专利名称：人体胎盘核酸的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物。
目前国外有文献报导从植物或动物胎盘中提取核酸，即主要成分为脱氧核糖核酸DNA，其提取方法一般是参照Bellard法(Bellard MG et al.Isolation of highmolecular weight DNA form mammalian cells.Eur J Biochem 1973;36∶32)组织均浆离心后分离出的细胞核经裂解后用酚、氯仿、异戊醇除蛋白、钝化、乙醇沉淀最后制得的。其不足之处是该方法制得的核酸制品不纯，而且操作复杂，需消耗大量的有机溶剂。
鉴于上述现有技术中的不足之处本发明的目的在于提供一种能节省原材料简便地制备高纯度核酸的方法。
本发明的目的可通过以下措施来实现一种人体胎盘核酸的制备方法，其特征在于a、原料及其处理取人的新鲜胎盘在-10℃～70℃迅速冷冻，并在-4℃～-10℃去除脐带、胎膜及结缔组织，b、破碎胎盘组织在-4℃～-10℃加入有如下摩尔体积比的提取液A即Tris-HCl∶EDTA∶NaCl＝5∶1∶1(mol/L)，其加入量是胎盘体积的5～10倍，然后置于高速匀浆器中匀浆，过滤，向滤液中加入10%的且为滤液体积1/100的SDS，并用10%～20%的NaOH将混合物的PH值调至8～10，在室温下搅拌1～2小时，c、提取核酸向上述裂解液中加入等体积的新蒸酚与提取液A的体积比为70～75∶30～25的饱和酚，混合均匀后在2～4℃下离心20～40分钟，取上清液再向其内加入等体积饱和酚多次反复操作。d、提取核酸的处理将提取的上清液置于备有电磁搅拌的透析袋内，于4℃下用流动蒸馏水作为透析外液，经过3～4天后更换成有如下摩尔体积比的Tris-HCl∶EDTA∶Nacl＝1∶1∶1的静止透析外液E，透析2～3天即可得到脱氧核糖核酸，采用上述人胎盘核酸可制备人胎盘核酸口服营养液，其组成如下人胎盘核酸 10～50%(V/V)蔗糖 5～8克/100毫升香料 0.1～0.5毫升/100毫升余下量为水。
采用上述人胎盘核酸可制备人胎盘核酸化妆品，其组成如下人胎盘核酸 5～30%(V/V)余下量为载体透析袋为玻璃纸。
本发明的方法主要包括如下过程1.原料及其处理本发明的原料为健康人的新鲜胎盘，取出后在-10℃～-70℃迅速冷冻，并在-4℃～-10℃去除脐带、胎膜及结缔组织以防止其酶解变性保持核酸稳定，使最终的核酸制品纯度较高。
2.破碎胎盘组织在-4℃～-10℃条件下加入提取液A，该提取液是由Tris-HCl(PH5～8)、EDTA和NaCl组成的混合物，它们之间有如下比例关系，即Tris-HCl∶EDTA∶Nacl＝5∶1∶1(mol/L)。而该提取液A的加入量与胎盘之间有如下比例关系，即胎盘∶提取液A＝1∶5～10(体积比)。将胎盘与提取液A置于高速匀浆器中匀浆，所得产物经过滤除去胎盘中的结缔组织及纤维等残渣为下面的提取提供方便条件，向滤液中加入10%的SDS，其加入量与滤液的比例关系为滤液∶SDS＝100∶1(体积比)。用10%～20%的NaOH调整混合物的PH值使之PH在8～10之间，最好是PH在8.5～9之间以使细胞膜完全破裂。然后在室温下搅拌1～2小时，得到的即为组织裂解液。
3.提取核酸向上述组织裂解液中加入等体积饱和酚，其是由新蒸酚和提取液A组成的，它们之间的比例关系为新蒸酚∶提取液A＝70～75∶30～25(V/V)。在室温下将它们混合均匀，然后在2℃～4℃下离心20～40分钟，取上清液向其内再加入等体积饱和酚，混匀后再次离心反复操作至界面无蛋白为止。
4.提取核酸的处理将提取的上清液置于透析袋中，该透析袋最好为玻璃纸袋，其内备有电磁搅拌，于4℃下采用流动蒸馏水作为透析外液。经过3～4天透析后将透析外液换成静止溶液E，其是由Tris-HCl(PH5～8)、EDTA和NaCl组成的混合物，它们之间的比例关系为Tris-HCl∶EDTA∶NaCl＝1∶1∶1(mol/L)。仍在4℃下透析2～3天，每日更换透析液两次。用紫外分光度法测定透析外液有机溶剂的含量，当在270nm时光密度为0.05～0.10即为透析终点，所得到的透析袋内的液体主要为脱氧核糖核酸DNA，还有少量的核糖核酸RNA。
