专利名称：一种从缬氨酸发酵液中分离杂酸的方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵行业缬氨酸提取工艺领域，具体提供一种从缬氨酸发酵液中分离杂酸的方法。
背景技术：
L-缬氨酸，学名:2_氨基-3-甲基丁酸，一种含有五个碳原子的支链非极性a氨基酸。L-缬氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸中的一种，同样，也是人体八种必须氨基酸之一，与L-亮氨酸、L-异亮氨酸统称为支链氨基酸。是哺乳动物的必需氨基酸和生糖氨基酸。L-缬氨酸可用于配制复合氨基酸输液，可用于治疗营养不良症，对外伤、烫伤、手术等病人的恢复具有显著效果。此外，在饲料中L-缬氨酸和L-异亮氨酸均是限制性氨基酸，在人体消耗量较大时将成为人体所限制性氨基酸。目前，L-缬氨酸基本提取方法有沉淀法、离子交换法以及全膜法。其中沉淀法是根据沉淀剂与L-缬氨酸的特异性结合形成沉淀，然后分离提取，该方法具有操作简单、提取产品纯度高等优点，其缺点在于沉淀剂是一种苯类物质具有致癌性，易于在产品中残留，而且操作过程中是强酸性提取，具有安全隐患，同时，其污水处理困难，一般的厌氧好氧污泥几乎无法处理，存在环境污染重的技术问题；全膜法虽然废水量少，但是无法分离与缬氨酸分子量相接近的杂酸，导致提取出的产品杂酸高，只能靠连续重复结晶来提取高纯度的缬氨酸。离子交换树脂加膜过滤提取法解决了产品纯度、收率低、污水难处理等问题，也是氨基酸提取常用的一种方法。离子交换法加膜滤提取法是将陶瓷膜除菌后的滤清液下调PH值至2 4.5，用强酸树脂将氨基酸和阳离子吸附，废液排出至污水处理，最后用氨水将吸附的氨基酸洗脱下来，但是洗 脱液中的阳离子与氨基酸无法有效的分离，致使缬氨酸的纯度太低。另一方面缬氨酸提取母液中含有的大量菌体，它是一种单细胞蛋白，含有丰富的蛋白质，对干燥后菌体蛋白的化学成分进行分析发现缬氨酸废弃菌体中蛋白质的含量高达80%以上。其氨基酸种类和配比都比较齐全，并且含有丰富的维生素、核酸、多糖等其他营养物质。这些有用物质白白排放，造成大量的损失。因此，研究一种系统的缬氨酸发酵液提取方法，以增加缬氨酸纯度，并减少废水污染、变废为宝，是本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种从L-缬氨酸发酵液中在离子交换树脂中提取高纯度L-缬氨酸的方法，使得该方法一次性去除发酵液中其他的杂酸及部分杂质。本发明的另一目的是酶解利用菌体浓浆蛋白，减少废水污染、变废为宝。以下除非特殊说明，单位为质量分数；一种从缬氨酸发酵液中分离杂酸的方法，包括以下步骤:I)将发酵结束的L-缬氨酸发酵液经高速碟片分离机将缬氨酸母液中的菌体蛋白分离，高速碟片机分离菌体的转速约为4000 5000r/min，回收菌体蛋白沉淀，并收集上清液。2)膜过滤二次去除菌体蛋白:将步骤I)获得的上清液采用陶瓷膜过滤，膜孔径60nm,过滤回收菌体蛋白，并收集滤液。3)将步骤2)获得的滤液利用离子交换法提取缬氨酸:①调节PH值为4.5，然后(以每小时树脂体积的2.0倍速)通入强酸离子交换树脂柱(1LC100阳离子交换树脂)，进行离子交换，三柱串联离子交换，所述强酸离子交换树脂柱是三个强酸离子交换树脂柱通过管道和阀门串联在一起。并且每一个强酸离子交换树脂柱底部都有一个收料阀门。