一种碳-13同位素标记的溴化膦化合物及制备方法和应用的制作方法【专利摘要】本发明涉及一种结构式(I)的碳-13同位素标记的溴化膦化合物及其制备方法和应用。本发明所述的碳-13同位素标记的溴化膦化合物(C13-TMPP-Ac-OSu)与C12-TMPP-Ac-OSu配合使用，通过质谱分析在从头测序鉴定多肽的同时，利用含有两种不同标记物的同一多肽在质谱中出现的2个信号峰强度进行定量分析，从而实现多肽的从头测序与蛋白质定量分析的同步进行，其分析方法简单，稳定性好，精确度高。【专利说明】—种碳-13同位素标记的溴化膦化合物及制备方法和应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种碳-13同位素标记的溴化膦化合物及制备方法和蛋白质定量应用，属于蛋白质结构分析领域。【
背景技术：
】[0002]基于现代生物质谱的蛋白质定量分析技术已经成为目前蛋白质组学研究必不可少的重要工具，可闻效测定细胞内蛋白质组的动态变化、研究蛋白质功能、揭不细胞生物机理、寻找疾病蛋白标记物和药物靶标。近年来各种基于质谱的蛋白质定量策略和方法层出不穷，如双向凝胶电泳定量方法(twodimensionalelectrophoresis,2-DE)、体内同位素代谢标记法(stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture,SILAC)、同位素化学标记法(isobarictagsforrelativeandabsolutequantification,iTRAQ)>同位素标签标记定量法(isotopecodedaffinitytag,ICAT)等。基于质谱的同位素标记定量方法是目前蛋白质质谱定量分析的重要方法，其核心是轻同位素试剂(如C12和N14)和重同位素试剂(如C13和N15)分别化学性标记从不同疾病及其对照组蛋白质酶切消化的肽段N末端，轻重标记的2种样品同比例混合后，使用LC-MS/MS分析，同时定量并鉴定所有的肽段.[0003]但是，这些基于质谱的蛋白质稳定同位素标记定量分析方法都是针对现有的蛋白质序列数据库进行后续的蛋白质鉴定和定量，对于很多基因组未测序的物种的蛋白质鉴定及定量分析无能为力。[0004]多肽从头测序方法(peptidedenovosequencing)能解决现有基于质谱的多肽序列分析方法主要依赖已有的蛋白质序列数据库，对于数据库中不存在的蛋白序列鉴定无能为力的问题，在近年来逐渐受到人们重视。目前已有文献报道《High-confidencedenovopeptidesequencingusingpositivechargederivatizationandtandemMSspectramerging.》(AnM,ZouX，WangQ,ZhaoX，WuJ,XuLM,ShenHY,XiaoX,HeD,JiJ.AnalChem.2013May7；85(9):4530-7.),((Efficientandcleanchargederivatizationofpeptidesforanalysisbymassspectrometry.》(AnM,DaiJ,WangQ,TongY,JiJ.RapidCommunMassSpectrom.2010Jull5；24(13):1869-74.)使用(N_玻拍酸亚胺基氧代羰基甲基)三(2，4，6-三甲氧苯基)溴化膦((N-Succinimidyloxycarbonylmethyl)tris(2,4,6-trimethoxyphenyl)phosphoniumbromide,TMPP-Ac-OSu)专一地对蛋白质N端进行化学标记，结合质谱检测分析实现多肽序列的从头测序，达到精确和高可信度鉴定蛋白的目的。而且，TMPP-Ac-OSu对多肽N端的特异标记能简化质谱MS/MS串联谱图，在基因组未测序种属中蛋白质的从头测序方面具有重要应用。[0005]但是，目前商品化的TMPP-Ac-OSu试剂为C12标记(C12-TMPP-Ac_0Su)，基于此标记试剂的质谱分析仅能获得高可信度的从头测序鉴定，不能同时进行蛋白质定量比较分析。[0006]因此，开发一种在多肽从头测序的同时实现蛋白质定量的方法能很好填补这一缺陷，在蛋白质序列鉴定和定量分析领域具有十分重要的意义。【
发明内容】[0007]为了克服上述技术缺陷，本发明提供了一种碳-13同位素标记的溴化膦化合物(C13-TMPP-Ac-0Su)，将其标记的多肽与商品化C12_TMPP-Ac-0Su标记的多肽按照同比例混合后，通过质谱分析可在从头测序鉴定该多肽的同时，对多肽蛋白质进行定量分析，从而同时实现多肽的从头测序和其蛋白质定量。[0008]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:[0009]一种碳-13同位素标记的溴化膦化合物，结构式⑴如下:[0010]【权利要求】1.一种碳-13同位素标记的溴化膦化合物，其特征在于，结构式(I)如下:2.一种溴化膦化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:1)在无水丙酮中，间苯三酚与13C标记的硫酸二甲酯在催化剂无水碳酸钾作用下回流反应，生成(I'，1"Λ"'-13C3)-1，3，5-三甲氧苯；2)无水无氧条件下，(I'Λ"Λ"'-13C3)-1，3，5-三甲氧苯与重蒸过的三氯化磷在无水氯化锌作用下回流反应，生成三[(P，1"Λ"'-13C3)-2，4，6-三甲氧苯基]膦；3)在无水二氯甲烷冰浴中，溴乙酰溴与N-羟基琥珀酰亚胺在吡啶作用下，生成溴乙酸-N-琥珀酰亚胺酯；4)溴乙酸-N-琥珀酰亚胺酯与三[(I'，1",I"'-13C3)-2，4，6-三甲氧苯基]膦反应得到式(I)结构的目标产物。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤I)中，所述13C标记的硫酸二甲酯需每隔10-15分钟加入其总用量的1/4。4.一种蛋白质定量分析试剂，其特征在于，由权利要求1所述的结构式(I)溴化膦化合物制得。5.权利要求4所述蛋白质定量分析试剂在多肽从头测序及蛋白质定量分析中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述多肽从头测序及蛋白质定量分析方法包括如下步骤:1)蛋白酶解；2)TMPP正电荷衍生:取两份标准蛋白BSA酶解肽段产物分别加入C12-TMPP-Ac-0Su试剂和C13-TMPP-Ac-0Su试剂，再各加入碳酸氢钠缓冲液，反应15-30分钟，加入三氟乙酸终止反应，反应产物分别命名为C12-TMPP标记和C13-TMPP标记；3)将C12-TMPP标记与C13-TMPP标记分别按照1:1比例混合；4)质谱分析:取Ipmol混合后的正电荷衍生后肽段样品进行质谱分析，对含有两种不同标记物的同一多肽在质谱中出现的两个信号峰强度进行定量分析。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肽段样品的梯度洗脱条件:B溶液经过6分钟的线性梯度从5%升到17%，再经过75分钟线性梯度从17%升到25%，流量为500纳升每分钟。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述质谱分析条件:毛细管的温度为200度，喷雾电压为2千伏，离子透镜值为250。【文档编号】C07F9/572GK103980311SQ201410205986【公开日】2014年8月13日申请日期:2014年5月15日优先权日:2014年5月15日【发明者】纪建国,王青松,安明瑞申请人:北京大学