专利名称：水溶性三尖杉磷碱聚氨基酸酯或其盐,含它们的药物组合物及其医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及水溶性三尖杉磷碱聚氨基酸酯或其盐，尤其是三尖杉磷碱聚谷氨酸酯或其碱金属盐或三尖杉磷碱聚天冬氨酸酯或其碱金属盐，含它们的药物组合物及其医药用途，尤其是在抗肿瘤中的用途。
红豆杉是一种珍稀植物，从红豆杉植物中可提取一系列紫杉烷类化合物且其中大部分具有抗肿瘤活性。目前运用及研究最多的紫杉烷类化合物是紫杉醇，它在乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、食管癌、头颈部癌等癌种的治疗方面显示出较好的疗效，现已广泛用于临床。但是，由于紫杉醇的水不溶性(紫杉醇在水中的溶解度小于0.004mg/ml)，使其应用很不方便，同时，现有的紫杉醇助溶剂-聚氧乙基代蓖麻油的毒副作用比较严重，容易诱发过敏等症状。另外，紫杉醇在对除乳腺癌、卵巢癌有较好疗效外，对其它类型肿瘤的作用由于疗效低或细胞毒性选择性低或严重毒副作用而受到极大限制。三尖杉磷碱(又名紫杉醇B)作为一个紫杉烷类化合物单体已从红豆杉中分离出来，但其水溶性很差，其不溶于水，故其药用开发受到很大限制。因此寻找有更高水溶性且抗肿瘤谱广的水溶性紫杉烷类衍生物仍是十分迫切和需要的。
本发明的目的是寻找具有优良水溶性及抗癌谱广的紫杉烷类衍生物。
本发明人经研究现已发现三尖杉磷碱的聚氨基酸酯或其盐，尤其是三尖杉磷碱聚谷氨酸酯或聚天冬氨酸酯或它们的碱金属盐或碱土金属盐，显示出明显提高的水溶性，广泛的抗癌谱尤其是抗鼻咽癌、肺癌和极低的毒性。本发明基于以上发现而得已完成。
本发明第一方面涉及的是通式Ⅰ三尖杉磷碱的聚氨基酸酯或其盐， 其中R1和R2可相同或不同且独立为聚氨基酸或H，M不存在或存在且为碱金属或碱土金属阳离子，条件是R1和R2不能同时为氢。
本发明另一方面涉及的是药物组合物，其包括通式Ⅰ三尖杉磷碱-聚氨基酸酯或其盐及药用载体， 其中R1和R2可相同或不同且独立为聚氨基酸或H，M不存在或存在且为碱金属或碱土金属阳离子，条件是R1和R2不能同时为氢。
本发明再一方面涉及式Ⅰ三尖杉磷碱的聚氨基酸酯或其盐在制备用于治疗癌症或与自身免疫缺陷有关疾病的药物中的用途， 其中R1和R2可相同或不同且独立为聚氨基酸或H，M不存在或存在且为碱金属或碱土金属阳离子，条件是R1和R2不能同时为氢。本发明涉及式Ⅰ三尖杉磷碱的聚氨基酸酯或其盐， 其中R1和R2可相同或不同且独立为聚氨基酸或H，M不存在或存在且为碱金属或碱土金属阳离子，条件是R1和R2不能同时为氢。
根据本发明，本发明式Ⅰ三尖杉磷碱的聚氨基酸酯或其盐具有良好的水溶性且于25℃的水溶解度＞75mg/ml，例如三尖杉磷碱聚谷氨酸酯钠的水溶解度为88mg/ml(25℃)。
根据本发明，本发明的式Ⅰ三尖杉磷碱的聚氨基酸酯或其盐的毒性很低，它们在小鼠急性毒性试验中经腹腔给药表明它们的LD50(半数致死量)为2000-3500mg/kg，例如，三尖杉磷碱聚谷氨酸酯钠的LD50为2900mg/kg。
根据本发明，本发明所用术语“聚氨基酸”中氨基酸选自天然或非天然氨基酸，优选谷氨酸和天冬氨酸。上述天然或非天然氨酸包括其D-，L-或DL构型。
根据本发明，本发明所用聚谷氨酸或聚天冬氨酸或它们的盐的分子量为12，000-60，000，优选15，000-50，000，更优选22，000-40，000。
根据本发明，本发明所用术语“碱金属“选自锂、钠或钾。所用术语“碱土金属”选自钡、钙或镁。
根据本发明，本发明优选的式Ⅰ化合物选自如下三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯，三尖杉磷碱2＇-聚天冬氨酸酯，三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯，三尖杉磷碱2＇，7-聚天冬氨酸酯，三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯，三尖杉磷碱7-聚天冬氨酸酯，三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇-聚天冬氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇，7-聚天冬氨酸酯钠，三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱7-聚天冬氨酸酯钠。