氨基酸将根据离子交换树脂对各种氨基酸的交换吸附能力不同的规律，其等电点PH值越大交换吸附能力越强的特性。发酵液中的杂氨基酸与缬氨酸根据各个氨基酸的等电点依次吸附在树脂中。②滤清液按照流速为树脂体积的2.0倍速从树脂柱上部进入，下部排出。当下排液遇茚三酮显色时，将下排液串入第二个柱，当第二个柱显色时将第二柱的下排液串入第三个柱。③当第三柱显色时再继续外排连续2 3.5小时，此时排出的显色液为谷氨酸、丙氨酸为主，此时能去除发酵液中总杂酸的35% 50%左右。④排完2 3.5小时后，停止第一柱的进料，用纯水从第一柱到第三柱串洗至前流罐内再重新吸附用。⑤当用纯水冲洗结束时，将配制好的0.5% 2% (质量分数)氨水，流速按照树脂体积的0.5 I倍速将树脂所吸附的氨基酸解析下来，解析过程中当柱下液PH值达到6 7.5时，关闭收料阀门打开串柱阀门，串洗下一柱子，以此类推当第三个柱子柱下液PH到达6 7.5时继续洗脱，不再串柱，当PH值达到7.5 9.5时，开始外排尾液2 3.5小时，停止洗脱。用空气从第一个柱子到第三个柱子将柱内的氨水压回后流罐。这样三柱串联洗脱能有效的杂酸，其中包括有大量的赖氨酸、精氨酸等其它氨基酸。⑥将离交柱内洗脱的料液浓缩(可以浓缩缬氨酸质量浓度为8%。)；⑦浓缩后的料液经添加2% 6% (质量分数)的活性炭升温至55°C 70°C，调节料液PH值在3 5.5，脱色20 50分钟，然后经精密过滤机将活性炭及杂质过滤。⑧脱色后的料液经浓缩结晶，至浓缩后体积为浓缩前体积的1/6，然后降温结晶，当温度降至15°C 25°C时，离心机高速离心，得湿粗品，其水分含量在15% 25%。⑨粗品按照4% 7.5% (质量分数)的浓度投入脱色罐内脱色、然后浓缩、结晶、离心、干燥、粉碎得到精制成品。成品的含量为99.0%以上，能达到医药级水平。4)合并步骤I)和步骤2)菌体蛋白，制备饲料:①在合并的菌体蛋白中加入等质量的豆渣，用IM的NaOH调节pH值13，缓慢加热至80°C，然后搅拌水解30分钟，最后加IM的盐酸调pH至7.0-7.5 ；②添加玉米粉、鱼骨粉、酒糟，边添加边搅拌至糊状；最后通入蒸汽升温至105°C，蒸馏10分钟；其中玉米粉、鱼骨粉、酒糟以及步骤①的豆渣的质量比例为5:2:4:7;③将步骤②获得的蒸馏物烘干、粉碎后，添加复合菌剂，混合均匀，获得粉状营养饲料；复合菌剂由嗜酸乳酸杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、酵母菌按照3: I: 2: I的质量比混合而成；其中复合菌以及豆渣的质量比例为 1: 100。
所述嗜酸乳酸杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、酵母菌按照常规培养发酵，将制备的液体菌液与硅藻土以质量比2:I制成复合菌剂。本发明取得的有益效果:采用一般的过滤方法去除菌体，由于菌体细小，通常菌体去除不够彻底，影响后续离子交换工艺，本发明首先使用高速碟片分离机和膜过滤将母液中的苏氨酸料液和菌体蛋白进行分离，收集发酵菌体，高速碟片机分离菌体的转速为4000 5000r/min,通过以上条件，高效便捷地将缬氨酸母液中的菌体蛋白分离，碟片式分离机是沉降式离心机中的一种，用于分离难分离的物料，其对菌体蛋白的提取率达到98 %左右，具备操作便捷的优点，更适于大规模工业化生产。