专利名称：一种改善缺铁性贫血的产品及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种改善缺铁性贫血的产品及其制备方法。
背景技术：
铁是血红蛋白的重要组成成分，在人 体内起着输送氧气的作用，是人体必需的营养元素之一。机体缺铁会使免疫力下降，并伴有疲倦、易怒、烦躁、记忆力减退等症状。更重要的是机体缺铁会引起缺铁性贫血(Iron deficiency anemia, IDA)。缺铁性贫血(IDA)是全世界发病率最高的营养缺乏性疾病之一。世界50亿人口中约有1/3的人贫血。而IDA或铁营养不良的人群约占5亿。在发展中国家铁缺乏(ID)发生率是发达国家的4倍。我国是世界上缺铁性贫血发生率较高的国家之一，各类人群IDA的平均发生率为15%-20%，其中妇女和儿童发生率高达20%以上。严重的地区儿童IDA发生率高达70%，育龄妇女的IDA发生率高达35%，贫血严重威胁妇女健康。虽然铁在食物中比较常见，但是铁在食物中的形态不利于机体的吸收和利用。目前医疗界普遍用补铁剂对缺铁性贫血的患者进行治疗。目前市场存在的补铁制剂主要有2大类一类是传统的化学合成的铁制剂包括无机铁和有机铁(非血红素铁)；另一类是生物血红素铁。无机铁主要包括亚铁盐类，常用的如硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、富马酸亚铁、乳酸亚铁、琥珀酸亚铁等，这类补铁制剂虽然补铁效果较好，但其生物利用度低、口感较差且长期服用会对胃肠道粘膜刺激大，易引起恶心、胃胀、消化器官障碍、腹泻、便秘等副作用，特别对于胃病患者、孕妇或儿童更是不适用。由于无机铁制剂的不良副作用，人们开始进行新一代的补铁剂研究。20世纪90年代国家疾病预防控制中心成功的开发出新的补铁剂乙二胺四乙酸铁钠，它具有无机铁制剂明显的优势不仅口感好，吸收率高且性质稳定无胃肠道刺激。随后，性质相近、结构类似的有机补铁制剂不断地开发出来，如甘氨酸铁、苏氨酸铁等。但由于氨基酸微量元素配合物生产成本高、制剂价格较为昂贵，目前在我国应用并不广泛。血红素铁(卟啉铁)是目前市场上吸收率最好，生物利用度最高的补铁剂主要是由从家畜合格血液中分离除去血清，所得血球部分再经蛋白酶酶解以除去血球蛋白后所得的富含卟啉的铁蛋白。但是由于其铁含量低，血液来源有限也限制了其广泛应用。目如国内市场上用于药品和食品添加剂中的补铁制剂主要是亚铁制剂，有机补铁制剂虽然吸收率略有提高但仍然不尽人意，且价格昂贵还难以普及。因此，开发出稳定性更好、生物利用度更高、价格低廉的补铁制剂一直是人们研究的焦点。长时期的研究表明，乳铁蛋白(LF)能够促进机体对铁的吸收和利用，维持机体铁代谢平衡。乳铁蛋白是一种分子量SOkD的多功能金属结合蛋白，广泛存在与哺乳动物乳汁和其他多种组织以及其外分泌液中。它能参与多种生理过程，包括宿主防卫、炎症调节、生长刺激以及促进胃肠道对铁的吸收等。乳铁蛋白在结构上和生物化学特征上与转铁蛋白的高度的相似，但它与铁离子的亲和力是转铁蛋白的260倍，并在一个较广的范围内(ΡΗΓ11)保持铁的结合。由于转铁蛋白在胃内极酸性条件下不具有运送铁的功能，因此只有乳铁蛋白能够在动物肠道中运载铁离子。乳铁蛋白能根据机体机体对铁的需求，通过调节肠粘膜细胞对铁的吸收，保持体内的铁平衡。在生理PH值条件下Fe3+不溶于水，很难被生物体所利用。乳铁蛋白能够螯合Fe3+增加其溶解度，I摩尔乳铁蛋白能溶解70摩尔Fe3+远远高于其铁离子结合能力。乳铁蛋白结合Fe3+改变其化学形式促进机体细胞吸收Fe3+。结合铁离子的乳铁蛋白进入小肠后，通过小肠上皮细胞上的受体将铁离子转运到血液中；肠细胞还能直接吸收大量的乳铁蛋白从而获取铁离子。同时，乳铁蛋白还能提高铁的生物利用率，维持机体铁代谢，因而能用于预防和治疗缺铁所导致的贫血性疾病。大 鼠饲喂实验证明乳铁蛋白结合铁能够明显的改善缺铁性贫血且效果远远优于FeSO4和FeCl3,等无机铁离子，不仅提高了铁的生物利用率还避免了无机铁对胃肠道粘膜的损伤。