一种从核桃青皮中分离制备生物碱的方法
【专利摘要】本发明涉及一种从核桃青皮中分离制备生物碱的方法，以核桃青皮为原料，经超声波微波萃取仪辅助处理后，采用多级萃取和HSCCC对生物碱进行分离和制备，其中，用甲醇：水比例为4∶1的混合液作提取剂，液料比为10∶1，经超声波微波萃取仪辅助处理15min后，采用多级萃取后获得氯仿甲醇水生物碱提取液；用氯仿甲醇。HSCCC法不需要固相载体，可消除由于样品在固相载体上的不可逆吸附和降解造成的损失，具有回收率高；可多次进样，其分离过程都保持很稳定，重现性好；可实现梯度洗脱和反相洗脱，亦能进行重复进样，分离效率高，分离量较大。
【专利说明】一种从核桃青皮中分离制备生物碱的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物碱分离制备领域，尤其涉及一种从核桃青皮中分离制备生物碱的 方法。
【背景技术】
[0002] 核桃（Juglans regia L)青皮又称青龙衣，为核桃外部一层厚厚的未成熟的绿色 果皮。其中含有生物碱、萘醌类、黄酮类、二芳基庚烷类、多糖类、小分子萜类等。生物碱为 一类重要的来源于生物界（以植物为主）的含氮的有机物，主要存在于植物体内各个器官 和组织中。同科同属植物可能含有相同结构类型的生物碱，在植物的某种器官含量可能较 高，相对核桃其它组织。在核桃各组织中，新鲜的青皮中生物碱明显高于其它组织。
[0003] 植物体中生物碱含量甚微，但种类众多，结构和性质差异很大。生物碱通常采取的 提取分离方法一般是根据其的溶解度来确定。除季铵碱和一些分子量较低或含极性基团较 多的生物碱外，生物碱一般均不溶或难溶于水，但大都能溶于氯仿、甲醇、乙醇等有机溶剂。 基于这种特性，通常采用非极性溶剂、极性溶剂和混合溶剂进行提取。常见的生物碱的提取 方法有冷浸、渗漉、超声波、索氏提取、热回流提取等，但存在提取率低、分离不完全和纯度 较低的问题。
[0004] 鉴于上述缺陷，本发明创作者经过研宄和实践终于获得了本创作。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种从核桃青皮中分离制备生物碱的方法，用以克服上述 技术缺陷。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供一种从核桃青皮中分离制备生物碱的方法，以核桃 青皮为原料，经超声波微波萃取仪辅助处理后，采用多级萃取和HSCCC对生物碱进行分离 和制备，其中，用甲醇：水比例为4 : 1的混合液作提取剂，液料比为10 : 1，经超声波微波 萃取仪辅助处理15min后，采用多级萃取后获得氯仿甲醇水生物碱提取液；用氯仿甲醇。
[0007] 进一步地，该具体过程为：
[0008] 步骤a，以胡桃青皮为原料，加入10倍体积的甲醇：水为4 : 1的混合液，在超 声波微波辅助萃取仪分三阶段进行处理，超声波频率为50KHz，模式15 : 10,电机转速 900r · mirf1;
[0009] 离心取上清液，旋转蒸发器蒸发至原体积的1/10,用2mol · T1H2SO4酸化至PH为 2?3,氯仿萃取3次，将上层酸水溶液层用氨水碱化至PH为10左右，用氯仿：甲醇比例为 3 : 1的混合液萃取2次，再用氯仿萃取1次，取氯仿：甲醇的提取液；
[0010] 旋转蒸发，留取少许用坩埚蒸干，计算提取率后用甲醇溶解；
[0011] 步骤b，薄层层析分离生物碱；称取羧甲基纤维素钠加适量的纯水溶解，加薄层层 析硅胶，混匀后再加微晶纤维素，超声波清洗除气泡，图板制片，备用；
[0012] 用氯仿：甲醇比例为16 : 1的混合液作展开剂；
[0013] 步骤c，HSCCC分离制备生物碱，以甲醇作对照，对核桃青皮生物碱样品和6种标准 生物碱；在190-400nm处用紫外可见光度计进行检测，观察吸收峰值，并导出波峰数据；