根据本发明，本发明式Ⅰ化合物更优选为下面的化合物三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯钠。
根据本发明，本发明的式Ⅰ三尖杉磷碱聚氨基酸酯或其盐可按本领域已知方法制备。例如可通过将三尖杉磷碱(可从市售得到或得自中国云南汉德生物技术有限公司)与聚氨基酸或其碱金属或碱土金属盐反应制备本发明式Ⅰ三尖杉磷碱聚氨基酸酯或其盐，或通过将三尖杉磷碱与聚氨基酸反应制得三尖杉磷碱聚氨基酸酯，然而根据需要，将三尖杉磷碱聚氨基酸酯与碱金属或碱土金属的氢氧化物，碳酸盐或碳酸氢盐反应，制得三尖杉磷碱氨基酸酯碱金属或碱土金属盐。
根据本发明，本发明药物组合物包括式Ⅰ三尖杉磷碱聚氨基酸酯或其盐及药用载体。
根据本发明，本发明药物组合物中三尖杉磷碱聚氨基酸酯或其盐优选为下面一组化合物三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯，三尖杉磷碱2＇-聚天冬氨酸酯，三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯，三尖杉磷碱2＇，7-聚天冬氨酸酯，三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯，三尖杉磷碱7-聚天冬氨酸酯，三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇-聚天冬氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇，7-聚天冬氨酸酯钠，三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱7-聚天冬氨酸酯钠。
根据本发明，本发明式Ⅰ化合物更优选为下面的化合物三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯钠。
根据本发明，本发明药物组合物可按本领域已知方法制备并可通过口服或非肠道途径给药。其中口服给药剂型可为片剂、胶囊剂等，非肠道给药剂型可为注射剂。
根据本发明，本发明的三尖杉磷碱聚氨基酸酯或其盐可用于制备用于治疗癌症或与自身免疫缺陷有关疾病的药物。其中所用的三尖杉磷碱聚氨基酸酯或其盐优选下面一组化合物三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯，三尖杉磷碱2＇-聚天冬氨酸酯，三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯，三尖杉磷碱2＇，7-聚天冬氨酸酯，
三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯，三尖杉磷碱7-聚天冬氨酸酯，三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇-聚天冬氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇，7-聚天冬氨酸酯钠，三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱7-聚天冬氨酸酯钠。
根据本发明，本发明式Ⅰ化合物更优选为下面的化合物三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯钠。
根据本发明，其中术语“癌症”可例如是鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、食道癌、结肠癌、恶性黑色素瘤、头颈部癌和白血病等。