采用上述人胎盘核酸可制备口服营养液，其除含有人胎盘核酸外还外加有蔗糖、少许香料及水。该营养液的具体组成如下人胎盘核酸含量为 10～50%(V/V)蔗糖含量为 5～8克/100毫升香料含量为 0.1～0.5毫升/100毫升余下量为水。
采用上述人胎盘核酸还可制备核酸化妆品，其除含有人胎盘核酸外还含有载体，其可以是乳化剂也可以是奶液或常规的润肤霜。该化状品的具体组成如下人胎盘核酸 5～30%(V/V)余下部分为载体。
本发明相比现有技术具有如下优点
1.该核酸制品较植物及动物胎盘核酸易被人体吸收。
2.该核酸制品纯度高。
3.操作方法简便、节省费用、特别是核酸提取的后处理采用透析方法取代现有的乙醇沉淀法，不仅省去反复溶解固体的麻烦，使操作变得简单，而且还节省了是所得核酸二倍数量的乙醇溶剂。
4.用本发明方法制取的核酸化妆品对人体没有过敏反应，也没有小分子激素的副作用，抗衰老、除皱、去老年斑。
图面说明如下
图1是本发明核酸纯度的电泳图。
图2是使用普通化妆品后皮肤组织切片的显微镜图片。
图3是使用含牛DNA化妆品后皮肤组织切片的显微镜图片。
图4是使用含人DNA化妆品后皮肤组织切片的显微镜图片。
在图1所示的本发明核酸纯度的电泳图中，用0.7%琼脂糖凝胶电泳，其电压2V/cm电泳2小时，EB染色紫外灯下摄片。本发明所得核酸为均一的大分子，如图中标号2、3所示，光束基本集中在左侧。以入DNA被限制性内切酶HindⅢ水解片段作分子量标准如标号1所示未见RNA条带。而胎盘未经低温冷冻提取的核酸如图中标号4、5所示光束呈带状，显示出内含不同大小的DNA分子。
在图2、图3和图4所示的皮肤组织切片的显微镜图片中，使用普通润肤霜皮肤表皮很薄，使用含牛DNA化妆品后皮肤表皮稍有增厚，使用含人DNA化妆品皮肤表皮明显增厚。
实施例1取健康人的新鲜胎盘在-10℃～-70℃下迅速冷冻，并在-4℃～-10℃去除脐带、胎膜及结缔组织后称重500克。又在-4℃～-10℃条件下向胎盘中加入由Tris-HCl(PH5-8)、EDTA、NaCl组成的提取液A，其中Tris-HCl为50mmol/L、EDTA10m mol/L、Nacl 10mmol/L。将胎盘与提取液A置于高速匀浆器中匀浆，将所得浆状物用纱布过滤除去滤饼。向滤液中加入10%的SDS使之终浓度为1%时为止。并用20%的NaOH将混合物的PH值调8.5～9之间。然后在室温下搅拌1～2小时，向所得产物中加入等体积的饱和酚，其新蒸酚与提取液A之间的比例关系为70∶30(V/V)在室温下充分混合均匀于2℃～4℃高速冷冻离心机(6000rprn)离心20分钟，取上清液向其内再加入等体积饱和酚，反复操作至界面无蛋白为止。将提取的上清液置于玻璃纸透析袋中，袋内设有电磁搅拌于4℃采用蒸馏水进行流水透析。经过3～4天后将透析液更换成溶液E，它是由10mmol/L的Tris-HCl(PH5～8)，10mmol的EDTA、10mmol/L的NaCl组成的混合物。仍在4℃透析2～3天，每日更换透析液2次。用uv-240紫外分光光度仪测定透析外液有机溶剂含量在270nm光密度0.05～0.10为反应终点，袋内的液体也经紫外分光度仪测定DNA纯度90%以上。然后用二苯胺法测定DNA的含量占96.8%，用地依酚法测定RNA的含量占2.3%，用Lowry法测定蛋白质含量占0.8%，其它成份为0.1%。
实施例2人胎盘核酸口服营养液的制备取10毫升的人胎盘核酸、5克的蔗糖、0.5毫升香料及100毫升水在搅拌条件下均匀混合得到外观为无色胶体的溶液，即为人胎盘核酸口服营养液。
实施例3重复例2的操作，其中人胎核酸为50毫升，蔗糖8克、香料0.1毫升，可得到高浓度的人胎盘核酸口服营养液。
实施例4人胎盘核酸化妆品的制备取5毫升人胎盘核酸将其置于100毫升乳化剂中，搅拌使之混合均匀，可得到乳白色半流动性膏状物。
实施例5重复例4的操作，其中人胎盘核酸为30毫升，将其与润肤霜混合，可得到乳白色的膏状物。
人胎盘核酸化妆品的应用效果对比试验结果一、动物试验取三只家兔，于左右侧大腿处剪毛，将皮肤消毒后分别抹药。(1)高浓度组(核酸占20%)(2)低浓度组(核酸占5%)(3)对照组(蒸馏水)每处皮肤约2厘米2一天涂两次共15天。16天取下各处皮肤每块约2厘米2固定于10%福尔马林中，经石蜡包埋切7μm厚度的切片、苏木紫和伊红染色、显微镜(100倍)观察摄片，结果如下对照组 给予DNA低浓度组 给予DNA高浓度组表皮细胞层 很薄 细胞层增厚 明显增厚腺体 少见 增多 明显增多真皮乳头 低平 增高 明显增高基底层细胞 扁平细胞 立方形 立方形组排列紧密二、人体试验中年妇女使用含核酸的化妆品后皮肤的变化85%的人试用两周后感觉面部滋润、皱纹变浅、皮肤细腻。15%的人试用两周后感觉比其它护肤霜更滋润皮肤。
