Glp-1与人血清白蛋白重组蛋白的设计及稳定表达cho细胞株的构建方法
【专利摘要】本发明提供了一类新颖的胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物与人血清白蛋白重组蛋白及其制备的方法。该新颖重组蛋白组成框架为：T-S-X-G-G-H，T代表的蛋白序列为生物亲和标签；S代表的蛋白序列为蛋白酶酶切位点；X代表一个氨基酸；G代表GLP-1类似物蛋白；H代表人血清白蛋白。该设计通过生物制备后经酶切获得N端均一的GLP-1类似物样品，提高生物样品的均一性和活性。并构建稳定表达这类重组蛋白的中国仓鼠卵巢细胞（CHO）稳定表达株。本发明制备的新颖重组蛋白具有更高的生物学活性和更优的体内外稳定性。这类重组蛋白可用于治疗2型糖尿病及通过降低血浆葡萄糖而受益的其它疾病。可用于诱导细胞分化为β胰腺细胞的1型糖尿病的治疗。同时也可用于刺激神经系统产生饱腹感和抑制胃蠕动而受益的其他疾病。
【专利说明】GLP-1与人血清白蛋白重组蛋白的设计及稳定表达CHO细胞株的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明利用基因工程手段，设计新颖的GLP-1与HSA的类似物。新颖的重组蛋白利用新型构建的高效表达质粒PMH3，并在中国仓鼠细胞(CHO)中表达。获得了高活性和高表达的细胞株(CH0/pMH3/TSXGGH)。获得的菌株产率高达9.45 μ g*d^l06cellso发酵表达产量高，纯化工艺方便，纯化所获得的产品符合原料药的要求。该药物用于糖尿病和相关疾病的治疗。
【背景技术】
[0002]2型糖尿病，又被称之为非胰岛素依赖糖尿病，缘于β细胞功能低下，胰岛素相对缺乏和胰岛素抵抗。近年来，2型糖尿病的患病率逐渐增加，据世界卫生组织预测，至2030年，全球将有3亿2型糖尿病患者。GLP-1药物能刺激β细胞的分化和增值，并且促进β细胞的分泌胰岛素的能力，而成为治疗2型糖尿病的关键药物。
[0003]GLP-1类似物成药的药物有Glaxo Smith Kline公司生产的阿必鲁泰(Albugon)和Eli Iily公司生产的艾塞那肽(exendin-4)。国内的长效GLP-1类似物还没有任何一个药物通过CFDA的批准上市。国外批准上市的药物有Glaxo Smith Kline公司生产的阿必鲁泰(Albugon)和Eli Iily公司生产的艾塞那肽(exendin-4),但他们在应用当中都有很明显的缺陷。阿必鲁泰因是与脂肪酸融合而变成长效药物因其制备方法而导致药物的单位活性损失100倍以上，而药物的半衰期却只有4-6 h左右，单位服用剂量大而使得患者的副作用增强。艾塞那肽是单一的蛋白药物，生物制备方法使得产品质量很好控制，但其药物的半衰期只有2 h而患者每天要注射两次，增加了患者的痛苦和副作用。
[0004]现在研究报道的人血清白蛋白与GLP-1类似物重组蛋白在酵母中表达，未考虑N末端一致性而提高药物高活性的问题。生物模拟计算和实验结果显示N末端的是GLP-1药物的活性区域，为保证N末端的一致性，本发明在新颖重组蛋白的N末端前添加Hi s-tag标签，并在Hi s-tag标签后加入蛋白酶位点(肠激酶DDDDK )。表达的重组蛋白6*His-DDDDK-X-GGH,纯化后经肠激酶酶切获得重组蛋白(fus1n protein)。获得的重组蛋白的N末端一致，且活性高。
【发明内容】
[0005]本发明设计了一种重组蛋白并在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CH0)中制备方法，保证了 N末端的一致性并且获得了高活性的药物蛋白。主要包含的
【发明内容】
包括以下几点。
[0006](I)新颖GLP-1类似物的重组蛋白设计。GLP-1 (A2G) - GLP-1 (A2G) -HSA蛋白分别简与为GGH,设计XGGH蛋白(X代表Iv氣基Ife或无)。为表达N端一致性的目标蛋白，在蛋白的N端添加His-tag等生物标签(简称T)，并在生物标签后加入肠激酶DDDDK等蛋白酶酶切位点(简称S)。通过基因工程手段获得TSXGGH的基因片段。附图中SEQ ID NO:1GLP-1 (A2G)- GLP-1 (A2G)-HSA基因序列，SEQ ID NO: 2 GLP-1 (A2G)- GLP-1 (A2G)-HSA蛋白序列。其它GLP-1类似物序列以此类推。