根据本发明，其中术语自身免疫缺陷疾疾可例如是类风湿性关节炎，自身免疫性肾病等。
下面的实施例用于进一步说明和描述本发明，但并不意味着本发明仅限于此。
实施例1三类杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯制备将640mg三尖杉磷碱溶于130ml乙腈中，加入分子量为25000的聚谷氨酸6.2g，再加入120mg二甲基氨基吡啶，在25℃下搅拌9小时，然后在表压-0.05MPa、温度50℃下抽于溶剂，再将所得的固形物上硅胶柱进行色谱分离，以乙腈∶水=25∶75的溶液为洗脱剂，最终得三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯6.1g。
所得产品经定量测定，三尖杉磷碱含量为9.90％。
IR(KBr)cm-13450，2919，2360，1652，1558，1403，1230，650。
紫外吸收λmax=230nm，ε=29800，λmax=275nm，ε=1700。
1HNMRδ(ppm)=7.77-7.36，6.38，5.97，5.63，5.55-5.36，5.10，4.36，4.10，1.97，1.18-1.20。
实施例2三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯制备称取分子量为25000的PGA(聚谷氨酸)500mg，溶于50mlDMF(二甲基甲酰胺)，加入三尖杉磷碱150mg，再加入50mgDCC(二环己基碳二亚胺)和10mgDMAP(二甲基氨基吡啶)，在室温条件下反应6小时。反应后的溶液，倒入120ml氯仿中洗涤，最终得反应产物520mg。
经HPLC检测，三尖杉磷碱含量为18.8％。
IR(KBr)cm-13450，2919，2360，1652，1558，1403，1230，650。
紫外吸收λmax=230nm，ε=29800，λmax=275nm，ε=1700。
1HNMRδ(ppm)=7.77-7.36，6.38，5.97，5.63，5.55-5.36，5.10，4.36，4.10，1.97，1.18-1.20。
实施例3三尖杉磷碱2＇-聚天冬氨酸酯制备将625mg三尖杉磷碱溶于120ml乙腈中，加入分子量为24000的聚天冬氨酸6.1g，再加入115mg二甲氨基吡啶，在25℃下搅拌8小时，然后表压-0.05MPa、温度50℃下抽干溶剂，再将所得的固形物上硅胶柱进行色谱分离，以乙腈∶水=25∶75的溶液为洗脱剂，最终得三尖杉磷碱2＇-聚天冬氨酸酯6.05g。
所得产品经定量测定，三尖杉磷碱的含量为9.89％。
IR(KBr)cm-13450，2919，2360，1652，1558，1403，1230，650。
紫外吸收λmax=231nm，ε=27900，λmax=275nm，ε=160。
实施例4三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯制备将530mg三尖杉磷碱溶于130ml乙腈中，加入分子量为26000的聚谷氨酸8.8g，再加入5.8ml二环己基碳二亚胺和185ml吡啶，在25℃下搅拌8小时，然后在表压-0.05MPa、温度50℃下抽干溶剂，再将所得的固形物上硅胶柱进行色谱分离，以乙腈∶水=25∶75的溶液为洗脱剂，最终得三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯8.90g。
所得产品经定量测定，三尖杉磷碱的含量为5.50％。
IR(KBr)cm-13450，2919，2360，1652，1558，1403，1230，650。
紫外吸收λmax=230nm，ε=29600，λmax=275nm，ε=1680。
1HNMRδ(ppm)=7.77-7.36，6.38，5.97，5.63，5.55-5.36，5.10，5.18，4.10，1.97，1.18-1.20。