2010年《International Journal ofImmunopathology and Pharmacology (国际免疫病理学和药理学杂志)》报道，意大利研究人员在治疗孕妇缺铁性贫血的临床研究中发现乳铁蛋白提闻血清中铁蛋白、血红蛋白、铁含量要显著强于FeSO4，而且没有明显副作用，进一步证实乳铁蛋白可用于治疗缺铁症和缺铁性贫血。另外，临床研究表明乳铁蛋白还有预防运动性贫血及肌肉疲劳的效果。乳铁蛋白能根据机体对铁的需求，通过调节肠粘膜细胞对铁的吸收，保持体内的铁平衡。乳铁蛋白促进铁吸收的作用主要是通过增加Fe3+的溶解性，且能够特异性结合动物小肠粘膜细胞的乳铁蛋白受体(LFR)，增加铁吸收效率，避免铁离子对动物肠道的直接刺激作用。乳铁蛋白到达肠道以后与LFR识别并结合通过细胞内吞作用浸入细胞并释放Fe3+。细胞对铁的吸收有负反馈调节机制，当细胞内缺铁时，细胞表面的LFR增多，增加LF与其受体的结合的机会。如果细胞内铁含量较高时，细胞表面的LFR表达减少,减少铁元素的摄入。以降低铁离子对机体造成的不良反应。有研究表明乳铁蛋白可以通过调节炎症反应，降低血液中前炎症因子IL-6的表达来调节机体对铁的吸收。综上所述，乳铁蛋白不仅可以增强铁的吸收率而且能降低有效铁的使用量，减少铁对机体的负面影响。因此，乳铁蛋白可以作为一种很好的补铁剂。然而目前利用乳铁蛋白进行补铁制剂的大规模开发还很受限制，这是因为目前市场上存在的都是牛乳铁蛋白(bLF)，牛乳铁蛋白在牛乳中含量极低，生产成本极高且牛乳铁蛋白作为异源蛋白质其在人体内的稳定性和吸收率都不如人乳铁蛋白，因此一直以来大量开发生产人乳铁蛋白就一直成为人们研究的焦点和难点。目前，应用原核及真核表达系统大量生产重组人乳铁蛋白已经进行了许多尝试，然而许多表达系统的表达量及翻译后修饰并不合适，这也就限制了这些重组蛋白的应用。最近，研究者利用体细胞克隆技术成功的获得了人乳铁蛋白转基因克隆牛。重组人乳铁蛋白(rhLF)在乳中具有很高的表达量平均可达2. 5g/L。重组人乳铁蛋白具有与天然人乳铁蛋白相似的生物活性，包括对胰酶的敏感程度，铁结合释放能力以及抗菌活性等。利用这种重组人乳铁蛋白进行补铁剂的开发可以替代牛乳铁蛋白大大节约了成本，而且其能够与人小肠上皮细胞特异性受体结合会大大增强其运铁效果，提高铁的吸收效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种改善缺铁性贫血的产品及其制备方法。本发明的另一目的是提供制备所述改善缺铁性贫血产品的方法。
本发明是利用转基因克隆牛乳中表达的重组人乳铁蛋白为原料进行改善缺铁性贫血产品的开发，提供一种新型的补铁制剂产品一铁饱和重组人乳铁蛋白(FerhLF)。本发明还提供从转基因牛乳中大量纯化重组人乳铁蛋白的方法以及制备一种补铁剂一铁饱和重组人乳铁蛋白的方法。从转基因牛乳中大量纯化重组人乳铁蛋白的方法包括表达重组人乳铁蛋白的转基因牛的制备、牛乳脱脂、过滤除菌、离子交换 层析分离纯化脱脂乳中的重组人乳铁蛋白。具体包括如下步骤I)转基因牛的制备。包括如下步骤i)利用含有完整人乳铁蛋白基因的hLF BAC DNA作为乳腺特异表达载体；ii)将hLF BAC DNA与双标记选择载体pEGFP_NE0或单标记选择载体pNEO按比例混合，导入家畜体细胞核内，进行细胞转染，获得转入hLF BAC DNA的转基因细胞；iii)细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得转有hLF BAC DNA的转基因牛；2)将由上述转基因牛产生的rhLF牛乳加热到40_45°C后进行乳脂分离，以65_75转/分钟连续脱脂两次；然后利用孔径为I. 4 μ m的滤膜对脱脂牛乳进行微滤除菌；3)利用BPG140/500层析柱，以SP Sepharose Big Beads作为柱填料进行阳离子交换层析，用PH值6. 5的PBS液进行洗脱，收集合并具有同一 rhLF活性洗脱峰峰值的洗脱液；4)对洗脱液进行超滤浓缩及冷冻干燥，即得重组人乳铁蛋白粉末。前述方法中，步骤3)中优选用含O. 4M似(1，？!1值6.5的201111 PBS进行预洗脱去除杂蛋白，然后用含IM NaCl，pH值6. 