专利名称：人胚胶原蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种从动物体中提取的胶原蛋白及其制备方法。
胶原蛋白是一类具有活跃生物功能的动物细胞外间质成份，是人体或其它动物体蛋白质总量的25-30%，它是结缔组织的主要成份。用胶原作软组织修复，是整形外科领域的一大发展。以胶原为原料制作的生物制品，在外科手术中，应用于创伤和烧伤修复、整形整各、神经生长及血管瓣膜等。优于非生物材料的同类产品;如可溶性胶原、不溶性胶原以及和非胶原物质组成的复合物等材料可用于制备胶原溶液、胶原膏剂、胶原薄膜、胶原缝线等。由于这类生物制品具有与宿主软组织胶原成份相同;与宿主软组织接触面是结缔组织的结合，而无明显的包块;移殖后的组织外形硬度与宿主相近及容易消毒等特点，比起已往应用的金属、陶瓷及化学合成材料等，具有突出的优点。因此受到人们的关注，美国已正式应用于临床。据有关资料报导，世界上已有30万人接受过胶原治疗，这些胶原是从牛、羊及猪等动物的皮或其它脏器中提取的，应用于人体属异种蛋白，存在着过敏反应的可能性及排斥反应的危险，使其应用上受到很大的限制，尤其是作为一种美容、整形的生物填充材料，其潜在危害就更为明显。从死去人体的皮肤或其它脏器可提取胶原蛋白作为生物制品的原料，有可能克服上述异种蛋白对人体的排斥性，但由于传统的习惯或社会因素，目前尚难以实现。
为克服现有技术中，从牛、羊、猪的皮或其它脏器提取的异种蛋白存在的可能排斥等缺点，本发明的目的是根据中国的国情，选用中引人胚皮肤为提取胶原蛋白原料，提供一种对人体无过敏性的胶原蛋白及其先进的可以工业化生产的制备方法，从而有效地为解决胶原蛋白在人体的治疗应用方面，开创一条新路。
本发明的内容是以是中引胎儿皮肤为原料提取的人胚胶原蛋白，它是通过两步法除杂质及杂蛋白，提高纯度;及酸解、酶解双解法提高产量及层析柱进一步纯化胶原蛋白实现的。
其工艺流程如下
本发明的人胚胶原蛋白生产工艺步骤详细说明如下(1)原料处理及去杂蛋白(1、1)取合法中引胎儿皮肤除去皮下脂肪及表皮，称湿重，以0.05%洗必泰消毒3分钟，剪成1mm3碎块，生理盐水冲洗2遍，(1、2)加入3-5倍于组织碎块总体积的丙酮脱脂1-2天，回收废丙酮，生理盐水冲洗2遍，以PH为6.4-6.8的磷酸缓冲液浸泡去残余丙酮，去掉上清液，得到脱脂的组织块，(1、3)在组织块中加入含0.5-1.5摩尔的NaCL的0.03-0.07摩尔的Tris/HCl(PH7.4-7.6)溶液浸泡4天，除去非胶原性杂质，加入量为脱脂组织块体积的3-5倍，定时振摇4-6次/日，4天后去上清液得胶原蛋白块。
所取合法中引的胎儿皮肤，是指生长4-8个月中引的胎儿离母体后6小时内的胎儿鲜皮肤，或中引离母体后在-20℃冰冻6个月以内的胎儿皮肤。最好是6-8个月的中引胎儿皮肤。所述的含0.5-1.5摩尔的NaCl的0.03-0.07摩尔的Tris/HCl(PH7.4-7.6)是指在0.03-0.07摩尔的Tris溶液中加入0.5-1.5摩尔的NaCl，再用HCl调至溶液的PH值为7.4-7.6。最好选用含1摩尔NaCl的0.05摩尔Tris/HCl(PH7.5)溶液。
(2)粗提(2.1)在胶原蛋白块中，按1克组织块湿重加入0.1-1.5摩尔的乙酸溶液150-10000毫升浸泡3-5天。每天定时振摇4-6次/日;
(2.2)在酸解液中按胃蛋白酶(重量)组织块湿重为1∶50-150加入所需量的胃蛋白酶，匀浆3分钟，然后在18℃-20℃条件下，提取1-5天，得酶解液，用高速离心机以10000-20000转/分，离心分离30分钟，取上清液;
(2.3)加入NaCl至1.5-3摩尔，盐析出白色絮状物，将盐析液再离心30分钟，取沉淀，即为人胚胶原蛋白粗品;