实施例5三尖杉磷碱2＇，7-聚天冬氨酸酯制备将520mg三尖杉磷碱溶于5.6ml乙腈中，加入分子量为25000的聚天冬氨酸8.6g，再加入5.5ml二环己基碳二亚胺和180ml吡啶，在25℃下搅拌8小时，然后在表压-0.05MPa、温度50℃下抽干溶剂，再将所得的固形物上硅胶柱进行色谱分离，以乙腈∶水=25∶75的溶液为洗脱剂，最终得三尖杉磷碱2＇，7-聚天冬氨酸酯8.90g。
所得产品经定量测定，三尖杉磷碱的含量为5.80％。
IR(KBr)cm-13450，2919，2360，1652，1558，1403，1230，650。
紫外吸收λmax=230nm，ε=28190，λmax=275nm，ε=1618。
实施例6三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯制备将220mg三尖杉磷碱溶于60ml乙腈中，在0℃下，与23mlCH3CH2COCl反应1小时，再加入分子量为28000的聚谷氨酸钠1.7g，再加入42mg二甲基氨基吡啶，在25℃下搅拌8小时，然后在25℃下加入0.1M HAC混合搅拌20分钟，再另入CHCl3洗三次，抽干，再将所得的固形物上硅胶柱进行色谱分离，以乙腈∶水=25∶75的溶液为洗脱剂，最终得三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯1.8g。
所得产品经定量测定，三尖杉磷碱的含量为11.90％。
IR(KBr)cm-13450，2919，2360，1652，1558，1403，1230，650。
紫外吸收λmax=230nm，ε=29400，λmax=275nm，ε=1680。
1HNMRδ(ppm)=7.77-7.36，6.38，5.97，4.78，5.55-5.36，5.10，5.18，4.10，1.97，1.18-1.20。
实施例7三尖杉磷碱7-聚天冬氨酸酯制备将210mg三尖杉磷碱溶于57ml乙腈中，在0℃下，与20mlCH3CH2COCl反应1.2小时，再加入分子量为28000的聚谷氨酸钠1.6g，再加入43mg二甲基氨基吡啶，在25℃下搅拌10小时，然后在25℃下加入0.1M HAC混合搅拌25分钟，再加入CHCl3洗三次，抽干，将所得的固形物上硅胶进行色谱分离，以乙腈∶水=25∶75的溶液为洗脱剂，最终得三尖杉磷碱7-聚天冬氨酸酯1.9g。
所得产品经定量测定，三尖杉磷碱的含量为11.21％。
IR(KBr)cm-13450，2919，2360，1652，1558，1403，1230，650。
紫外吸收λmax=230nm，ε=27880，λmax=275nm，ε=1629。
实施例8三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯钠制备将1.2g三尖杉磷碱溶于220ml乙腈中，加入分子量为4000的聚谷氨酸钠9.3g，再加入210mg二甲基氨基吡啶，在25℃下搅拌8小时，然后在表压-0.05MPa、温度50℃下抽干溶剂，再将所得的固形物上硅胶柱进行色谱分离，以乙腈∶水=25∶75的溶液为洗脱剂，最终得三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯钠9.8g。
所得产品经定量测定，三尖杉磷碱的含量为10.20％。
IR(KBr)cm-13450，2919，2360，1652，1558，1403，1230，650。
紫外吸收λmax=230nm，ε=29800，λmax=275nm，ε=1700。
1HNMRδ(ppm)=7.77-7.36，6.38，5.97，5.63，5.55-5.36，5.10，4.36，4.10，1.97，1.18-1.20。
实施例9三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯钠制备称取分子量为25000的PGA(聚谷氨酸)540mg，溶于53mlDMF(二甲基甲酰胺)，加入三尖杉磷碱158mg，再加入52mgDCC(二环己基碳二亚胺)和107mgDMAP(二甲基氨基吡啶)，在室温条件下反应6.2小时。反应后的溶液，倒入120ml氯仿中洗涤，然后将固形物滤出，溶于110ml0.1M的NaHCO3溶液。该溶液用去离子水透析过液。完成透析的溶液，冷冻干燥，最终得反应产物520mg。
