专利名称：分离的结合mhci类和mhcii类分子的同ny－eso－1的氨基酸序列相关的肽及其应用的制作方法
相关申请本申请是1998年4月17日提交的申请号09/062,422的部分继续申请，申请号09/062,422为1997年9月15日提交的申请号08/937,263的部分继续申请，而后者又是1996年10月3日提交的申请号08/725,182现在的美国专利＿＿＿号的部分继续申请。所有这些申请均被引入作为参考。
发明的领域本发明涉及来自癌症相关抗原的HLA结合肽。这些肽结合Ⅰ类和Ⅱ类MHC分子。
背景和现有技术现已完全确认许多病理学状态，如感染、癌症、自身免疫病等都是以某些分子的不适当表达为特征的。因此这些分子可作为特定病理学或异常状态的“标志物”。这些分子除了可作为诊断“靶标”，即诊断这些异常状态所必需鉴定的物质外，它们还可作为用来产生诊断和/或治疗剂的反应物。其一个绝非限制性的实例是利用癌症标志物来产生特异性针对一种特定标志物的抗体。还有另一非限制性的实例是利用与MHC分子形成复合物的肽来产生针对异常细胞的溶细胞性T细胞。
当然，此类物质的制备必需有用于产生这些物质的反应物来源。从细胞进行纯化是进行该工作的一种辛苦而不可靠的方法。另一种优选的方法是分离编码一特定标志物的核酸分子，随后用分离的编码分子来表达目的分子。
目前，两种策略已被用于如在人类肿瘤中检测此类抗原。这些被称作遗传学方法和生物化学方法。遗传学方法由例如dePlaen等，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Sci.USA)85:2275(1988)举例说明，其被引入作为参考。在该方法中，将获自一种肿瘤的一个cDNA文库的数百份质粒集合体转染到受体细胞，例如COS细胞，或者测试了该特异性抗原表达的抗原阴性的肿瘤细胞系变体中。生物化学方法由例如引入作为参考的O.Mandelboim等，自然(Nature)369:69(1994)举例说明，其基于对结合于肿瘤细胞MHC-Ⅰ类分子的肽的酸洗脱，及随后的反相高效液相色谱(HPLC)。抗原性肽在它们结合抗原加工有缺陷的突变细胞系上的空MHC-Ⅰ类分子后被识别，并诱导同细胞毒性T淋巴细胞的特异性反应。这些反应包括CTL增殖的诱导、TNF的释放以及靶细胞的裂解，可在MTT检测法或51Cr释放检测法中测定。
这两种对抗原进行分子确定的方法具有下述缺点第一，它们非常麻烦，耗时而且昂贵；第二，它们依赖于具有预定特异性的细胞毒性T细胞系(CTLs)的建立。
这两种用于抗原的鉴定和分子确定的已知方法有其固有的问题，这一点已通过以下事实得到了最好的证实迄今为止这两种方法在人体肿瘤中只成功确定了很少的几种新抗原。见例如van der Bruggen等，科学(Science)254:1643-1647(1991)；Brichard等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)178:489-495(1993)；Coulie等，实验医学杂志180:35-42(1994)；Kawakami等，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91:3515-3519(1994)。
此外，所述方法学有赖于目的癌症类型已建立的永生细胞系的可用性。建立来自特定癌症类型的细胞系是很难的，如Oettgen等，北美免疫学和过敏症临床(Immunol.Allerg.Clin.North.Am.)10:607-637(1990)所示。还已知一些上皮细胞癌在体外对CTL的易感性极低，防碍了常规检测。这些问题促使本领域来发展用于鉴定癌症相关抗原的其他方法。