[0007](2)高效表达质粒(pMH3/TSXGGH)的构建。利用自行构建的高启动活性，高GC序列和poly A序列的质粒PMH3 (国际专利号:W0/2008/091276)。表达的重组蛋白为T (亲和标签)-S (蛋白酶位点)-X-GLP-lm-GLP-lm-HSA，将表达的重组蛋白简称TSXGGH。经&oR I和I酶切PCR扩增产物并与ρΜΗ3载体连接。构建表达细胞表达质粒pMH3/TSXGGH。
[0008](3)稳定表达CHO细胞株的筛选。所用的CHO细胞的贴壁培养基(D001)和悬浮培养基(B001)均为优化后的培养基。构建好的质粒经无内毒素试剂盒提取质粒后，经电转和梯度压力筛选获得表达菌株。重复低密度铺板和表型筛选四个循环后获得稳定且高表达的细胞株。稳定细胞株可以连续培养20代以上，表达量无明显变化。
[0009](4)稳定表达CHO细胞株的悬浮驯化与发酵。筛选的8株稳定表达的细胞株，在BOOl中连续培养培养2个月，使得CHO细胞适应悬浮培养。按照1:3比例放大培养悬浮细胞，最后在10 L生物反应器中发酵培养连续发酵12 do蛋白产率达4.58-9.43 μ g*d_1*106cellso
[0010](5)药物蛋白纯化与活性检测。先通过Blue亲和柱调取含HSA的蛋白并除去大部分的杂蛋白。稀释溶液至电导与Ni离子柱等亲和柱上样液相同后，再通过Ni离子等亲和柱调取N端含His-tag的蛋白。经脱盐柱置换缓冲液，获得的蛋白通过肠激酶剪等蛋白酶酶切后终获得N端均一的目标蛋白。药物蛋白经体内外活性检测，均显示有很好的药效。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1:细胞株表达蛋白的Dot blot筛选图；挑选的单克隆细胞经Dot blot挑选高表达的克隆。
[0012]图2:细胞株表达蛋白的Western blot筛选图；挑选的8株高表达细胞株的GLP-1单抗的Western blot图，泳道I为阳性对品GGH。
[0013]图3:细胞株表达蛋白的Western blot筛选图；挑选的8株高表达细胞株的HSA单抗的Western blot图，泳道I为阳性对品GGH。
[0014]图4:CH0细胞株的10 L发酵罐过程监测。
[0015]图5:CH0细胞株表达药物蛋白的体外活性实验；在构建好的CH0/GLP-1R/CRE-fLUC细胞模型检测。
[0016]图6:CH0细胞株表达药物蛋白的体内活性实验；给药量为3 mg/kg。
[0017]
【具体实施方式】
[0018]具体实施方法是本发明的制备途径之一，本发明还可以通过其他途径实施和应用，本发明可以在没有违背本发明的精神下进行修饰和改善。
[0019]具体实施方法1: GLP-1重组蛋白在CHO中的稳定株克隆和制备实验材料中国仓鼠卵巢细胞(CHO-S);遗传霉素G418 (sigma)；自己构建的表达载体pMH3 ；自己配置的培养基，贴壁培养基(D001)，悬浮培养基(B001)，流加培养基(F001);所用其它试剂皆为分析纯试剂。
[0020]实验仪器
电转仪；细胞培养箱；细胞摇床；10 L生物反应器；常规的一次性耗材。
[0021]实验步骤
(I)质粒提取
溶液配制:溶液 1:50mM 葡萄糖；25mM Tris_cl(pH 8.0) ；10mM EDTA (pH 8.0)，配好后灭菌放在 4°C。溶液 II:0.2 mol/L NaoH ；1% (m/L)的 SDS,现用现配。0.4 mol/L NaoH 与2% (m/L)的 SDS 等体积混匀。溶液 III (100 mL):5mol/L KAc 60 mL ;冰醋酸 11.5 ml ;水28.5 mL。