经HPLC检测，三尖杉磷碱含量为19.3％。
IR(KBr)cm-13450，2919，2360，1652，1558，1403，1230，650。
紫外吸收λmax=230nm，ε=29780，λmax=275nm，ε=1710。
1HNMRδ(ppm)=7.77-7.36，6.38，5.97，5.63，5.55-5.36，5.10，4.36，4.10，1.97，1.18-1.20。
实施例10三尖杉磷碱2＇-聚天冬氨酸酯钠制备将1.0g三尖杉磷碱溶于210ml乙腈中，加入分子量为38000的聚谷氨酸钠9.1g，再加入200mg二甲基氨基吡啶，在25℃下搅拌9小时，然后在表压-0.05MPa、温度50℃下抽干溶剂，再将所得的固形物上硅胶柱进行色谱分离，以乙腈∶水=25∶75的溶液为洗脱剂，最终得三尖杉磷碱2＇-聚天冬氨酸酯钠9.6g。
所得产品经定量测定，三尖杉磷碱的含量为10.01％。
IR(KBr)cm-13450，2919，2360，1652，1558，1403，1230，650。
紫外吸收λmax=231nm，ε=28460，λmax=277nm，ε=1670。
实施例11三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯钠制备将1.2g三尖杉磷碱溶于220ml乙腈中，加入分子量为36000的聚谷氨酸钠17.0g，再加入12mg二环己基碳二亚胺和360ml吡啶，在25℃下搅拌8小时，然后在表压-0.05MPa、温度50℃下抽干溶剂，再将所得的固形物上硅胶柱进行色谱分离，以乙腈∶水=25∶75的溶液为洗脱剂，最终得三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯钠17.8g。
所得产品经定量测定，三尖杉磷碱的含量为5.60％。
IR(KBr)cm-1∶3450，2919，2360，1652，1558，1403，1230，650。
紫外吸收λmax=230nm，ε=28840，λmax=275nm，ε=1690。
1HNMRδ(ppm)=7.77-7.36，6.38，5.97，5.63，5.55-5.36，5.10，5.18，4.10，1.97，1．18-1．20。
实施例12三尖杉磷碱2＇，7-聚天冬氨酸酯钠制备将1.1g三尖杉磷碱溶于210ml乙腈中，加入分子量为32000的聚天冬氨酸钠16.6g，再加入10mg二环己基碳二亚胺和340ml吡啶，在25℃下搅拌8小时，然后在表压-0.05MPa、温度50℃下抽干溶剂，再将所得的固形物上硅胶柱进行色谱分离，以乙腈∶水=25∶75的溶液为洗脱剂，最终得三尖杉磷碱2＇，7-聚天冬氨酸酯钠16.6g。
所得产品经定量测定，三尖杉磷碱的含量为5.80％。
IR(KBr)cm-13450，2919，2360，1652，1558，1403，1230，650。
紫外吸收λmax=230nm，ε=28910，λmax=275nm，ε=1705。
实施例13三失杉磷碱7-聚谷氨酸酯钠制备将500mg三尖杉磷碱溶于100ml乙腈中，在0℃下，与60mlCH3CH2COCl反应1小时，再加入分子量为36000的聚谷氨酸钠5.2g，再加入100mg二甲基氨基吡啶，在25℃下搅拌8小时，然后在25℃下加入0.1M HAC混合搅拌20分钟，再加入CHCl3洗三次，抽干，再将所得的固形物上硅柱胶进行色谱分离，以乙腈∶水=25∶75的溶液为洗脱剂，最终得三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯钠5.4g。
所得产品经定量测定，三尖杉磷碱的含量为9.20％。
IR(KBr)cm-13450，2919，2360，1652，1558，1403，1230，650。
紫外吸收λmax=230nm，ε=29710，λmax=275nm，ε=1690。
