过ELIZA采用多克隆抗_PerC6HCP进行测量。单体型IgG和聚集体浓度通过尺寸排除色谱(HP-SEC)根据标准过程测定。实验1.
确定采用流经 模式的阴离子交换色谱的优化性能条件流经模式的AEX色谱采用上述在乙酸Tris缓冲液中的经预纯化的IgG进行。测试如下 AEX 介质:Mustang Q coins (0.35ml) (Pall)、Sartobind Q capsule (Iml)和ChromaSorb capsule (0.08ml) (Millipore)(所有均为膜吸附剂)。所有AEX介质采用AKTA explorer以40床体积/hr的流经方式运行。用软化水稀释样品至最终电导率5mS。调节和冲洗缓冲液是IOOmM乙酸Tris pH7.4。每个AEX介质上加载的产物量为1.5g IgG/ml膜床体积。在色谱步骤之前和之后测量HCP。起始材料包含3305ng/mg IgG。对于上述MustangQ、Sartobind Q和Chromasorb膜,洗脱的材料分别包含39、57和71ng/mg IgG。这些结果清楚表明，所有被测AEX色谱介质在应用的条件下充分去除了 HCP。实验2.
确定利用流经模式的CEX色谱去除聚集体的条件对于这些实验，调节预纯化的IgG至pH8.0,并稀释至2mS的电导率。在ΛΚΤΛexplorer 上使用 16cm 床长度 Poros50HS (Applied Biosystems)填充的 VLll (Millipore)柱。冲洗和平衡缓冲液为5.35ml/min的流率下的50mM Tris HCl ρΗ7.4。冲洗后，以类似的流率加载产物。负载过程中，采用第二泵，在柱之前联机混合50mM NaH2PO4溶液(缓冲液B)，以便在进入柱前调节pH和电导率。测试不同固定比率的产物流和缓冲液B，保持柱的总流动恒定。在UV信号稳定后在每个比例下取流出物的样品。表1.使用不同体积比的联机混合含50mM NaH2PO4的缓冲液B的采用PoroS50HS
的聚集体清除
权利要求
1.从生物反应器中生产的细胞培养液中纯化抗体的方法，所述方法至少包含中间纯化步骤和精提纯步骤，其中所述新的纯化步骤包含组合的串联、联机的AEX和CEX色谱。
2.如权利要求1所述的方法，其中先进行所述阴离子交换(AEX)色谱步骤，作为流出级分得到分离混合物，然后进行串联、联机阳离子交换(CEX)色谱步骤，作为流出级分得到经纯化的抗体制剂，并且其中所述经纯化的抗体制剂经过至少一个进一步纯化步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其中先进行所述阳离子交换(CEX)色谱步骤，作为流出级分得到分离混合物，然后进行串联、联机阴离子交换(AEX)色谱步骤，作为流出级分得到经纯化的抗体制剂，并且其中所述经纯化的抗体制剂经过至少一个进一步纯化步骤。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中串联联机的AEX和CEX色谱步骤作为单一单元操作进行。
5.如权利要求1至4中任意一项所述的方法，其中所述分离混合物在第二离子交换步骤之前补充适量的溶液，以便调节PH和电导率，以获得所述第二离子交换色谱步骤的最佳性能。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述分离混合物在CEX色谱之前补充适量的酸性溶液。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述分离混合物在CEX色谱之前补充适量的溶液，所述溶液包含朽1檬酸(或其一元或二元钠盐或钾盐)、磷酸(或其一元或二元钠盐或钾盐)、乙酸、盐酸或硫酸。
8.如权利要求3所述的方法，其中所述分离混合物在AEX色谱之前补充适量的碱性溶液。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述分离混合物在AEX色谱之前补充适量的溶液，所述溶液包含氢氧化钠或氢氧化钾(或其一元或二元钠盐或钾盐)或三(羟甲基)氨基甲烧。
10.能够用于根据权利要求2所述的方法的单一操作单元，其包含阴离子交换色谱部分和阳离子交换色谱部分，所述阴离子交换色谱部分和阳离子交换色谱部分串联连接，其中所述阴离子交换色谱部分的出口与所述阳离子交换色谱部分的入口相连，其中所述单元包括在所述阴离子交换色谱部分的上游端的入口和在所述阳离子交换色谱部分的下游端的出口，并且其中所述单元还包括位于所述阴离子交换色谱部分和所述阳离子交换色谱部分之间的入口。
11.能够用于根据权利要求3所述的方法的单一操作单元，其包含阳离子交换色谱部分和阴离子交换色谱部分，所述阳离子交换色谱部分和阴离子交换色谱部分串联连接，其中所述阳离子交换色谱部分的出口与所述阴离子交换色谱部分的入口相连，其中所述单元包括在所述阳离子交换色谱部分的上游端的入口和在所述阴离子交换色谱部分的下游端的出口，并且其中所述单元还包括 位于所述阳离子交换色谱部分和所述阴离子交换色谱部分之间的入口。
全文摘要
本发明涉及从生物反应器中生产的蛋白质混合物中纯化抗体的方法，该方法至少包含中间纯化步骤和精提纯步骤，其中所述中间步骤和精提纯步骤包括流经模式的以任一顺序联机的阴离子交换色谱(AEX)步骤和阳离子交换色谱(CEX)步骤。本发明还涉及单一操作单元，其包括以任意顺序的阴离子交换色谱部分和阳离子交换色谱部分二者，这两个部分串联连接，其中所述单元包括在所述第一离子交换色谱部分的上游端的入口和在所述第二离子交换色谱部分的下游端的出口，并且其中所述单元还包括位于所述第一离子交换色谱部分和所述第二离子交换色谱部分之间的入口。
文档编号C07K1/18GK103189390SQ201180052246
公开日2013年7月3日 申请日期2011年10月13日 优先权日2010年11月1日
发明者迪德里克·瑞恩德·克里玛, 马里杰克·伊万内·多斯特 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司