[0022]操作步骤。培养12-16 h的新鲜菌液6-8 mL, 12000 rpm lmin，吸掉管底残留培养基。溶液I 300 μ L，用移液器吹打使菌体充分重悬。溶液II 300 μ L，小心翻转EP管，待液体变清澈后，静置I min。溶液III 300 μ L，小心的混匀，有大量的白色絮状析出(液体是透明的)。12000 rpm离心15 min,移上清至一新EP管中，再重复一遍。加异丙醇至1.5mL, -20°C, 1min0 12000 rpm离心25 min。在管里加ImL的75%乙醇漂洗沉淀,倒掉乙醇，晾干。加入超纯水溶解，加入适量RNA酶，37°C I h。按体积比1:1加入苯酚，剧烈混匀，静置2 min。12000 rpm离心10 min,小心吸取上清至一新EP管。按体积比1:1加入氯仿，剧烈混匀，静置2 min。12000 rpm离心10 min，小心吸取上清至一新EP管。在上清中加入 75 μ L3M 的 NaAc,加异丙醇至 1.5 mL, -20°C , 1min0 12000 rpm 离心 25 min,倒掉上清，加入ImL的75%乙醇漂洗。12000 rpm离心2 min，倒掉乙醇，晾干。溶于适量的超纯水中(100 μ L 左右)。
[0023](2)细胞转染
准备高浓度无内毒素质粒，收集CHO细胞。配置电转反应体系:200 yL细胞悬液+20μ g质粒+10 μ g鲑鱼精DNA (提高转染效率)，混匀后加入2 mm电极杯中。将电极杯冰浴I min,250V, 12 mS电击一次，冰浴I min。两个dish中各加入10 mL的培养基(D001含10%FBS)，将电极杯中的悬液均分至两个dish中。
[0024](3)克隆筛选
待dish细胞生长两天贴壁后，换液(D001+6%FBS)加压，加G418浓度为1.2-1.8mg/mL。有大量死细胞直接换液不加压，待克隆长出。细胞单克隆长至合适大小，准备挑克隆。将克隆挑至96孔板中。置培养箱中培养，待克隆长至铺满80%孔底，通过Dot blot (附图1)和WB (附图2、图3)检测表达情况。挑选阳性克隆继续放大贴壁培养，继续讲阳性克隆消化后放置在dish中加压培养，待长出克隆可见后据需挑至96孔板中通过Dot blot和WB检测表达情况。
[0025](4)细胞悬浮驯化
选择8个阳性克隆，将细胞转移至T75培养瓶中培养，待细胞汇合度至90%左右时，将两瓶T75细胞消化，合并转移至40mL摇瓶中，加入30mL悬浮培养液B001悬浮驯化。连续培养2个月，挑选最终适应悬浮培养的细胞株作为工程菌株。
[0026](5) Dot blot 检测
收集样本，一般为细胞培养液上清；点膜，使用NC膜或PVDF膜(需泡甲醇)，按照样品顺序点膜，5uL/点，设置阴性对照(空培养液、空细胞培养液)和阳性对照(稀释梯度)，并用圆珠笔做好标记；将膜置37°C烘干，约10-15min ;封闭，用TBST配制5%脱脂奶粉，室温摇床封闭Ih ；TBST洗涤1-2次;一抗(TBST配制)孵育Ih ；TBST洗涤三次，每次1min ;二抗(TBST配制)孵育Ih ;TBST洗涤三次，每次1min ；ECL显影。
[0027](6) Western blot 检测
收集样本，一般为细胞培养液上清。样品处理，加入相应量的Loading buffer，煮沸5min ；SDS-PAGE电泳；转膜，电泳完后，将胶小心剥下，与滤纸、纤维垫、硝酸纤维膜按正确顺序装好，_20°C浸泡于转移缓冲液40 min ;装好转移电泳盒，放入转子、冰盒，接好电源，在磁力搅拌器上50-100V恒压转移Ih ;转移完成后拆去转移装置，揭下膜，标记好正反面(膜与胶贴着的一面为正面)，放入丽春红染液染色5-10 min，取出，去离子水洗去浮色，观察转移效果，丽春红染色可做可不做；加入封闭液，4 °C过夜，或室温Ih ;TBST洗膜1-2次；用TBST稀释一抗，置于水平摇床上室温孵育I h ；TBST洗涤三次，每次1min ;用TBST稀释二抗，置于水平摇床上室温孵育I h ；TBST洗涤三次，每次1minECL显色。