与本发明的产品收率和纯度相比，传统工艺提取的L-缬氨酸均不高，且色泽不如本发明所述方法提取L-缬氨酸洁白透亮，这是由于其中含有杂氨基酸所导致。缬氨酸提取采用本发明生产工艺后，避免了为提高缬氨酸的纯度而重复地结晶和离交。其缩短了提取高纯度缬氨酸的时间，经济效益明显。且在本发明中，缬氨酸无机酸盐经过离子交换得到符合《中国药典，2005》的医药级产品；缬氨酸无机酸盐母液含有其他氨基酸，经过离子交换得到符合FCCIV、USP24(美国药典24版)的食品级产品；采用本发明，发酵液中的缬氨酸总提取收率达99%以上，减少损失，从而降低了生产成本。本申请公开了缬氨酸提取的一系列完整步骤，其优化了产品结构又规范了生产流程。吸附过程产生的废水为稀酸或无机盐溶液，回收供树脂再生时使用，极大的减少了树脂再生对无机酸或无机盐的消耗。且本发明离子交换过程废水产生总量不及传统工艺二分之一，降低了企业的环保压力。本申请无需加入絮凝剂等化学试剂，避免了絮凝剂单体存在的饲料安全隐患，饲料制备过程中，对菌体蛋白进行一定的水解，水解后的小分子蛋白更有利于动物吸收；饲料加入玉米、鱼骨粉 、酒糟后，进行高温蒸馏，灭菌的同时祛除异味，获得的饲料口味纯正，气味香甜，富含多种发酵氨基酸。本发明人通过创造性劳动及多因子实验对复合菌剂、添加量、温度等进行大量实验，得出最佳的复合菌剂反应参数体系，确定最佳复合菌剂组合以及最佳质量比，为乳酸杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、酵母菌按照3: I: 2: 1，本领域技术人员知晓，复合菌剂为有机整体，菌剂中各种菌株之间可能存在互相拮抗或者互相促进的作用，各菌种在功能上具有相互作用，总的技术效果不是各部分效果的简单的总和。同一种微生物菌剂在不同的发酵过程中所表现的互相拮抗或者互相促进的作用也有可能不一样，通过其协同作用，可以产生辅助母猪消化的各种消化酶，改善母猪胃肠环境，抑制有害菌生长，并且有效分解饲料中的抗营养因子，释放营养物质，使其能被充分消化吸收，提高饲料的利用率，改善母猪的生产性能。促进有益厌氧微生物的生长繁殖，维持肠道生态平衡，提高采食量、产乳量，降低料肉比，有效防治母猪便秘，腹泻，下痢，消化不良，有效率高达85%;且能够以菌治菌，拮抗致病微生物，增强免疫功能，提高母猪的抗应激能力，促进肠道发育，增强消化酶的活性，提高饲料利用率。
:图1是本发明从缬氨酸发酵液中分离杂酸的提取工艺流程图。其中I为阀门。
具体实施方式
:—种从缬氨酸发酵液中分离杂酸的方法，包括以下步骤:I)将发酵结束的L-缬氨酸发酵液经高速碟片分离机将缬氨酸母液中的菌体蛋白分离，高速碟片机分离菌体的转速约为4000 5000r/min，回收菌体蛋白沉淀，并收集上清液。2)膜过滤二次去除菌体蛋白:将步骤I)获得的上清液采用陶瓷膜过滤，膜孔径60nm,过滤回收菌体蛋白，并收集滤液。3)将步骤2)获得的滤液利用离子交换法提取缬氨酸:①调节PH值为4.5，然后(以每小时树脂体积的2.0倍速)通入强酸离子交换树脂柱(1L ClOO阳离子交换树脂)，进行离子交换，三柱串联离子交换，所述强酸离子交换树脂柱是三个强酸离子交换树脂柱通过管道和阀门串联在一起。并且每一个强酸离子交换树脂柱底部都有一个收料阀门。氨基酸将根据离子交换树脂对各种氨基酸的交换吸附能力不同的规律，其等电点PH值越大交换吸附能力越强的特性。发酵液中的杂氨基酸与缬氨酸根据各个氨基酸的等电点依次吸附在树脂中。