Sahin等，美国国家科学院进展92:11810-11913(1995)描述了一个关键的方法，其引入作为参考。还可见美国专利5,698,396号以及1996年1月3日提交的申请号08/479,328。所有这三篇文献均引入作为参考。总之，该方法涉及cDNA文库在原核宿主中的表达。(文库均得自肿瘤标本)。然后，为了检测那些引发高滴度体液应答的抗原，用已吸附并稀释的血清对表达文库进行免疫筛选。该方法被称为SEREX方法(通过重组表达克隆进行的抗原血清学鉴定(“Serological identification of antigens by RecombinantExpression Cloning”))。该方法学已被用来证实以前鉴定的肿瘤相关抗原的表达，以及检测新抗原。见上面参考的专利申请和Sahin等，同上，以及Crew等，欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J)144:2333-2340(1995)。
SEREX方法已被用于食管癌标本，而且目前已经鉴定出一种抗原，并分离和克隆了其编码核酸分子。这是几个专利申请的主题，其中一些被引入作为参考。已发现该抗原和其截断形式同癌症患者血清中的抗体发生反应。还发现源自该分子的肽同MHC分子结合，激发溶细胞性T细胞和辅助性T细胞的应答。在随后的公开中可以看到本发明的这些特征。
附图简述
图1显示NY-ESO-1抗原的RNA在各种类型组织中的表达模式。
图2显示NY-ESO-1 mRNA的RNA印迹(Northem Blot)杂交分析，其在睾丸和细胞系SK-MEL-19中可检测到，而在其它各种细胞和组织样品中未检测到。
图3显示对推导的NY-ESO-1氨基酸序列进行修饰的潜在位点。
图4是NY-ESO-1的亲水性曲线图，其显示在氨基末端的亲水区和靠近羧基端较长的疏水片段。
图5显示利用各种HLA-A2阳性、NY-ESO-1阳性、双阳性或双阴性的细胞进行的CTL裂解研究的结果。
图6提供资料确定HLA-A2为提呈SEQ ID NO:1衍生肽的提呈分子。
实施例1利用众所周知的方法从快速冷冻的高分化或中分化的食管鳞状细胞癌标本中提取总RNA。关于此类方法见例如Chomzynski，分析生物化学杂志(J.Analyt.Biochem.)162:156-159(1987)。按照制造商的说明利用此RNA制备一个随后被转染到λZAP噬菌体载体中的cDNA文库。然后将λZAP文库转染到大肠杆菌中，产生1.6×106个初级分离菌。
然后利用Sahin等，美国国家科学院进展92:11810-11813(1995)的SEREX方法，其被引入作为参考。简言之，通过将自体血清和不含有食管癌细胞cDNA克隆的λZAP所转染的大肠杆菌的裂解液相合并，从血清中去除抗大肠杆菌内源性分子的抗体。
然后将清理过的血清稀释，并同含有噬菌斑的硝酸纤维素膜混合。将噬斑室温孵育过夜。随后进行洗涤，然后将滤膜同碱性磷酸酶结合的山羊抗人FCγ二抗进行孵育，并通过同5-溴-4-氯-吲哚磷酸盐和氮蓝四唑一起孵育来显色。发现了一共13个阳性克隆。
实施例2鉴定后，通过稀释克隆和用人血清检测将反应性克隆亚克隆至单克隆化。然后利用制造商的说明，对这些克隆进行纯化，体外切割，并转换成pBK-CMV质粒的形式。然后利用EcoRⅠ-XbaⅠ限制性作图评价插入的DNA来确定不同的插入子。鉴定出8个不同的插入子，大小从大约500到大约1300个碱基对。利用ABI PRISM自动测序仪对克隆进行测序。
表1总结了结果。一个基因由4个重叠的克隆代表，另一个由3个重叠的克隆代表，而其余的6个基因都只由一个克隆代表。