[0014] 石油醚：氯仿：甲醇：2mol · T1H2SO4K例为2 : 4 : 2 : 2V/V为溶剂体系，按 比例将4种溶剂加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，室温下静置过夜，使用前分得上相 和下相，超声脱气30min以备用；
[0015] 将已超声脱气后的下相以ZOmLmirT1的速度泵入HSCCC分离管中，待下相充满整 个管路，设定分离管顺时针旋转，缓慢调节主机转数至800r · mirT1，同时以2mL · rnirT1流速 注入上相，两相达平衡后由进样阀进入样品溶液，同时采集相应的数据，通过紫外检测检测 流出物，按照色谱峰收集相应的成份。
[0016] 与现有技术相比较本发明的有益效果在于：HSCCC技术采用了不同物化特性的溶 剂体系和多样性的操作条件，具有较强的适应性，可为从复杂的天然产物粗制品中提取不 同特性（如不同极性）的有效成分提供了有利条件。
[0017] HSCCC法不需要固相载体，可消除由于样品在固相载体上的不可逆吸附和降解造 成的损失，具有回收率高；可多次进样，其分离过程都保持很稳定，重现性好；可实现梯度 洗脱和反相洗脱，亦能进行重复进样，分离效率高，分离量较大。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为本发明的分离与制备方法的流程示意图；
[0019] 图2a为本发明的苦参碱紫外光谱扫描图；
[0020]图2b为本发明的丁溴酸东莨碱紫外光谱扫描图；
[0021] 图2c为本发明的乌头碱紫外光谱扫描图；
[0022] 图2d为本发明的小檗碱紫外光谱扫描图；
[0023] 图2e为本发明的儿茶素紫外光谱扫描图；
[0024] 图2f为本发明的没食子酸紫外光谱扫描图；
[0025] 图3为本发明的生物碱提取液紫外光谱扫描图；
[0026] 图4为本发明的生物碱样品的分离结果图。
【具体实施方式】
[0027] 以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
[0028] 本发明以核桃青皮为原料，经超声波微波萃取仪辅助处理后，采用多级萃取和 HSCCC对生物碱进行分离和制备。结果显示：用甲醇水（4 : 1)作提取剂，液料比为10 : 1， 经超声波微波萃取仪辅助处理15min后，采用多级萃取后获得氯仿甲醇水生物碱提取液； 用氯仿甲醇（16 : 1)作展开剂，经TLC获得了较为清晰的多个单体图像；HSCCC(溶剂体系： 正己烷、氯仿、甲醇、2mol.L-lH2S04,体积比为2 : 4 : 2 : 2)在313nm处对各单体进行 了收集。结论：结合紫外光谱特征，将采集到的各单体与多种生物碱标准品进行TLC图像比 对，初步确认其中4个单体分别为没食子酸、小檗碱、苦参碱和儿茶素。
[0029] 请参阅图1所示，本发明的从核桃青皮中分离制备生物碱的方法的过程为：
[0030] 步骤a，以胡桃青皮为原料，加入10倍体积的甲醇：水为4 : 1的混合液，在超 声波微波辅助萃取仪分三阶段进行处理，超声波频率为50KHz，模式15 : 10,电机转速 900r · mirf1。
[0031] 离心取上清液，旋转蒸发器蒸发至原体积的1/10,用2mol · T1H2SO4酸化至PH为 2?3,氯仿萃取3次，将上层酸水溶液层用氨水碱化至PH为10左右，用氯仿：甲醇比例为 3 : 1的混合液萃取2次，再用氯仿萃取1次，取氯仿：甲醇的提取液。
[0032] 旋转蒸发，留取少许用坩埚蒸干，计算提取率后用甲醇溶解。
[0033] 步骤b，薄层层析分离生物碱；称取羧甲基纤维素钠加适量的纯水溶解，加薄层层 析硅胶，混匀后再加微晶纤维素，超声波清洗除气泡，图板制片，备用。