[0028](7)稳定细胞株的10 L生物反应器发酵表达
装液量为6 L，准备I L种子液，密度为4.0 X 16个/mL。转速为110 rpm, pH控制为
7.2，培养温度为37°C。通过调节氧气和二氧化碳的通气量保证溶氧控制在3(Γ60%之间。待细胞密度长为9.0 X 16个/mL后，降低温度流加R)01继续培养10 d(图4)。结果显示，在发酵罐中前三天细胞密度每天翻倍增长，第三天细胞密度高达8.78*106 cell/mL。第三天后降温细胞密度变化不大，细胞开始大量生产目的蛋白，发酵后期细胞死亡率增加，蛋白积累量减少，最终的蛋白浓度可达到487 mg/Lo
[0029](8)重组蛋白的纯化
发酵液8000 rpm、10 min离心获得上清液,用0.45 μπι的膜过滤除菌。用截留分子量10 kDa的超滤仪超滤浓缩5?12倍。第一步选用Blue Sepharose, 0.1 mol/L NaCl (pH
6.0?9.0)平衡，用浓缩液上样，淋洗平衡。2 mol/L NaCl (pH 6.0?9.0)为B液，以100%B液梯度洗脱。第二部稀释收集的洗脱液，经过Ni Sepharose亲和层析,收集100 mmol/L咪唑的洗脱液。最后一步经G25 Sepharose离子层析置换缓冲液。置换后的纯化蛋白经肠激酶剪切后，再经过Ni Sepharose亲和层析流穿液即为最终制备的样品。
[0030]整个纯化工艺步骤衔接较好，上一步层析的洗脱液只需要稍微的调节便可作为下一步的层析上样液。减少中间处理步骤，便于工业化操作和减少中间操作带来的污染。
[0031 ] (9)重组蛋白的活性检测
体外细胞模型活性检测:脂质体顺转=Optiwcly 100 μ L中加入1.5 μ g/mL GLP-1R质粒和0.5yg/mL CRE/Luc置15min，加至HEK293细胞中，培养过夜。细胞铺于96孔板中(80*104个/mL)，过夜培养至90%-95%汇合度即可，每孔100 μ L。将培养基吸走，加入DMEM和药物的刺激液各100 μ L，孵育4h。吸走培养基，每孔加50 μ L裂解液，于水平摇床震荡30min。吸取30 μ L裂解液与配制好的15 μ L检测液混合，加入96孔板，摇床震荡15min，检测0D.。结果显示CHO表达的药物蛋白可以刺激胞内的cAMP含量提升并刺激荧光蛋白(Luc)的提高，结果见附图5。
[0032]体内活性检测:取体重22-25 g雄性KM小鼠50只，随机分为:正常组，Exendin-4组(0.125mg/Kg) ,GGH高剂量组(6.0 mg/kg)和低剂量组(3 mg/kg)。小鼠禁食(不禁水)过夜后，各组灌胃给药，正常组给生理盐水。3各组小鼠灌胃给予1.5 g/kg葡萄糖溶液后立刻尾静脉注射Exendin-4和不同剂量的GGH。注射后20、40、60 min、80 min、10min的血糖值。结果显示，相对于对照组，实验组的血糖水平长时间的得到控制，结果见附图6。
[0033] SEQ ID NO:1
ICACCACCACC ATCACCATGA TGACGATGAC AAGCACGGTG AAGGTACTTT CACTTCTGAT
61GTTTCTTCTT ACTTGGAAGG TCMGCTGCT AAGGAGTTCA TTGCTTGGTT GGTTAAGGGT
121AGACACGGTG AAGGTACTTT CACTTCTGAT GTTTCTTCTT ACTTGGAAGG TCAAGCTGCT
181AAGGAGTTCA TTGCTTGGTT GGTTAAGGGT AGAGATGCAC ACAAGAGTGA GGTTGCTCAT
241CGATTTAAAG ATTTGGGAGA AGAAAATTTC AMGCCTTGG TGTTGATTGC CTTTGCTCAG
301TATCTTCAGC AGTGTCCATT TGAAGATCAT GTAAAATTAG TGAATGAAGT AACTGAATTT
361GCAAAAACAT GTGTTGCTGA TGAGTCAGCT GAAAATTGTG ACAMTCACT TCATACCCTT