1HNMRδ(ppm)=7.77-7.36，6.38，5.97，5.55-5.36，5.10，5.18，4.10，1.97，1.18-1.20。
实施例14三尖杉磷碱7-聚天冬氨酸酯钠制备将540mg三尖杉磷碱溶于115ml乙腈中，在0℃下，与63mlCH3CH2COCl反应1.5小时，再加入分子量为32000的聚天冬氨酸钠5.5g，再加入110mg二甲基氨基吡啶，在25℃下搅拌8小时，然后在25℃下加入0.1M HAC混合搅拌20分钟，再加入CHCl3洗三次，抽干，再将所得的固形物上硅胶柱进行色谱分离，以乙腈∶水=25∶75的溶液为洗脱剂，最终得三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯钠5.50g。
所得产品经定量测定，三尖杉磷碱的含量为9.10％。
IR(KBr)cm-13450，2919，2360，1652，1558，1403，1230，650。
紫外吸收λmax=231nm，ε=28848，λmax=276nm，ε=1668。
三尖杉磷碱聚谷氨酸酯钠的抗肿瘤活性试验受试化合物五个浓度(300、100、30、10、3μg/ml)三尖杉磷碱聚谷氨酸酯钠(今后简称化合物A)材料和方法1．细胞株K562(人红细胞白血病细胞株)及CNE(人鼻咽癌细胞株)，中国科学院昆明动物研究所提供。2．试剂(1)阳性对照药米托蒽醌，深蓝色注射液，四川升和制药有限公司生产，批号；970613，批准号(96)卫药准字X-84号；(2)MTTSigma生产，批号9710；(3)三联液各成分SDS上海化学试剂站分装厂(进口分装)，批号960711；HCl成都化学试剂厂，批号8509061；异丁醇上海化学试剂采购供应站联营企业中心化工厂生产，批号930613；(4)细胞培养基各成分RPMI1640Hyclone生产，批号AFM5891F；特级无支原体新生牛血清杭州四秀青生物工程材料研究所生产，中国药品生物制品检定所鉴制，批号980224。3．方法(1)样品的配制样品先用生理盐水配制成30mg/ml的母液，再用生理盐水将试药稀释成3000、1000、30、100、30μg/ml五个浓度。样品溶解充分，未见析出。(2)测试方法改良MTT法〔1〕。取对数生长期的K562、CNE细胞株，计数后，将细胞浓度分别调整为5×104/ml、4×104/ml，加入96孔板中，90μl/孔。CNE须在培养箱中放置4h待贴壁后再加待测样品，每孔10μl。阴性对照为等体积的生理盐水，阳性对照为米托蒽醌。加药组及对照组均设4个复孔，每个浓度均设平行对照。受试样品的终浓度为300、100、30、10、3μg/ml；阳性对照的终浓度为10-4，10-5，10-6，10-7mol/L。细胞在37℃，5％CO2培养箱中分别孵育48h(K562)，72h(CNE)后，分别加入MTT5mg/ml，10μl/孔。继续培养4h后，加入三联液[10％SDS-5％异丁醇-0.012ml/L HCL(w/v/v)]，100μl/孔，放置21小时后，用酶标仪(Bioteck EL-340，美国)在570nm，630nm双波长下测定各孔的OD值。4．数据处理细胞存活率=加药孔的OD值/阴性对照孔的OD值；细胞抑制率=100％-细胞存活率〔2〕。用GWBASIC软件计算各受试药的IC50及IC5095％的可信区间。实验结果受试样品对K562及CNE细胞增殖动力学的影响详见表1、表2。表1．化合物A对K562(人红白血病)细胞株体外增殖的抑制作用 表2．化合物对CNE(人鼻咽癌)细胞株体外增殖的抑制作用 结论按照植物提取物IC50＜30μg/ml即认为对肿瘤细胞的增殖有一定抑制作用的标准，在受试浓度范围内，化合物A对K562细胞株生长的IC50值＜1μg/ml，表明对K562的增殖有较强的抑制作用。
在受试浓度范围内，化合物A对CNE细胞株生长的IC50值＜0.1μg/ml，表明对K562的增殖有较强的抑制作用。
在受试浓度范围内，化合物A对CNE细胞株生长的IC50值＜0.1μg/ml，表明对CNE的增殖有很强的抑制作用。
化合物A对GLC-82、TYK、CA及SGC-7901细胞株体外增殖的抑制作用。