[0034] 用氯仿：甲醇比例为16 : 1的混合液作展开剂。
[0035] 步骤c，HSCCC分离制备生物碱，以甲醇作对照，对核桃青皮生物碱样品和6种标准 生物碱（苦参碱、丁溴酸东莨碱、乌头碱、小檗碱、儿茶素、没食子酸）在190_400nm处用紫 外可见光度计进行检测，观察吸收峰值，并导出波峰数据。
[0036] 石油醚：氯仿：甲醇：2mol ^r1H2SO4Q : 4 : 2 : 2V/V)为溶剂体系，按比例将 4种溶剂加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，室温下静置过夜，使用前分得上相（固定 相）和下相（流动相），超声脱气30min以备用。
[0037] 将已超声脱气后的下相（流动相）以20mL · HiirT1的速度泵入HSCCC分离管中， 待下相充满整个管路，设定分离管顺时针旋转，缓慢调节主机转数至800r · mirT1，同时以 2mL · HiirT1流速注入上相，两相达平衡后由进样阀进入样品溶液（小于20mL，不含固体颗 粒），同时采集相应的数据，通过紫外检测（254nm)检测流出物，按照色谱峰收集相应的成 份。
[0038] 下面通过实施例进行说明。
[0039] 步骤a，生物碱的粗提取与鉴定；
[0040] 称取20g核桃皮粉3份，加入10倍体积的甲醇：水混合液（4 : 1)，在超声波微波 辅助萃取仪分三阶段进行处理，每阶段5min，共15min。在超声波恒定的条件下，设置温度 为45°0、50°0、55°0，超声波功率为800、850、9001，微波功率为150、200、2501，超声波频率 为50KHz，模式15 : 10,电机转速900r min'离心取上清液，旋转蒸发器蒸发至原体积的 1/10。用2mol · T1H2SO4酸化至PH为2?3,氯仿萃取3次，将上层酸水溶液层用氨水碱化 至PH为10左右，用氯仿：甲醇（3 : 1)萃取2次，再用氯仿萃取1次，取氯仿：甲醇的提 取液。旋转蒸发，留取少许用坩埚蒸干，计算提取率后用甲醇溶解。
[0041] 步骤b，薄层层析分离生物碱；
[0042] 称取羧甲基纤维素钠 60g加适量的纯水溶解，加薄层层析硅胶20g，混匀后再加微 晶纤维素 2. 5g，超声波清洗除气泡，图板制片，备用。
[0043] 分别配制不同比例的不同的展开剂，氯仿：甲醇（15 : I ;15. 5 : I ;16 : 1 :; 16. 5 : 1);氯仿：乙醇（15 : 1 ;15· 5 : I ;16 : 1 : ;16· 5 : 1);环己烷：乙酸乙酯：正 丙醇：二甲基胺（30 : 25 : 0.9 : 0. 1)，经薄层层析展开，紫外分析，确定最佳展开剂。并 将自制硅胶板与标准硅胶板及不同展开剂所得结果进行对比，确定所用硅胶板。
[0044] 在波长254nm下对薄层板进行拍照分析，对比后保存最佳展开薄层板。
[0045] 步骤c，HSCCC分离制备生物碱；
[0046] 以甲醇作对照，对核桃青皮生物碱样品和6种标准生物碱（苦参碱、丁溴酸东莨 碱、乌头碱、小檗碱、儿茶素、没食子酸）在190-400nm处用紫外可见光度计进行检测，观察 吸收峰值，并导出波峰数据。
[0047] 选石油醚：氯仿：甲醇：2mol ^r1H2SO4Q : 4 : 2 : 2V/V)为溶剂体系，按比例 将4种溶剂加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，室温下静置过夜，使用前分得上相（固 定相）和下相（流动相），超声脱气30min以备用。将已超声脱气后的下相（流动相）以 20mL · HiirT1的速度泵入HSCCC分离管中，待下相充满整个管路，设定分离管顺时针旋转，缓 慢调节主机转数至800r · mirT1，同时以2mL · HiirT1流速注入上相，两相达平衡后由进样阀 进入样品溶液（小于20mL，不含固体颗粒），同时采集相应的数据，通过紫外检测（254nm) 检测流出物，按照色谱峰收集相应的成份。