所述加入乙酸溶液最佳浓度为0.5摩尔，最佳加入量为400毫升。胃蛋白酶与组织块最佳比例为1∶100(重量)加入NaCl盐析的最佳浓度为2.5摩尔浓度。
(3)精提;
(3.1)在沉淀中加入10-50倍体积的0.1-1摩尔乙酸水溶液，混匀，浸泡3-5天，定时振摇4-6次/日，滤去杂质;
(3.2)清液放入透析袋内，冷蒸馏水透析3天，每天更换透析液2次;
(3.3)将透析浓缩液通过羧甲基纤维素柱CM32层析，第一次收集层析柱的层析柱液;
(3.4)再通过CM52层析柱收集第二次层析柱液，即得到人胚胶原蛋白纯品。
(3.5)所述加入的乙酸溶液的浓度最好是0.5摩尔，最佳加入量是沉淀的20-30倍，CM32、CM52均为纯品羧甲基纤维柱的不同规格层析柱。
(4)交联(4.1)纯化后的胶原溶液中加入戊二醛至溶液浓度为0.006-0.1%，混匀，在15°-18℃放置16小时;
(4.2)用磷酸缓冲液漂洗5-7次，浓缩至规定浓度，分装、灭菌即得成品。
上述操作过程除注明外，均在4℃灭菌条件下进行，磷酸缓冲液的PH值为7.4-7.6，离心速度以13000转/分为最佳。所用试剂为市售(分析纯)产品。
所得到的人胚胶原蛋白为乳白色或微黄色粘稠液，冰干后为白色粉末。经测定分子量30万道尔顿(SDS-PAGE电泳分析)紫外吸收230nm氨基酸含量甘氨酸36%，脯氨酸10.9%，羟脯氨酸11.2%，羟赖氨酸0.5%。
胶原浓度25-65毫克/毫升本发明的人胚胶原蛋白由于采用了两步法(NaCl Tris法及乙酸)除去杂质及杂蛋白使其纯度较高，经酸解、酶解分解后进一步提高产品中氨基酸含量，并且用羧甲基纤维素柱CM32、CM52分离纯化，使分离产品，具有纯度高且产量高的特点，使其完全可较大规模生产，提供可应用的人胚胶原蛋白产品，并经实验证实了应用人胚胶原蛋白不产生免疫反应，而异种胶原蛋白则难以避免。综上所述，根据国外文献，基础实验资料以及我们自己的实验结果，人胚胶原蛋白与异体胶原蛋白相比，在人体内应用具有更大的安全性。
动物实验及结果本实验分别用猪真皮戊二醛交联胶原(美国Pato Alto eu胶原公司)，自制人胚戊二醛交联胶原作为组织缺损的填充材料，以观察炎症、免疫排斥反应及填充是否成功。
实验动物用雄性日本大耳白兔20只(体重2-2.5公斤)，随机分成2组，实验前剪去右侧背部毛，不经麻醉，以碘酒、酒精消毒皮肤，做皮肤切口，分别将两种胶原100mg放入皮下，皮肤缝合。
观察方法及结果见表。
结果猪皮胶原10例中有2例失败。
人胚胶原均成功。
实例11、取新鲜(离母体4小时)合法中引胎儿皮肤、除去皮下脂肪及表皮，称湿重10克，用0.05%洗必泰消毒3分钟，剪成1mm3碎块。生理盐水冲洗2遍，加入丙酮30毫升，脱脂2天，每天定时振摇3-5次，回收废丙酮，生理盐水冲洗2遍，磷酸缓冲液(PH6.8)40毫升浸泡2小时，去掉上清液，组织块中加入含1摩尔NaCl/0.05摩尔Tris/HCl(PH7.5)50毫升，每日定时振摇4-6次，4天后弃上清液，得胶原蛋白块。
2、粗提胶原蛋白块中加入0.5摩尔乙酸4000毫升，浸泡4天，每天定时振摇4-6次，4天后加入胃蛋白酶200毫克，18℃提取4天，4天后离心(4℃13000转/分30分钟)，取上清液加入NaCl至2摩尔，盐析出白色絮状物，静置2小时，离心(4℃13000转/分钟)取沉淀。
3、精提在沉淀中加入0.3摩尔乙酸40毫升，混匀，浸泡4天，每天定时振摇4-6次，滤去杂质，将上清液放入透析袋内，用冷蒸馏水透析3天，每天换透析液2次，透析后收集，通过CM32柱层析的柱液，再过CM52柱层析，收集柱液，即得人胚胶原蛋白纯品。
4、交联向纯化后胶原溶液中加入已预处理(将市售25-280%戊二醛经常压蒸馏提纯)的戊二醛至0.01%，混合过液(15℃18小时)，用磷酸缓冲液(PH)漂洗6次，浓缩至70毫升(胶原浓度含量40毫克/毫升)，分装、灭菌即得成品。