②滤清液按照流速为树脂体积的2.0倍速从树脂柱上部进入，下部排出。当下排液遇茚三酮显色时，将下排液串入第二个柱，当第二个柱显色时将第二柱的下排液串入第三个柱。③当第三柱显 色时再继续外排连续2 3.5小时，此时排出的显色液为谷氨酸、丙氨酸为主，此时能去除发酵液中总杂酸的35% 50%左右。④排完2 3.5小时后，停止第一柱的进料，用纯水从第一柱到第三柱串洗至前流罐内再重新吸附用。⑤当用纯水冲洗结束时，将配制好的2% (质量分数)氨水，流速按照树脂体积的
0.5 I倍速将树脂所吸附的氨基酸解析下来，解析过程中当柱下液PH值达到6 7.5时，关闭收料阀门打开串柱阀门，串洗下一柱子，以此类推当第三个柱子柱下液PH到达6 7.5时继续洗脱，不再串柱，当PH值达到7.5 9.5时，开始外排尾液2 3.5小时，停止洗脱。用空气从第一个柱子到第三个柱子将柱内的氨水压回后流罐。这样三柱串联洗脱能有效的杂酸，其中包括有大量的赖氨酸、精氨酸等其它氨基酸。⑥将离交柱内洗脱的料液浓缩，可以浓缩缬氨酸质量浓度为8%。；⑦浓缩后的料液经添加2 % 6 %的活性炭升温至70 V，调节料液PH值在5.5，脱色20 50分钟，然后经精密过滤机将活性炭及杂质过滤。⑧脱色后的料液经浓缩结晶，至浓缩后体积为浓缩前体积的1/6，然后降温结晶，当温度降至15°C 25°C时，离心机高速离心，得湿粗品，其水分含量在15% 25%。⑨粗品按照4% (质量分数)的浓度投入脱色罐内脱色、然后浓缩、结晶、离心、干燥、粉碎得到精制成品。成品的含量为99.0%以上，能达到医药级水平。4)合并步骤I)和步骤2)菌体蛋白，制备饲料:①在合并的菌体蛋白中加入等质量的豆渣，用IM的NaOH调节pH值13，缓慢加热至80°C，然后搅拌水解30分钟，最后加IM的盐酸调pH至7.0-7.5 ；
②添加玉米粉、鱼骨粉、酒糟，边添加边搅拌至糊状；最后通入蒸汽升温至105°C，蒸馏10分钟；其中玉米粉、鱼骨粉、酒糟以及步骤①的豆渣的质量比例为5:2:4:7;③将步骤②获得的蒸馏物烘干、粉碎后，添加复合菌剂，混合均匀，获得粉状营养饲料；复合菌剂由嗜酸乳酸杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、酵母菌按照3: I: 2: I的质量比混合而成；其中复合菌剂以及豆渣的质量比例为1: 100。所述嗜酸乳酸杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、酵母菌分别按照常规一级斜面培养，二级种子培养等制备发酵液中活菌数达到IO8个/克即可，将制备的液体菌液与硅藻土以质量比2: I制成复合菌剂。缬氨酸提取采用本发明生产工艺后，避免了为提高缬氨酸的纯度而重复地结晶和离交。其缩短了提取高纯度缬氨酸的时间，经济效益明显。经检测，获得的缬氨酸经HPLC检测，纯度为99.0%，且外观洁白透亮，杂氨基酸按量仅为1%，经检测符合FCCIV、USP24(美国药典24版)标准要求，达到医药级产品的要求。制备的营养饲料蛋白含量51.3%,L-缬氨酸含量5.7%，其余为淀粉、糖类物质及少量其它氨基酸类。实施例2实施例1制备的饲料的养殖试验选取一个月大的断奶仔猪150头，平均分为两个组别，其中实验组用本发明制备的饲料饲养，每50kg约200元，对照组用正大饲料(SSB-25型号)，按照每50kg约300元计算。饲养30天之后检测各项指标参见表I。