受试化合物六个浓度(100，30，10，3，1，0.3μg/ml)的化合物A材料和方法1．细胞株GLC-82(人肺癌细胞株)及CA(人肝癌细胞株)，中国科学院昆明动物研究所提供；SGC-7901(人胃癌细胞株)，中国科学院上海药物所提供；TYK(人卵巢癌细胞株)，山东医科大学提供。试剂(1)阳性对照药米托蒽醌，深色注射液，四川升和制药有限公司生产，批号970613，批准文号(96)卫药准字X-84号；紫杉醇原料药，云南汉德生物技术有限公司提供(2)MTTSigma生产，批号9710(3)三联液各成分SDS上海化学试剂站分装厂(进口分装)，批号960711；HCL成都化学试剂厂，批号8509061；异丁醇上海化学试剂采购供应站联营企业中心化工厂生产，批号930613；(4)细胞培养基各成分RPMI1640；Hyclone生产，批号AFM5891F；特级无支原体新生牛血清杭州四秀青生物工程材料研究所生产，中国药品生物制品检定所鉴制，批号980224。3.方法(1)样品的配制样品用生理盐水配制成1mg/ml，再用生理盐水将试药稀释成300、100、30、10、3μg/ml五个浓度。样品溶解充分，未见析出。紫杉醇先用DMSO配制成1mg/ml的母液。再用生理盐水将试药稀释成100、10、1、0．1、0.01μg/ml五个浓度。样品溶解充分，未见析出。(2)测试方法改良MTT法〔1〕取对数生长期的GLC-82、SGC-7901、CA、TYK细胞株，计数后，将细胞浓度调整为4×104/ml，加入96孔板中，90μl/孔细胞在培养箱中放置4h待贴壁后再加待测样品，每孔10μl。受试药的阴性对照为等体积的生理盐水，紫杉醇的阴性对照为等体积的生理盐水、1％DMSO、10％DMSO，阳性对照为米托蒽醌每个浓度均设平行对照，并且另设12个调零孔。受试样品的终浓度为100、30、10、3、1、0.3μg/ml；紫杉醇的终浓度为10、1、0.1、0.01、0.001μg/ml；阳性对照的终浓度为10-4，10-5，10-6mol/L。细胞在37℃，5％CO2培养箱中孵育72h后，分别加入MTT5mg/ml，10μl/孔。继续培养4h后，加入三联液[10％SDS-5％异丁醇-0.012ml/L HCL(w/v/v)]，100μ1/孔，放置12小时后，用酶标仪(Bioteck EL-340，美国)在570nm，630nm双波长下测定各孔的OD值。4.数据处理细胞存活率=加药孔的OD值/阴性对照孔的OD值；细胞抑制率=100％-细胞存活率。用GWBASIC软件计算各受试药的IC50及IC5095％的可信区间。实施结果受试样品对GLC-82、TYK、CA及SGC-7901细胞增殖动力学的影响详见表3、表4、表5及表6。表3．化合物A对GLC-82(人肺癌)细胞株体外增殖的抑制作用 表4．化合物A对SGC-7901(人胃癌)细胞株体外增殖的抑制作用 表5化合物A对CA(人肝癌)细胞株体外增殖的抑制作用 表6化合物A对TYK(人卵巢癌)细胞株体外增殖的抑制作用
结论按照植物提取物IC50＜30μg/ml即认为对肿瘤细胞的增殖有一定抑制作用的标准，在受试浓度范围内，化合物A对GLC-82、SGC-7901、CA细胞株生长的IC50值分别为1.31×10-3μg/ml、0.12μg/ml、0.31μg/ml表明化合物A对这三株细胞的增殖有很强的抑制作用。
在受试浓度范围内，化合物A对TYK细胞株生长的IC50值为0.23μg/ml，表明对TYK的增殖有很强的抑制作用。
权利要求
1．通式Ⅰ的三尖杉磷碱聚氨基酸酯或其盐， 其中，R1和R2可相同或不同且独立为聚氨氨酸或H，M不存在或存在且为碱金属或碱土金属离子，条件是R1和R2不能同时为氢。
2．权利要求1的化合物，其中聚氨基酸选自聚天然或非天然氨基酸，M选自锂，钠，钾，钡，铝或镁阳离子。
3．权利要求1或2的化合物，其中聚氨基酸选自聚谷氨酸或聚天冬氨酸。
4．权利要求1-3任一的化合物，其中R1为聚谷氨酸或聚天冬氨酸，R2为H。
5．权利要求1-3任一的化合物，其中R1为H，R2为聚谷氨酸或聚天冬氨酸。