5的20mM PBS进行洗脱，收集合并具有同一 rhLF活性洗脱峰峰值的洗脱液。前述方法中，步骤4)中所述超滤具体为将步骤3)中得到的具有同一 rhLF活性洗脱峰峰值的洗脱液，经蠕动泵泵入超滤膜进行超滤浓缩，加入pH值6. O的20mM磷酸盐缓冲液，循环7次，直至浓缩液出口电导率低于lmS/cm，再将溶液进一步进行浓缩。制备所述改善缺铁性贫血产品的方法为利用转基因克隆牛乳表达的重组人乳铁蛋白(rhLF，氨基酸序列如Seq ID No. I所示)与Fe3+在NaHCO3溶液(或KHCO3溶液)中进行螯合。具体地，其是将重组人乳铁蛋白溶于水配制成溶液，然后将该溶液与FeCl3溶液以及NaHCO3或KHCO3溶液混合，搅拌后制成铁饱和重组人乳铁蛋白溶液，随后经过脱盐与冻干后即得铁饱和重组人乳铁蛋白(FerhLF)粉末，其中铁含量为6. 62mg/g。本发明首次尝试利用转基因克隆牛乳表达的重组人乳铁蛋白进行补铁产品的开发。利用这种新的补铁制剂，大大增强了改善缺铁性贫血的效果，显著的提高了缺铁性贫血大鼠的血红蛋白浓度，其恢复效果远比阳性对照(FeSO4)组迅速且没有明显的不良反应，使用安全，效果明显，制备方法简单。
图I为本发明rhLF中试纯化SP Sepharose Big Beads层析效果图。图2为本发明SDS-PAGE电泳检测rhLF纯度结果。图3为本发明连续进行8次纯化的rhLF SDS-PAGE电泳检测结果。图4为本发明利用高效凝胶过滤比较分析rhLF与hLF。
图5为本发明利用圆二色谱比较rhLF与hLF 二级结构。图6为本发明利用FerhLF进行大鼠贫血恢复实验中的血常规检测结果，A为血红蛋白浓度，B为红细胞个数，C为红细胞压积，D为红细胞平均血红蛋白含量，不同小写字母标识标识组间有显著差异。图7为本发明利用FerhLF进行大鼠 贫血恢复实验中的其他指标分析结果，A为红细胞平均容量，B为肝铁，C为脾铁，不同小写字母标识组间有显著差异。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。以下实施例使用的试剂及其来源Na2HPO4 · 12H20、NaH2PO4 · 2H20、Na0H、95% 乙醇、NaCl、Fes04FeCl3、NaHCO3 均为国产分析纯，购自北京化学试剂公司。其他试剂均为国产分析纯。天然人乳铁蛋白(hLF)购自sigma公司。牛乳铁蛋白购自新西兰Tatua公司(蛋白含量90%其中乳铁蛋白含量95%)。牛乳铁蛋白去内毒素购自比利时NFQ公司。所用仪器如下陶瓷膜超滤系统，陶普森螺动泵(Easyload Masterflex), Millpore层析柱(BPG140/500)，GEHealthcare层析介质(SPSepharose Big Beads), GE Healthcare层析系统(AKTAPilot), GE Healthcare乳脂分离机(>Κ5-Π Ji a B a-100)，俄罗斯超滤浓缩系统，Millpore全自动血细胞分析仪，MEK-6318k圆二色光谱仪为Jasco810 (Jasco,日本)。缓冲溶液配制I) PBS储液配制储液I =Na2HPO4 · 12H20(O. 2M, Mw :358. 14，16L):称取 1146g Na2HPO4. 12H20 倒入20L容器中，加入去离子水16L，搅拌备用。储液2 =NaH2PO4 · 2H20 (O. 2M, Mw :156. 01，18L):称取 561. 636g NaH2PO4. 2H20 倒入20L容器中，加入去离子水18L，搅拌备用。2)层析缓冲液配制Buffer A(IOOL):使用量筒分别量取8. 77L储液2和I. 23L0. 2M储液I于100L容器中，即为IOXBufferA备用。临用前加入去离子水90L，搅拌溶解完全后用IM NaOH (或IM HCl)调pH值至6. 5，存储于两个50L PP桶中备用。Buffer B (50L):使用量筒分别量取O. 265L储液2和4. 735L储液I于100L容器中，同时称取NaC12922g，即为10XBufferB，0. 45 μ m滤膜微滤备用；临用前加入去离子水45L，搅拌溶解完全后用IM NaOH (或IM HCl)调pH值至6. 5，存储于50L PP桶中备用。3)超滤缓冲溶液配制