表I
权利要求
1.一种从缬氨酸发酵液中分离杂酸的方法，包括以下步骤: 1)将发酵结束的L-缬氨酸发酵液经高速碟片分离机将缬氨酸母液中的菌体蛋白分离，高速碟片机分离菌体的转速约为4000 5000r/min，回收菌体蛋白沉淀，并收集上清液； 2)膜过滤二次去除菌体蛋白，将步骤I)获得的上清液采用陶瓷膜过滤，膜孔径60nm，过滤回收菌体蛋白，并收集滤液。
3)将步骤2)获得的滤液，利用离子交换法提取缬氨酸: ①调节PH值为4.5，通入强酸离子交换树脂柱进行离子交换； ②稀氨水洗脱:2%氨水将树脂所吸附的氨基酸解析下来； ③洗脱的料液浓缩，添加2%的活性炭升温至55°C 70°C，调节料液PH值在3 5.5，脱色30分钟，脱色后的料液经浓缩结晶，浓缩后体积为浓缩前体积的1/6，然后降温结晶，当温度降至15°C 25°C时，离心机高速离心，得湿粗品； ④湿粗品加水溶解成质量比为4% 7.5%的浓度，投入脱色罐内脱色、然后浓缩、结晶、离心、干燥、粉碎得到精制成品。
4)合并步骤I)和步骤2)菌体蛋白，制备饲料: ①在合并的菌体蛋白中加入等质量的豆渣，用IM的NaOH调节pH值13，缓慢加热至80 0C，然后搅拌水解30分钟，最后加IM的盐酸调pH至7.0-7.5 ； ②添加玉米粉、鱼骨粉、酒糟，边添加边搅拌至糊状；最后通入蒸汽升温至105°C，蒸馏10分钟；其中玉米粉、鱼骨粉、酒糟以及步骤①的豆渣的质量比例为5:2:4:7; ③将步骤②获得的蒸馏物烘干、粉碎后，添加复合菌，混合均匀，获得粉状营养饲料；复合菌由嗜酸乳酸杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、酵母菌按照3: I: 2: I的质量比混合而成；其中复合菌剂以及豆渣的质量比例为1: 100。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤3)离子交换法提取缬氨酸步骤①中强酸离子交换树脂柱为三个强酸离子交换树脂通过管道和阀门串联在一起，并且每一个强酸离子交换树脂柱底部都有一个收料阀门，当树脂柱下排液遇茚三酮显色时，将下排液串入第二个柱，当第二个柱显色时将第二柱的下排液串入第三个柱，所述强酸离子交换树脂柱为732强酸性阳离子树脂或ClOO阳离子交换树脂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性炭为药用粉状活性炭。
全文摘要
本发明涉及一种从缬氨酸发酵液中分离杂酸的方法，其包括，1)将发酵结束的L-缬氨酸发酵液经高速碟片分离机将缬氨酸母液中的菌体蛋白分离，高速碟片机分离菌体的转速为4000～5000r/min，回收菌体蛋白沉淀，并收集上清液；2)膜过滤二次去除菌体蛋白将步骤1)获得的上清液采用陶瓷膜过滤，膜孔径60nm，过滤回收菌体蛋白，并收集滤液；3)合并步骤1)和步骤2)中的上清液及滤液，利用离子交换法提取缬氨酸；4)合并步骤1)和步骤2)菌体蛋白，制备饲料，其具有广阔的应用前景。
文档编号C07C229/08GK103232354SQ20131015927
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月26日 优先权日2013年4月26日
发明者潘悦洪, 郭英熙, 马杰希, 潘保林, 肖勇, 邱玲, 田廷松 申请人:新疆阜丰生物科技有限公司