一种高含量丹参丹酚酸b的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种高含量丹参丹酚酸B的制备方法：包括丹参总酚酸的分离和高含量丹参丹酚酸B制备两步完成。本方法采用有机溶剂萃取的方法选择性去掉而对水溶性成分没有影响，而剩余的水相酸化之后再萃取可以选择性去除极性较大的无机盐、鞣质、糖、蛋白质等水溶性成分，最终得到高含量的丹参总酚酸。在得到丹参总酚酸的基础上，通过将丹参总酚酸溶液的pH调至6.0～8.0，再经大孔树脂分离等步骤，便以约3％的最终得率得到含量超过95％的丹参丹酚酸B产品。本发明所述的方法开发简单、有效、成本低且具有工业化价值。
【专利说明】一种高含量丹参丹酚酸B的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药【技术领域】，具体涉及一种高含量丹参丹酚酸B的制备方法。
技术背景
[0002]丹参(Salvia milt1rrhiza),唇形科鼠尾草属植物,其根、莖入药,味苦辛,性微寒；归心、肝经；具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦和扩张血管等作用，是临床上应用广泛的中药。现代药理学研究发现丹参具有显著的抗炎、抗菌、抗氧化、抗肝脏损伤、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化及抗肿瘤等作用。
[0003]物质基础研究表明，产生上述药理活性的主要化学成分是脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的丹参总酚酸类化合物。其中，丹参总酚酸因在心血管疾病上显示出疗效显著及副作用小的特点，从而在临床上得到了越来越广泛的应用。目前，丹参总酚酸的制备方法主要采用提取、过滤和大孔树脂分离的方法得到，如中国专利CN 1247855 A公开了一种丹参多酚酸盐的制备方法，其丹参丹酚酸B镁的含量为60%左右，丹参总酚酸得率2.5% ;又如中国专利CN 101721467 A公开了一种丹参总酚酸的提取分离方法，其丹参总酚酸得率提高至4%左右，但丹参丹酚酸B含量仅约50 %。虽然上述方法都已实现产业化，但寻找更加简便、经济和高效的制备高含量丹参总酚酸的方法仍然吸引着人们的目光。
[0004]此外，丹参丹酚酸B又是丹参总酚酸中主要活性代表成分之一，且研究发现丹参丹酚酸B的活性显著高于其他丹酚酸类化合物活性，如迷迭香酸、紫草酸、丹参素等。因此，将丹参丹酚酸B开发成新的临床剂型(新药注册要求含量需要达到90%以上)也吸引着众多人的兴趣。
[0005]值得注意的是，丹参丹酚酸B的药材含量虽然较高(约占药材总量的4% )，但到目前为止，已报道的具有工业化价值的技术方法制备的高含量丹参丹酚酸B的技术方法或多或少存在丹参丹酚酸B得率和含量不能兼顾，工艺操作繁杂，以及产业化成本较高等问题。例如，中国专利CN 1911272 A公开了一种高含量丹参多酚酸盐的制备方法，但其丹参丹酚酸B镁的含量为仅为50~95%;又如，中国专利CN 101759672 A公开了一种丹参水溶性提取物、其制剂及用途，虽经聚酰胺和大孔树脂连续分离，但得到的丹参丹酚酸B的含量仅为90%，且得率不超过2% ;此外，中国专利CN 101638401 A公开了丹参水溶性提取物、其制剂及用途，通过微生物发酵去除迷迭香酸，再经反相树脂分离，得到丹参丹酚酸B，纯度>99%。明显的，上述技术方法均不易有效满足丹参丹酚酸B作为新型制剂(90%)的产业化开发应用。因此，开发简单、有效且成本低的具有工业化价值的制备高含量丹参丹酚酸B的技术方法具有重要研究价值。
【发明内容】
[0006] 基于上述分析，通过对丹参中主要成分性质的研究以及大量的劳动实验，我们最终发明了一种新的具有产业化应用价值的制备高含量丹参丹酚酸B的制备方法。
[0007]本发明通过以下技术方案实现:
[0008]—种高含量丹参丹酚酸B的制备方法:
[0009](I)丹参总酚酸的分离:
[0010]将粉碎后的丹参生药用醇水溶液提取，合并粗提液，并浓缩至无醇味，过滤；所得滤液经有机溶剂反萃取去掉脂溶性成分及部分游离丹参多酚酸，收集剩余水相部分；然后调节水相部分pH至1.0~6.0，有机溶剂萃取，合并含丹参多酚酸的有机相，过滤，滤液浓缩至干，得到丹参总酚酸，得率约4% (以生药计)；其中丹参总酚酸含量为80~95%，主要成分丹参丹酚酸B含量为70~85 %，紫草酸含量为5~10 %，迷迭香酸含量低于2 % ；
[0011 ] (2)高含量丹参丹酚酸B制备:
[0012]将上述步骤(1)得到的丹参总酚酸溶解并调节其pH至6.0~8.0,经大孔树脂或聚酰胺树脂分离，经O~80% (V/V)的C1~C2醇水或醇酸水溶液梯度洗脱，高效液相或薄层色板检测，收集含丹酚酸B的溶液，并减压浓缩至干，得到高含量丹参丹酚酸B ;或将收集的含丹参丹酚酸B的溶液减压浓缩至无醇味后，调pH至酸性，经有机溶剂萃取分离后，收集含有丹参丹酚酸B的萃取液并减压浓缩至干，得到高含量丹参丹酚酸B ;得率约3% (以生药计)；其中丹参丹酚酸B的含量大于等于95%且小于100%，杂质含量大于O且小于等于5%，主要杂质包括I~4%紫草酸。
[0013]优选的，制备方法步骤(1)中经反萃取和酸化萃取分离所得到的丹参总酚酸中迷迭香酸含量低于2.0%,更优的,低于0.5%。
[0014]优选的，制备方法步骤中萃取时所用的有机溶剂选自甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚、甲基仲丁基醚及正丁醇中的一种。
[0015]优选的，制备方法步骤(2)中丹参总酚酸溶液在柱层析分离时所调pH在6.0~
8.0之间。
[0016]优选的，制备方法步骤(2)中调节pH值所用的碱或盐选自碳酸锂、碳酸氢锂、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钙、碳酸氢钾、氨水、碳酸氢镁、碳酸铵、碳酸氢铵中一种或几种。
[0017]优选的，制备方法步骤(2)中柱分离的大孔树脂选自HP-20、HPD-80、HPD-100,HPD-100B、HPD-200A、HPD-300、HPD-450、HPD-722、HPD-826、SP-850、ADS-5、ADS-8、ADS-21、DlOU AB-8的一种或几种。
[0018]优选的，制备方法步骤⑵中所用的O~80% (V/V)的C1~C2醇水梯度洗脱树脂的方法为:5~20% (VA)C1~C2醇水洗脱4~8个填料容积量的柱体积去掉紫草酸等杂质，25~50% (V/V) C1~C2醇水洗脱6~8个填料容积量的柱体积，得到丹参酚酸B ;更优选的，5~20% (V/V) C1~C2醇水洗脱4~8个填料容积量的柱体积去掉紫草酸等杂质，20~25% (VA)C1~C2醇酸水洗脱I~4个填料容积量的柱体积，50~80% (VA)C1~C2醇水洗脱6~8个填料容积量的柱体积，得到丹参酚酸B。
[0019]优选的，制备方法步骤(2)中所用的醇酸水溶液中的酸水的比例为0.1~5%。
[0020]优选的，制备方法步骤(2)中所述的酸选自磷酸、盐酸、硫酸、醋酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种，优选盐酸。
[0021]优选的，制备方法步骤(2)中所述高含量丹参丹酚酸B的干燥方法选自减压干燥、冷冻干燥、真空干燥、及喷雾干燥中的一种或几种。
[0022]优选的，所得高含量丹参丹酚酸B可制备成与心脑血管疾病相关的片剂、颗粒剂、口服剂、微丸剂、滴丸剂、粉针剂、水针剂、输液剂、胶囊剂及其他药物及保健品制剂。
[0023]本发明的技术特点在于:
[0024]第一，通过理论及实验研究，我们首次报道脂溶性的丹参酮及游离丹参多酚酸类化合物可以采用有机溶剂萃取的方法选择性去掉而对水溶性成分没有影响，而剩余的水相酸化之后再萃取可以选择性去除极性较大的无机盐、鞣质、糖、蛋白质等水溶性成分，最终得到高含量的丹参总酚酸。即我们首次报道了一种经反萃取、酸化萃取、过滤和浓缩至干得到丹参总酚酸的制备方法，所得丹参总酚酸的含量为80~95%，得率以生药计超过4%。其中，主要成分丹参丹酹酸B含量为70~85%,紫草酸含量为5~10%,迷迭香酸含量低于2%。该方法与传统大孔树脂制备丹参总酚酸的工艺CN 101721467 A及CN 101744878 A相比，不仅其有效成分丹参丹酚酸B含量亦达到80%左右，而且具有简便、有效和降低生产成本的优点，具有创造性。