同源性检索揭示被称为NY-ESO-2、3、6、7的克隆是已知的。见Elisei等，内分泌研究杂志(J.Endocrin.Invest.)16:533-540(1993)；Spritz，等，核酸研究(Nucl.Acids Res.)15:10373-10391(1987)；Rabbits等，自然遗传学(Nature Genetics)4:175-180(1993)；Crozat等，自然363:640-644(1993)；Genbank H18386和D25606。以前已经显示两个克隆(NY-ESO-3和NY-ESO-6)表达于人体各种正常组织中。尚未发现谱系限制性的证据。NY-ESO-6(cDNA)似乎是FUS/TLS基因的3’-非翻译部分。在此处未报告的实验中，NY-ESO-6的测序和DNA印迹(Southem Blot)分析未显示在肿瘤中易位或点突变的证据。4个克隆，即NY-ESO-1、4、5和8显示同所检索数据库中的序列没有明显的同源性，因此对其进行进一步研究。
表1．用自体血清对从食管癌文库中分离的基因进行免疫筛选基因 克隆编号 大小 DNA数据库注释NY-ESO-1E1-5b679bp 无明显同源性表达于睾丸和卵巢中E1-114b 614bpE1-153c 670bpE1-50 679bpNY-ESO-2 E1-71a 605bp U1小核RNP1同系物 通过Ab筛选而克隆(甲状腺
E1-140874bp炎患者)E1-31 750bpNY-ESO-3 E1-141b 517bp 结肠3’直接MboI (dbj D25606、gb H18638)未cDNA；成人脑cDNA 发表NY-ESO-4 E1A-10c 400bp 无明显同源性 在正常组织中普遍表达NY-ESO-5 E1A-54670bp 无明显同源性 表达于正常食管中NY-ESO-6 E1B-9b-1.2kb 人fus mRNA在脂肉瘤中易位t(12；16)NY-ESO-7 E1B-20f -1.0kb 人U1-70k sn RNP与NY-ESO-2不同(emblHSU17052、gbM22636)NY-ESO-8 E1B-20g -1.3kb 无明显同源性 在正常组织中普遍表达实施例3进行研究来评价NY-ESO-1、4、5和8克隆的mRNA表达。为了进行这个研究，针对每个序列设计特异性寡核苷酸引物，以便可以扩增300-400个碱基对的cDNA片段，而且引物解链温度可以在65-70℃的范围内。然后利用市售的材料和标准的方法进行反转录PCR。检测了多种类型的正常和肿瘤细胞。克隆NY-ESO-4和NY-ESO-8是普遍存在的，因此没有进行进一步研究。NY-ESO-5显示在原发肿瘤和正常食管组织中高水平表达，提示其是分化标志物。
在肿瘤mRNA和睾丸中发现表达NY-ESO-1，而在正常结肠、肾脏、肝脏或脑组织中则没有表达。这种表达模式同其它肿瘤排斥抗原前体一致。
实施例4针对NY-ESO-1在一组更全面的正常和肿瘤组织中进行了上述RT-PCR检测。表2、3和4显示了这些结果。简言之，NY-ESO-1被发现高表达于正常睾丸和卵巢细胞中。在正常子宫肌层中发现了少量的RT-PCR扩增而子宫内膜中未发现，但是阳性结果并不一致。各种细胞类型的鳞状上皮，包括正常食管和皮肤也均为阴性。
当检测无关细胞谱系的肿瘤时，11个黑色素细胞系中的2个表现出高表达，67个黑色素瘤样品中的16个、33个乳腺癌样品中的6个以及4个膀胱癌中的4个也是如此。在其它肿瘤类型中存在零星的表达。
表2在正常组织中NY-ESO-1的mRNA的分布组织 mRNA 组织mRNA食管 - 肾上腺-脑*- 胰腺 -胎脑 - 精囊 -心 - 胎盘 -肺 - 胸腺 -肝脏 - 淋巴结-脾脏 - 扁桃体-肾脏 - PBL -胃 - PBL，活化的# -小肠 - 黑色素细胞-结肠 - 甲状腺-直肠 - 子宫 +/-**乳腺 - 睾丸 +皮肤 - 卵巢 +*来自不同部位的组织用IL-2和PHA测试**在部分样品中弱阳性，通过RNA印迹分析为阴性表3在黑色素瘤和乳腺癌细胞系中NY-ESO-1的mRNA的分布细胞系NY-ESO-1mRNAMZ2-MEL3.1-MZ2-MEL2.2-SK-MEL-13 -SK-MEL-19 +SK-MEL-23 -SK-MEL-29 -SK-MEL-30 -SK-MEL-31 -SK-MEL-33 -SK-MEL-37 +SK-MEL-179-SK-BR-3 -SK-BR-5 -734B -MDA-MB-231-