Buffer A(50L):使用量筒分别量取4. 385L储液2和O. 615L0. 2 M储液I于100L容器中，即为lOXBufferA。加入去离子水45L，搅拌溶解完全后用IM NaOH (或IM HCl)调pH值至6. 5，存储于50L PP桶中备用。实施例I表达重组人乳铁蛋白的转基因牛的制备根据CN1873001 (发明名称转人乳铁蛋 白基因的转基因克隆大型家畜的生产方法)中公开的方法制备重组人乳铁蛋白转基因牛。操作步骤如下(I)利用含有完整人乳铁蛋白基因的hLF BAC DNA作为乳腺特异表达载体；(2)将hLF BAC DNA与双标记选择载体pEGFP-NEO或单标记选择载体pNEO按比例混合，导入家畜体细胞核内，进行细胞转染，获得转入hLF BAC DNA的转基因细胞；(3)细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得转有hLF BACDNA的转基因牛。所述重组人乳铁蛋白(rhLF)的氨基酸序列如Seq ID No. I所示。实施例2重组人乳铁蛋白的中试纯化及质量控制I. I制备rhLF牛乳脱脂乳将由实施例I中的转基因牛产生的rhLF牛乳加热到40_45°C，将牛乳排进乳脂分离机调整转数为65-75转/分钟。每批次牛乳连续脱脂两次，以充分去除脂肪。I. 2陶瓷膜过滤除菌利用陶瓷膜(孔径I. 4 μ m)对脱脂牛乳进行超滤，因细菌大小在0_5 μ m左右，可以达到冷除菌的效果。实验操作如表I所示。表I利用陶瓷膜过滤除菌的操作步骤
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加奶超滤，皆_-为I.miJmm;
0360.12010530
3151-/1112..
m: (O—5 , O.KM NaOII) ISL0280,100,22550'
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_用水冲洗2-3次_
碱洗-次 11%, I Mi NaOI I) I5L 左
0360J4OJ5齡
右 HO ..C
0,30om0.16555醆洗 0。5 % 硝酸 15L 左右
水冼两次PH中性水通量12L/min，
0,380.Bail530
2057 L/ni2/hI. 3从脱脂乳中分离纯化rhLFI. 3. I缓冲液配制(I)PBS储液配制
储液I =Na2HPO4. 12H20 (O. 2M, Mw :358. 14，16L):称取 1146gNa2HP04. 12H20 倒入 20L容器中，加入去离子水16L，搅拌备用。储液2 =NaH2PO4. 2H20 (O. 2M,Mw :156. 01，18L):称取 561. 636gNaH2P04. 2H20 倒入 20L容器中，加入去离子水18L，搅拌备用。(2)缓冲液A和B的配制Buffer A(IOOL):使用量筒分别量取8. 77L储液2和I. 23L0. 2M储液I于100L容器中，即为IOXBuffer A，备用。使用前加入去离子水90L，搅拌溶解完全后用IM NaOH(或IM HCl)调pH值至6. 5，存储于两个50L PP桶备用。Buffer B (50L):使用量筒分别量取O. 265L储液2和4. 735L储液I于100L容器中，同时称取NaC12922g，即为IOXBuffer B，O. 45 μ m滤膜微滤后备用；使用前加入去离子水45L，搅拌溶解完全后用IMNaOH (或IM HCl)调pH值至6. 5，存储于50L PP桶备用。I. 3. 