实例2方法步骤同例1，组织块湿重10克。
2、粗提时加1摩尔乙酸。
3、精提时加0.5摩尔30毫升乙酸。
4、交联加戊二醛至0.008%混合过液(15℃20小时)磷酸缓冲液漂洗7次，浓缩至100毫升(胶原浓度30毫克/毫升)。
权利要求
1.一种胶原蛋白，其特征是以人胚皮肤为原料提取的人胚胶原蛋白。
2.如权利要求1所述的胶原蛋白，其特征是所述人胚是4-8个月的中引人胚。
3.一种制备权利要求1所述的胶原蛋白的方法，其特征是通过两步法除杂提纯，双解法提高产量，其具体工艺步骤如下(1)原料处理及去杂蛋白(1、1)取中引胎儿皮肤，除去皮下脂肪及表皮，称湿重，以0.05%洗必泰消毒，剪碎，生理盐水冲洗遍，(1、2)加入3-5倍(体积)的丙酮，脱脂1-2天，用生理盐水冲洗，以PH为6.4-6.8的磷酸缓冲液浸泡去残余丙酮，去上清液，(1、3)在组织块中加3-5倍(体积)的含0.5-1.5摩尔的NaCl的0.03-0.07摩尔的Tris/HCl(PH7.4-7.6)溶液浸泡4天，振摇4-6次/日，取上清液，(2)粗提(2.1)按1克组织块湿重加入0.1-1.5摩尔的乙酸溶液150-10000毫升浸泡3-5天，振摇4-6次/日;(2.2)按胃蛋白酶(重量)组织块湿重为1∶50-150加入胃蛋白酶，匀浆在18℃-20℃条件下，提取1-5天，离心，取上清液;(2.3)加入NaCl至1.5-3摩尔浓度，盐析出白色絮状物，离心，取沉淀;(3)精提;(3.1)加入10-50倍体积的0.1-1摩尔的乙酸溶液，混匀，浸泡3-5天，滤去杂质;(3.2)上清液放入透析袋内，冷蒸馏水透析3天，每天更换透析液2次;(3.3)透析浓缩液通过羧甲基纤维素柱CM32层析收集柱液;(3.4)将(3.3)柱液过CM52，收集柱液，(4)交联(4.1)在(3.4)所得柱液中加入戊二醛至浓度为0.006-0.1%，混匀，在15°-18℃放置16小时;(4.2)用磷酸缓冲液(PH6.4-6.8)漂洗5-7次，浓缩至规定浓度，所述操作过程，除注明外，均在4℃无菌条件下进行，离心转速13000-20000/分。
4.如权利要求3所述的制备胶原蛋白的方法，其特征在于(1.1)所述的中引胎儿皮肤是指6-8个月胎儿皮肤。
5.如权利要求3、4所述的制备胶原蛋白的方法，其特征在于所述的中引胎儿皮肤，最好是6-8个月的胎儿皮肤。
6.如权利要求3所述的制备胶原蛋白的方法，其特征在于(1.3)所述加入的NaCl Tris/HCl溶液，最好是含1摩尔NaCl的0.5摩尔的Tris/HCl(PH7.5)溶液。
7.如权利要求3所述的制备胶原蛋白的方法，其特征在于所述(2.1)加入乙酸溶液的最佳浓度为0.5摩尔，最好加入量为400毫升。
8.如权利要求3所述的制备胶原蛋白的方法，其特征在于(2.2)所述胃蛋白酶与组织块湿重的最佳比例为1∶100。
9.如权利要求3所述的制备胶原蛋白的方法，其特征在于所述(3.1)加入乙酸溶液浓度最好是0.5摩尔，最佳加入量是沉淀的20-30倍。
10.如权利要求3所述的制备胶原蛋白的方法，其特征在于(2.3)所述加NaCl最好加至2.5摩尔浓度。
11.如权利要求3所述制备胶原蛋白的方法其特征在于所述的离心速度以13000为最佳。
全文摘要
本发明涉及一种以中引胎儿皮肤为原料的人胚胶原蛋白，用于制作生物制品，应用于创伤和烧伤修复，整形整容、神经长和及血管瓣膜等外科手术治疗中，优于现已应用的金属、陶瓷和化学合成材料，并可克服从牛、羊等动物体为原料的胶原所带来的过敏和排斥缺点。并提供了一种由两步法除杂质及杂蛋白的纯化和双解法提高产量的生产工艺，从而为胶原蛋白在人体的治疗应用方面，开创一条新路。
文档编号C07K14/78GK1105670SQ9410005
公开日1995年7月26日 申请日期1994年1月5日 优先权日1994年1月5日
发明者段和平 申请人:段和平