表4在各种人类肿瘤中通过RT-PCR检测NY-ESO-1 mRNA的表达肿瘤类型mRNA(阳性/总数)肿瘤类型 mRNA(阳性/总数)黑色素瘤25/77 卵巢癌 2/8乳腺癌 17/43 甲状腺癌 2/5前列腺癌4/16 膀胱癌 9/13结肠癌 0/16 Burkitt淋巴瘤1/2胶质瘤 0/15 基底细胞癌 0/2胃癌0/12 肌肉瘤 0/2肺癌5/17 其它肉瘤 0/2肾癌0/10 胰腺癌 0/2淋巴瘤*0/10 精原细胞瘤 0/1肝癌2/7脊髓瘤 0/1*非何杰金、非Burkitt型进行另一组实验来确证是否可以通过ELISA来检测在癌症患者血清中抗NY-ESO-1抗体的存在。
具体如下，将在包被缓冲液(15mM Na2CO3、30mM NaHCO3、pH9.6,0.02％NaN3)中浓度1μg/ml的重组NY-ESO-1吸附至微孔板(每孔10μl)，然后4℃保存过夜。用磷酸盐缓冲液洗板并用10μl/孔2％牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲液于4℃封闭过夜。洗涤后，将在2％牛血清白蛋白中稀释的血清10μl/孔加入到孔中。室温下孵育2小时后，洗板，并加入10μl/孔1∶1500稀释的山羊抗人IgG-碱性磷酸酶结合物。将该溶液在室温下孵育1小时，随后洗涤并加入碱性磷酸酶的底物溶液(10μl/孔)。室温放置25分钟后，用荧光读板仪读取各孔。结果列于下面的表中Eso 1+/检测总数 ％癌症患者黑色素瘤12/127 9.4卵巢癌4/32 12.5
肺癌 1/244.0乳腺癌2/267.7献血者0/700为了确定肿瘤中NY-ESO-1的mRNA表达和对NY-ESO-1蛋白的抗体应答之间是否相关，比较了来自62个黑色素瘤患者的资料。患者血清同NY-ESO-1蛋白有反应的所有患者(即含有针对NY-ESO-1的抗体)也都有NY-ESO-1阳性的肿瘤，而NY-ESO-1阴性肿瘤的患者在他们的血清中未出现针对NY-ESO-1的抗体。缺乏该抗体的NY-ESO-1阳性患者占有一定比例。已知大约20-40％的黑色素瘤表达NY-ESO-1，而且只有NY-ESO-1阳性肿瘤的患者具有抗体，资料表明高比例的NY-ESO-1阳性肿瘤患者产生抗该蛋白的抗体，因此提示大规模检测在诊断和对治疗的反应性中是有用的。
实施例5然后进行RNA印迹分析来研究NY-ESO-1转录子的大小，并证实组织表达模式。采用了Ausubel等，分子生物学最新方法(Current Protocols InMolecular Biology)(John Wiley和Sons,1995)的方法。具体的是，将每条泳道20μg的总RNA溶于含有甲酰胺和甲醛的缓冲液中，加热至65℃，然后在含有3％甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上分离，随后转移质硝酸纤维素膜上。然后利用32p标记的探针进行杂交，随后进行高严谨度洗涤。最后的洗涤是用0.1×SSC、0.1％SDS、60℃洗涤15分钟。
来自睾丸以及在前面的检测中NY-ESO-1为阳性的一种黑色素瘤细胞系(SK-MEL-19)的RNA显示出一条大约0.8-0.9kb的RNA转录子。一个食管癌样品显示出在0.4-0.9kb范围内的成片条带(smear)，表明部分降解。来自所检测的其它组织或细胞系的RNA显示无转录子。