2装层析柱(I)将离子交换介质SP Sepharose Big Beads (新介质,保存于20%乙醇中)摇勻后备用;(2)取BPG140/500层析柱，清洗干净后垂直放置，排空出口端adapter的气泡后将其接到层析柱上，添加约Icm高度的超纯水，然后由玻璃棒将搅拌均匀的离子交换介质缓慢引入层析柱中，接着将已排出气泡的入口端的adapter连接到层析柱上；(3)层析柱安装完毕后通过常压层析系统先用超纯水冲洗(冲洗掉保存介质的乙醇)5个柱体积(流速lL/min)，然后再用2个柱体积的BufTerA (平衡缓冲液)平衡层析柱至层析柱出口液体PH平衡；(4)最后降低入口端adapter至介质表面,注意排空气泡。记录最终层析柱高度，柱床体积控制在3L左右。I. 3. 3离子交换层析层析柱型号BPG140/500层析介质SP Sepharose Big Beads 柱高20cm ;柱体积3L ;层析系统=AKTA Pilot ;总时间:304min。平行上样8次。(表2)表2离子交换层析的洗脱步骤
权利要求
1.一种改善缺铁性贫血的产品，其特征在于，其为铁饱和重组人乳铁蛋白。
2.制备权利要求5所述改善缺铁性贫血产品的方法，其特征在于，使重组人乳铁蛋白与Fe3+在NaHCO3或KHCO3溶液中进行螯合；其中，所述重组人乳铁蛋白的氨基酸序列如SeqID No. I 所示。
3.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，其是将重组人乳铁蛋白粉末溶于水配制成溶液，然后将该溶液与FeCl3溶液以及NaHCO3或KHCO3溶液混合，搅拌后制成铁饱和重组人乳铁蛋白溶液，随后经过脱盐与冻干后即得铁饱和重组人乳铁蛋白粉末。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组人乳铁蛋白粉末的制备包括如下步骤 I)转基因牛的制备。包括如下步骤 1)利用含有完整人乳铁蛋白基因的hLFBAC DNA作为乳腺特异表达载体； ii)将hLFBAC DNA与双标记选择载体pEGFP-NEO或单标记选择载体pNEO按比例混合，导入家畜体细胞核内，进行细胞转染，获得转入hLF BAC DNA的转基因细胞； iii)细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得转有hLFBAC DNA的转基因牛； 2)将由上述转基因牛产生的rhLF牛乳加热到40-45°C后进行乳脂分离，以65-75转/分钟连续脱脂两次；然后利用孔径为I. 4 μ m的滤膜对脱脂牛乳进行微滤除菌； 3)利用BPG140/500层析柱，以SPSepharose Big Beads作为柱填料进行阳离子交换层析，用PH值6. 5的PBS液进行洗脱，收集合并具有同一 rhLF活性洗脱峰峰值的洗脱液； 4)对洗脱液进行超滤浓缩及冷冻干燥，即得重组人乳铁蛋白粉末。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中用含0.4MNaCl，pH值6.5的20mM PBS进行预洗脱去除杂蛋白，然后用含IMNaCl，pH值6. 5的20mM PBS进行洗脱，收集合并具有同一 rhLF活性洗脱峰峰值的洗脱液。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述超滤具体为将步骤3)中得到的具有同一 rhLF活性洗脱峰峰值的洗脱液，经蠕动泵泵入超滤膜进行超滤浓缩，加入pH值6. O的20mM磷酸盐缓冲液，循环7次，直至浓缩液出口电导率低于lmS/cm，再将溶液进一步进行浓缩。
全文摘要
本发明提供了一种从转基因克隆牛乳中大量纯化重组人乳铁蛋白的方法，同时提供了一种利用纯化出的重组人乳铁蛋白为原料进行改善缺铁性贫血产品的开发，提供一种新型的补铁制剂产品--铁饱和重组人乳铁蛋白(FerhLF)。利用这种新的补铁制剂，大大增强了改善缺铁性贫血的效果，显著的提高了缺铁性贫血大鼠的血红蛋白浓度，且没有明显的不良反应，使用安全，效果明显，制备方法简单。
文档编号C07K14/79GK102766206SQ20121022784
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月2日 优先权日2012年7月2日
发明者于添 申请人:北京济福霖生物技术有限公司