[0025]第二，本发明在得到丹参总酚酸的基础上，通过将丹参总酚酸溶液的pH调至6.0~8.0，再经大孔树脂分离等步骤，便以约3%的最终得率(以丹参生药计)得到含量超过95%的丹参丹酚酸B产品。明显的，与现有制备高含量丹参丹酚酸B技术专利CN101759672 A(丹酚酸B含量90%左右)和CN 1911272 A(丹酚酸B含量55~95% )相t匕，本工艺条件下得到的丹参丹酚酸B的含量和得率都大大提高。此外，本工艺条件下所得到的高含量丹参丹酚酸B含量大于等于95%，主要杂质为I~4%紫草酸，杂质迷迭香酸含量低于2%，更优的低于0.5%，显著不同于现有专利的杂质含量要求，体现出显著的新颖性和创造性。
[0026]综上，我们通过将丹参提取浓缩液经反萃取和酸化萃取分离方法得到丹参总酚酸；在此基础上，将丹参总酚酸溶液pH调至6.0~8.0,再经树脂柱分离，醇水洗脱，得到高含量的丹参丹酚酸B ( > 95 % )，达到并超过丹参丹酚酸B新的临床剂型含量要求(>90%)。明显的，该技术方法不仅工艺步骤简便、有效，将其在工业生产中推广可以达到降低生广成本，提闻生广效率的效果。
[0027]第一、丹参总酚酸的分离方法研究。通过对丹参醇水提取物研究发现，其主要成分为水溶性的无机盐、鞣质、糖、蛋白质、丹参总酚酸以及脂溶性的丹参酮类化合物。因此，为了选择性的得到丹参总酚酸类化合物，我们尝试采用反萃取和酸化萃取的方法分离。其中，反萃取可以将脂溶性的丹参酮类杂质化合物和部分游离的丹参总酚酸选择性去掉，而剩余水相酸化后萃取，可以选择性去除极性较大的无机盐、鞣质、糖、蛋白质。基于上述分析，设计并完成下列验证实验，具体实验方法如下:
[0028]对照1:取I公斤丹参药材，按照专利CN 101721467 A中所述制备方法得到丹参总酚酸固体(D101树脂，批号:110405，沧州宝恩树脂)，称重，通过高效液相色谱测定丹参丹酚酸B含量，并计算其得率。实验结果见表1。
[0029]实验I~7:将粉碎后的7公斤丹参药材依次用49L、35L、21L的浓度为70%的乙醇水溶液在回流条件下提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，过滤。滤液均分成7份，然后经2倍滤液体积量的有机溶剂溶液萃取6次，将剩余含丹参丹酚酸B的水相溶液用浓度为5%稀盐酸调节pH至2，每份再用等体积量的有机溶剂萃取3次，合并有机相，过滤，滤液减压浓缩至干，得到丹参总酚酸的干膏，称重，高效液相色谱测定丹参丹酚酸B含量，并计算其得率。实验结果见表1。
[0030]实验8:将粉碎后的I公斤丹参药材依次用7L、5L和3L的浓度为70%的乙醇水溶液在回流条件下提取3次，每次2小时，合并提取液，并减压浓缩至无醇味，过滤；滤液浓缩至丹参丹酚酸B浓度40mg/mL，然后经95%乙醇溶液醇沉2次；过滤，所得滤液经减压浓缩至无醇味后，加水调节所得溶液中丹参丹酚酸B浓度至20mg/mL，然后经2倍丹参丹酚酸B溶液体积量的乙酸乙酯萃取6次，将剩余水相部分减压浓缩至干，得到丹参总酚酸干膏，称重，高效液相色谱测定丹参丹酚酸B含量，并计算其得率。实验结果见表1。
[0031]实验9:粉碎后的I公斤丹参药材依次用7L、5L、3L的浓度为70%的乙醇水溶液在回流条件下提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，过滤，将所得滤液用浓度为5%稀盐酸调节pH至2，然后经乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，并减压浓缩至干，得到丹参总酚酸的干膏，称重，高效液相色谱测定丹参丹酚酸B及迷迭香酸含量，并计算它们的得率。实验结果见表1。
[0032]其中，紫草酸，丹参丹酚酸B和迷迭香酸在HPLC色谱图中出峰时间，如在【专利附图】
【附图说明】图1中的出峰时间依次分别为?.70min、8.94min和9.72min。