421TTTGGAGACA AATTATGCAC AGTTGCAACT CTTCGTGAM CCTATGGTGA AATGGCTGAC
481TGCTGTGCAA AACMGAACC TGAGAGAMT GAATGCTTCT TGCAACACAA AGATGACAAC
541CCAAACCTCC CCCGATTGGT GAGACCAGAG GTTGATGTGA TGTGCACTGC TTTTCATGAC
601AATGMGAGA CATTTTTGM AAAATACTTA TATGAAATTG CCAGAAGACA TCCTTACTTT
661TATGCCCCGG AACTCCTTTT CTTTGCTMA AGGTATMAG CTGCTTTTAC AGAATGTTGC
721CAAGCTGCTG ATAAAGCTGC CTGCCTGTTG CCAAAGCTCG ATGAACTTCG GGATGAAGGG
781AAGGCTTCGT CTGCCMACA GAGACTCAAG TGTGCCAGTC TCCMAAATT TGGAGAAAGA
841GCTTTCAAAG CATGGGCAGT AGCTCGCCTG AGCCAGAGAT TTCCCMAGC TGAGTTTGCA
901GMGTTTCCA AGTTAGTGAC AGATCTTACC AAAGTCCACA CGGAATGCTG CCATGGAGAT
961CTGCTTGAAT GTGCTGATGA CAGGGCGGAC CTTGCCAAGT ATATCTGTGA AAATCAAGAT
1021TCGATCTCCA GTAAACTGAA GGAATGCTGT GAMAACCTC TGTTGGAMA ATCCCACTGC
1081ATTGCCGAAG TGGMAATGA TGAGATGCCT GCTGACTTGC CTTCATTAGC TGCTGATTTT
1141GTTGAAAGTA AGGATGTTTG CMAAACTAT GCTGAGGCAA AGGATGTCTT CCTG GGCATG
1201TTTTTGTATG AATATGCAAG AAGGCATCCT GATTACTCTG TCGTGCTGCT GCTGAGACTT
1261GCCMGACAT ATGAAACCAC TCTAGAGMG TGCTGTGCCG CTGCAGATCC TCATGMTGC
1321TATGCCAMG TGTTCGATGA ATTTAAACCT CTTGTGGAAG AGCCTCAGAA TTTAATCAAA
1381CMAATTGTG AGCTTTTTGA GCAGCTTGGA GAGTACAAAT TCCAGAATGC GCTATTAGTT
1441CGTTACACCA AGAAAGTACC CCAAGTGTCA ACTCCAACTC TTGTAGAGGT CTCAAGAMC
1501CTAGGAAAAG TGGG CAGCAA ATGTTGTAAA CATCCTGAAG CAAAMGAAT GCCCTGTGCA
1561GAAGACTATC TATCCGTGGT CCTGMCCAG TTATGTGTGT TGCATGAGM AACGCCAGTA
1621AGTGACAGAG TCACCAAATG CTGCACAGM TCCTTGGTGA ACAGGCGACC ATGCTTTTCA
1681GCTCTGGAAG TCGATGAAAC ATACGTTCCC AMGAGTTTA ATGCTGMAC ATTCACCTTC
1741CATGCAGATA TATGCACACT TTCTGAGAAG GAGAGACAAA TCAAGMACA AACTGCACTT
1801GTTGAGCTCG TGAAACACAA GCCCAAGGCA ACAAMGAGC AACTGAMGC TGTTATGGAT
1861GATTTCGCAG CTTTTGTAGA GMGTGCTGC AAGGCTGACG ATAAGGAGAC CTGCTTTGCC