人胎盘核酸口服液的应用效果实验数据一、人红细胞LPO与SDD水平及核酸制剂对该指标的影响分组n LPO SOD SOD/LPO(nmol/mgg.Pr) (u/mg.Pr)青年对照组 12 0.8～0.9 17.37～19.03 19.82～23.16初 服核酸前 12 1.01～1.31 13.52～15.84 10.9～14.7老年 服核酸后 9 0.93～1.11 15.16～16.42 13.86～17.62组从上表可以看出老年组红细胞LPO水平较青年组明显增高，SOD比赛活性则较高青年组为低，SOD/LPO比值显著降低，老年组服用核酸20天后SOD/LPO比值明显提高。
二、核酸制剂对大鼠红细胞LPO及SOD水平的影响分组 n LPO SOD SOD/LPO(nmol/mg.Pr) (u/mg.Pr)幼年对照组 9 0.97～1.13 13.10～14.52 11.39～14.35(生理盐水)老年对照组 9 1.14～1.64 9.21～10.41 6.0～8.48(生理盐水)老年核酸组 9 0.86～1.32 11.86～12.96 9.32～14.58(注射DNA制剂22天)从上表可以看出，老年组大鼠红细胞LPO水平明显高于幼年组，SOD活性则低于幼年组，SOD/LPO比值显著降低。老年鼠用该制剂3周后SOD/LPO比值与对照组有明显提高。
检验方法1.二苯胺法测定DNA的含量。
<遗传学实验方法和技术>吴鹤龄 林锦明著高等教育出版社 1983;68～712.地依酚法测定RNA的含量(同上)3.Lowry法测定蛋白质的含量Lowry OH et al.J Biol Chem 1951;193∶265。
权利要求
1.一种人体胎盘核酸的制备方法，其特征在于a、原料及其处理取人的新鲜胎盘在-10℃～70℃迅速冷冻，并在-4℃～-10℃去除脐带、胎膜及结缔组织，b、破碎胎盘组织在-4℃～-10℃加入有如下摩尔体积比的提取液A即Tris-HCl∶EDTA∶NaCl=5∶1∶1(mol/L)，其加入量是胎盘体积的5～10倍，然后置于高速匀浆器中匀浆，过滤，向滤液中加入10%的且为滤液体积1/100的SDS，并用10%～20%的NaOH将混合物的PH值调至8～10，在室温下搅拌1～2小时，c、提取核酸向上述裂解液中加入等体积的新蒸酚与提取液A的体积比为70～75∶30～25的饱和酚，混合均匀后在2～4℃下离心20～40分钟，取上清液再向其内加入等体积饱和酚多次反复操作。d、提取核酸的处理将提取的上清液置于备有电磁搅拌的透析袋内，于4℃下用流动蒸馏水作为透析外液，经过3～4天后更换成有如下摩尔体积比的Tris--HCl∶EDTA∶NaCl=1∶1∶1的静止透析外液E，透析2～3天即可得到脱氧核糖核酸。
2.一种人体胎盘核酸的应用，其特征在于采用上述人胎盘核酸可制备人胎盘核酸口服营养液，其组成如下人胎盘核酸 10～50%(V/V)蔗糖 5～8克/100毫升香料 0.1～0.5毫升/100毫升余下量为水。
3.一种人体胎盘核酸的应用，其特征在于采用上述人胎盘核酸可制备人胎盘核酸化妆品，其组成如下人胎盘核酸 5～30%(V/V)余下量为载体
4.根据权利要求1所述的人体胎盘核酸的制备方法，其特征在于透析袋为玻璃纸。
全文摘要
一种人体胎盘核酸的制备方法，其主要是取新鲜胎盘在-10℃～-70℃迅速冷冻，并在低温下破碎胎盘组织，提取核酸是采用透析方法，首先采用蒸馏水作为透析外液，然后再更换成有如下比例关系的Tris-HCl∶EDTA∶NaCl＝1∶1∶1的静止透析外液E。该方法简单、节省溶剂，提取出的核酸成本低、纯度高，采用本发明方法的核酸可制成没有过敏反应也没有激素的去皱除斑的核酸化妆品，还可以制成抗衰老的人胎盘核酸口服营养液。
文档编号C07H21/04GK1093711SQ9311104
公开日1994年10月19日 申请日期1993年4月9日 优先权日1993年4月9日
发明者崔秀云 申请人:大连医学院