[0033]表1、丹参总酚酸的分离方法研究
[0034]
【权利要求】
1.一种高含量丹参丹酚酸B的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)丹参总酚酸的分离: 将粉碎后的丹参生药用乙醇水溶液提取，合并粗提液，并浓缩至无醇味，过滤；所得滤液经有机溶剂反萃取去掉脂溶性成分及部分游离丹参多酚酸，收集剩余水相部分；然后调节水相部分pH至1.0~6.0，有机溶剂萃取，合并含丹参多酚酸的有机相，过滤，滤液浓缩至干，得到丹参总酚酸； (2)高含量丹参丹酚酸B制备: 将上述步骤(1)得到的丹参总酚酸溶解并调节其pH至6.0~8.0，经大孔树脂或聚酰胺树脂分离，经O~80% (V/V)的C1~C2醇水或醇酸水溶液梯度洗脱，高效液相或薄层色板检测，收集含丹酚酸B部分的溶液，并减压浓缩至干，得到高含量丹参丹酚酸B ;或将收集的含丹参丹酚酸B的溶液减压浓缩至无醇味后，调pH至酸性，经有机溶剂萃取分离后，收集含有丹参丹酚酸B的萃取液并减压浓缩至干，得到高含量丹参丹酚酸B。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，制备方法步骤(1)中经反萃取和酸化萃取分离所得到的丹参总酚酸中迷迭香酸含量低于2.0%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，制备方法步骤中萃取时所用的有机溶剂选自甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚、甲基仲丁基醚及正丁醇中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，调节丹参总酚酸溶液pH至6.0~8.0所用的碱或盐选自碳酸锂、碳酸氢锂、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钙、碳酸氢钾、氨水、碳酸氢镁、碳酸铵、碳酸氢铵中一种或几种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，制备方法步骤(2)中的大孔树脂选自 HP-20、HPD-80、HPD-100, HPD-100B, HPD-200A、HPD-300、HPD-450、HPD-722、HPD-826、SP-850、ADS-5、ADS-8、ADS-2UDlOU AB-8 的一种或几种。
6.根据权利要求1所述，其特征在于制备方法步骤(2)中所用的O~80%(V/V)的C1~C2醇水梯度洗脱树脂的方法为:5~20% (V/V) C1~C2醇水洗脱4~8个填料容积量的柱体积去掉紫草酸等杂质，25~50% (V/V) C1~C2醇水洗脱6~8个填料容积量的柱体积，得到丹参酚酸B ;更优选的，5~20% (V/V) C1~C2醇水洗脱4~8个填料容积量的柱体积去掉紫草酸等杂质，20~25% (VA)C1~C2醇酸水洗脱I~4个填料容积量的柱体积，50~80% (VA)C1~C2醇水洗脱6~8个填料容积量的柱体积，得到丹参酚酸B。
7.根据权利要求1和6所述，其特征在于，所用的醇酸水溶液中的酸水的比例为0.1~5%。
8.根据权利要求1、6和7所述，其特征在于，制备方法步骤中所述的酸选自磷酸、盐酸、硫酸、醋酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，制备方法步骤(2)中所述高含量丹参丹酚酸B的干燥方法选自减压干燥、冷冻干燥、真空干燥、及喷雾干燥中的一种或几种。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所得高含量丹参丹酚酸B可制备成与心脑血管疾病相关的片剂、颗粒剂、口服剂、微丸剂、滴丸剂、粉针剂、水针剂、输液剂、胶囊剂及其他药物及保健品制剂。
【文档编号】C07D307/86GK104130226SQ201410399742
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年4月1日
【发明者】王平 申请人:王平