1921GAGGAGGGTA AAAAACTTGT TGCTGCAAGT CAAGCTGCCT TAGGCTTATA A SEQ ID NO:2
IHisHisHisHisHisHisAspAspAspAspLysHisGlyGluGlyThrPheThrSerAsp
21ValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIIeAlaTrpLeuValLysGly41ArgHisGlyGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAla
61LysGluPhelleAlaTrpLeuValLysGlyArgAspAlaHisLysSerGluValAlaHis
81ArgPheLysAspLeuGlyGluGluAsnPheLysAlaLeuValLeuIIeAlaPheAlaGln
101TyrLeuGlnGlnCysProPheGluAspHisValLysLeuValAsnGluValThrGluPhe
121AlaLysThrCysValAlaAspGluSerAlaGluAsnCysAspLysSerLeuHisThrLeu
141PheGlyAspLysLeuCysThrValAlaThrLeuArgGluThrTyrGlyGluMETAlaAsp
161CysCysAlaLysGlnGluProGluArgAsnGluCysPheLeuGlnHisLysAspAspAsn
181ProAsnLeuProArgLeuValArgProGluValAspValMETCysThrAlaPheHisAsp
201AsnGluGluThrPheLeuLysLysTyrLeuTyrGluIIeAlaArgArgHisProTyrPhe
221TyrAlaProGluLeuLeuPhePheAlaLysArgTyrLysAlaAlaPheThrGluCysCys
241GlnAlaAlaAspLysAlaAlaCysLeuLeuProLysLeuAspGluLeuArgAspGluGly
261LysAlaSerSerAlaLysGlnArgLeuLysCysAlaSerLeuGlnLysPheGlyGluArg
281AlaPheLysAlaTrpAlaValAlaArgLeuSerGlnArgPheProLysAlaGluPheAla
301GluValSerLysLeuValThrAspLeuThrLysValHisThrGluCysCysHisGlyAsp
321LeuLeuGluCysAlaAspAspArgAlaAspLeuAlaLysTyrIIeCysGluAsnGlnAsp
341SerlleSerSerLysLeuLysGluCysCysGluLysProLeuLeuGluLysSerHisCys
361IleAlaGluValGluAsnAspGluMETProAlaAspLeuProSerLeuAlaAlaAspPhe
381ValGluSerLysAspValCysLysAsnTyrAlaGluAlaLysAspValPheLeuGlyMET
401PheLeuTyrGluTyrAlaArgArgHisProAspTyrSerValValLeuLeuLeuArgLeu
421AlaLysThrTyrGluThrThrLeuGluLysCysCysAlaAlaAlaAspProHisGluCys
441TyrAlaLysValPheAspGluPheLysProLeuValGluGluProGlnAsnLeuIIeLys
461GlnAsnCysGluLeuPheGluGlnLeuGlyGluTyrLysPheGlnAsnAlaLeuLeuVal
481ArgTyrThrLysLysValProGlnValSerThrProThrLeuValGluValSerArgAsn
501LeuGlyLysValGlySerLysCysCysLysHisProGluAlaLysArgMETProCysAla