[0048] 结果分析：
[0049] 1、中强生物碱晶体的鉴定；生物碱的沉淀反应是利用大多数生物碱在酸性条件 下，与某些沉淀剂反应生成弱酸不溶性复盐或络合物沉淀。生物碱沉淀反应一般在稀酸水 溶液中进行。这是由于生物碱与酸成盐易溶于水，生物碱沉淀试剂也易溶于水，且在酸水中 较稳定，而反应产物难溶于水，因而有利于反应的进行结果的观察。
[0050] 在生物碱的预试、提取、分离和结构鉴定中常用的是生物碱的沉淀反应和显色反 应。
[0051] 取含中强生物碱的粗提样品少许，酸化处理后加碘化铋钾试剂观察，有棕黄色沉 淀出现，表明为生物碱。
[0052] 2、生物碱的薄层层析；
[0053] 生物碱标准品的紫外光谱扫描结果，请参阅图2a_2f所示，其为六种生物碱标准 品的紫外光谱扫描图，表1为六种生物碱的吸收波峰。
[0054] 表1六种生物碱的吸收波峰
[0055]
【权利要求】
1. 一种从核桃青皮中分离制备生物碱的方法，其特征在于，以核桃青皮为原料，经超 声波微波萃取仪辅助处理后，采用多级萃取和HSCCC对生物碱进行分离和制备，其中，用甲 醇：水比例为4 : 1的混合液作提取剂，液料比为10 : 1，经超声波微波萃取仪辅助处理 15min后，采用多级萃取后获得氯仿甲醇水生物碱提取液；用氯仿甲醇。
2. 根据权利要求1所述的从核桃青皮中分离制备生物碱的方法，其特征在于，该具体 过程为： 步骤a，以胡桃青皮为原料，加入10倍体积的甲醇：水为4 : 1的混合液，在超声波微波 辅助萃取仪分三阶段进行处理，超声波频率为50KHz，模式15 : 10,电机转速900r ? mirT1; 离心取上清液，旋转蒸发器蒸发至原体积的1/10,用2mol ? 17屯2304酸化至PH为2? 3,氯仿萃取3次，将上层酸水溶液层用氨水碱化至PH为10左右，用氯仿：甲醇比例为3 : 1 的混合液萃取2次，再用氯仿萃取1次，取氯仿：甲醇的提取液； 旋转蒸发，留取少许用坩埚蒸干，计算提取率后用甲醇溶解； 步骤b，薄层层析分离生物碱；称取羧甲基纤维素钠加适量的纯水溶解，加薄层层析硅 胶，混匀后再加微晶纤维素，超声波清洗除气泡，图板制片，备用； 用氯仿：甲醇比例为16 : 1的混合液作展开剂； 步骤c，HSCCC分离制备生物碱，以甲醇作对照，对核桃青皮生物碱样品和6种标准生物 碱；在190-400nm处用紫外可见光度计进行检测，观察吸收峰值，并导出波峰数据； 石油醚：氯仿：甲醇例为2 : 4 : 2 : 2V/V为溶剂体系，按比例将 4种溶剂加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，室温下静置过夜，使用前分得上相和下相， 超声脱气30min以备用； 将已超声脱气后的下相以ZOmLmirT1的速度泵入HSCCC分离管中，待下相充满整个管 路，设定分离管顺时针旋转，缓慢调节主机转数至800r ? mirT1，同时以2mL ? mirT1流速注入 上相，两相达平衡后由进样阀进入样品溶液，同时采集相应的数据，通过紫外检测检测流出 物，按照色谱峰收集相应的成份。
【文档编号】C07D311/62GK104478878SQ201410650315
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月8日 优先权日:2014年11月8日
【发明者】杨卫民, 张苏勤, 杜京旗, 赵君, 刘宝琦 申请人:吕梁学院