6．权利要求1-3任一的化合物，其中R1为聚谷氨酸或聚天冬氨酸，R2为聚谷氨酸或聚天冬氨酸。
7．权利要求1-3任一的化合物，其中所述式Ⅰ化合物选自三尖杉磷碱2＇聚氨酸酯，三尖杉磷碱2＇-聚天冬氨酸酯，三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯，三尖杉磷碱2，7-聚天冬氨酸酯，三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯，三尖杉磷碱7-聚天冬氨酸酯，三尖杉磷碱2＇聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇聚天冬氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇，7-聚天冬氨酸酯钠，三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱7-聚天冬氨酸酯钠。
8．权利要求1-3任一的化合物，其中所述式Ⅰ化合物选自三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯钠。
9．权利要求3的化合物，其中所述聚谷氨酸或聚天冬氨酸包括其D-，L-，或DL构型。
10．权利要求3的化合物，其中所述聚谷氨酸分子量为15，000-60，000。
11．权利要求10的化合物，其中所述聚谷氨酸分子量为25，000-50，000。
12．权利要求3的化合物，其中所述聚天冬氨酸分子量为12，000-50，000。
13．权利要求12的化合物，其中所述聚天冬氨酸分子量为22，000-40，000。
14．药物组合物，其包括式Ⅰ三尖杉磷碱聚氨基酸酯或其盐及药用载体， 其中，R1和R2可相同或不同且独立为聚氨氨酸或H，M不存在或存在且为碱金属或碱土金属离子，条件是R1和R2不能同时为氢。
15．权利要求14的药物组合物，其中式Ⅰ三尖杉磷碱聚氨基酸酯或其盐选自三尖杉磷碱2＇-聚氨酸酯，三尖杉磷碱2＇-聚天冬氨酸酯，三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯，三尖杉磷碱2＇，7-聚天冬氨酸酯，三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯，三尖杉磷碱7-聚天冬氨酸酯，三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇-聚天冬氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇，7-聚天冬氨酸酯钠，三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱7-聚天冬氨酸酯钠。
16．权利要求14的药物组合物，其中式Ⅰ三尖杉磷碱聚氨基酸酯或其盐选自三尖杉磷碱2＇-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱2＇，7-聚谷氨酸酯钠，三尖杉磷碱7-聚谷氨酸酯钠。
17．权利要求1要求的化合物用于制备用于治疗癌症或与自身免疫缺陷有关疾病的药物中用途。
18．权利要求17的用途，其中所述癌症选自鼻咽癌、肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、恶性黑色素瘤、头颈部癌、食管癌和白血病。
19．权利要求17的用途，其中所述自身免疫缺陷疾病选自类风湿性关节炎或自身免疫性肾病。
全文摘要
本发明涉及水溶性三尖杉磷碱聚氨基酸酯或其盐,尤其是三尖杉磷碱聚谷氨酸酯或其碱土金属盐或碱土金属盐或三尖杉磷碱聚天门冬氨酸酯或其碱金属盐,含它们的药物组合物及其医药用途,尤其是在抗肿瘤中的用途。
文档编号C07D305/14GK1288010SQ9911864
公开日2001年3月21日 申请日期1999年9月10日 优先权日1999年9月10日
发明者吴晓明, 何彦萍, 李松 申请人:云南汉德生物技术有限公司