521GluAspTyrLeuSerValValLeuAsnGlnLeuCysValLeuHisGluLysThrProVal
541SerAspArgValThrLysCysCysThrGluSerLeuValAsnArgArgProCysPheSer
561AlaLeuGluValAspGluThrTyrValProLysGluPheAsnAlaGluThrPheThrPhe
581HisAlaAspIIeCysThrLeuSerGluLysGluArgGlnlIeLysLysGlnThrAlaLeu
601ValGluLeuValLysHisLysProLysAlaThrLysGluGlnLeuLysAlaValMETAsp
621AspPheAlaAlaPheValGluLysCysCysLysAlaAspAspLysGluThrCysPheAla
641GluGluGlyLysLysLeuValAlaAlaSerGlnAlaAlaLeuGlyLeu
【权利要求】
1.一种类似物蛋白质的设计方法，其特征为:蛋白序列结构为1-34-(-- ；其中I'代表的蛋白序列为生物亲和标签；3代表的蛋白序列为蛋白酶酶切位点3代表一个氨基酸而代表61？-1类似物蛋白出代表人血清白蛋白。
2.如权利要求1所述的设计方法，其特征为:1代表的蛋白序列为亲和标签蛋白序列，优先为！！18-1:叫、！！18-？1叫、'-1:叫、18？-1:叫、81:1-61)-1:88中的一种，但不仅局限于所列举的未和蛋白标签。
3.如权利要求1所述的设计方法，其特征为:3代表的蛋白序列为蛋白酶酶切位点的蛋白序列，优先为肠激酶酶切位点00001凝血酶酶切位点、凝血因子即12/0(?、烟草蚀纹病毒蛋白酶中的一种，但不仅局限于所列举的蛋白酶酶切位点。
4.如权利要求1所述的设计方法，其特征为4代表的氨基酸为以7、？1~0、紅8、％1、？116、丁印、161:、[78、八1已和I'口'中的一种；优先选择61丫、[78、八1已中的一种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征为，所设计的重组蛋白包含序列为以下的任何一种父-以迅和(--:1-8-66?是I'-3与以迅直接融合的蛋白，I'-为I'-3，X和(--按照权利1顺序融合的蛋白，为X与(--直接融合的蛋白，(--为61？~1类似物蛋白的二联体与人血清白蛋白的融合蛋白。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所设计的重组蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(:?)中进行表达，优选在(310-3细胞中悬浮培养表达。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，由高效表达质粒？腿3整合到(^0基因组中进行表达。
8.如权利要求6所述的方法，其特征为:培养表达的培养基为优化后高效表达的培养基，￠:?)细胞的贴壁培养基为0001，悬浮培养基为8001，流加培养基为？001 ；按照1:3比例放大培养悬浮细胞，最后在10 [生物反应器中连续发酵12山蛋白产率高达4.58-9.43 9 ^^10606118 ；发酵表达获得的重组蛋白，先通过81116亲和柱附层析，再经脱盐柱置换缓冲液，再通过肠激酶剪切后获得~端均一的重组蛋白。
9.如权利8所述的方法，其特征在于:制备获得的重组蛋白可用于2型糖尿病和通过降低血浆葡萄糖而受益的其它疾病的治疗；可用于诱导细胞分化为13胰腺细胞的1型糖尿病的治疗；可用于刺激神经系统产生饱腹感和抑制胃蠕动而受益的其他疾病。
【文档编号】C07K19/00GK104403005SQ201410699879
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】金坚, 钱凯, 龚笑海, 马鑫, 朱瑞宇, 蔡燕飞, 陈蕴 申请人:江南大学, 无锡鑫连鑫生物医药科技有限公司