为了获得编码全长转录子的cDNA，利用噬斑杂交方法并以原始cDNA克隆作为杂交探针对食管癌cDNA文库进行了再次筛选。当筛选了3×105个克隆时，发现了6个阳性克隆。对3个最长的克隆进行了测序。开放阅读框架分析显示，所有3个克隆都含有整个编码区和不同大小的5’-非翻译区。最长的克隆长度为755个碱基对(不包括多聚A)，含有543个碱基对的编码区，以及在5’末端53个非翻译的碱基和在3’末端的151个非翻译碱基。见SEQ ID NO:1(还有图3)。
长的ORF表明推导的NY-ESO-1蛋白序列为180个氨基酸。单个免疫阳性克隆含有编码其中173个的序列。推导的分子量为17,995道尔顿。
分析显示在N-末端部分有大量的甘氨酸残基(前80个中有30，其余100个中有4个)。亲水性分析表明在该分子的N-端一半中有亲水性抗原序列，还有交替的疏水和亲水序列，并以一个长的C端疏水性尾(152-172位氨基酸)结束，其后为一个短的亲水性尾。该模式提示为跨膜蛋白。该分子存在数个潜在的N-十四酰化位点、3个磷酸化位点，但没有N-糖基化位点。
实施例61995年从一名罹患恶性黑色素瘤的患者中建立了一个黑色素瘤细胞系“NW-MEL-38”。血清样品、外周血淋巴细胞和肿瘤样品均取自该患者，并冻存直至进行了本文所描述的工作。为了评价该患者体内的抗肿瘤T细胞应答，对患者进行HLA配型，为HLA-A1和HLA-A2。
为确定来自该患者的黑色素瘤是否表达NY-ESO-1，利用标准的技术从肿瘤标本和NW-MEL-38细胞系中分离总RNA。然后，再利用标准的技术将各样品的2μg总RNA用于进行cDNA合成。
然后利用下述引物5’-CACACAGGAT CCATGGATGCTGCAGATGCG G-3’(SEQ ID NO:2)和5’-CACACAAAGC TTGGCTTAGCGCCTCTGCCC TG-3’(SEQ ID NO:3)将cDNA进行RT-PCR实验。这些引物应该扩增SEQ ID NO:1的一个片段，其跨越271至599位核苷酸。
将扩增进行35个循环，利用60℃作为退火温度。在1.5％琼脂糖凝胶中通过溴化乙锭染色使PCR产物显色。
结果说明，所述肿瘤和细胞系均表达SEQ ID NO:1。该细胞系和肿瘤样品均用于随后的实验中。
实施例7然后将上述分离的cDNA分子用于制备重组蛋白。具体包括利用标准的技术对cDNA进行扩增，然后将其克隆到一种市售含有His标签的质粒载体即pQE9中。在本文未详细阐述的工作中，还利用了另一种载体，pQE9K。其与pQE9的不同之处在于pQE9K为卡那霉素抗性，而不是氨苄青霉素抗性。
将质粒载体转化到大肠杆菌菌株XL1-Blue中，并通过限制性作图和DNA测序鉴定阳性转化子。利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白的产生，并按照众所周知的方法在Ni2+离子层析柱上纯化该蛋白。当通过15％SDS-PAGE和银染分析时，该蛋白被鉴定为分子量约22千道尔顿的蛋白质。这与由该蛋白的序列所推测的大小一致。还鉴定出该重组蛋白的2种其它形式。这些由在SEQ ID NO:1中所报道的氨基酸序列的10-180和10-121位氨基酸组成。在如上所进行的SDS-PAGE上，它们的分子量分别为大约14kD和20kD。
进行另外一组实验来在杆状病毒中表达NY-ESO-1。具体为通过用BamHⅠ和HindⅢ切割从pQE9载体中释放NY-ESO-1 cDNA插入片段。然后将该插入片段亚克隆至用相同的酶切割过的市售杆状病毒载体中。利用标准的方法确定阳性克隆，并转染到Sf9受体细胞中。然后利用补充有10％胎牛血清的标准培养基(IPL-41)将重组病毒用于感染昆虫细胞。所用的感染复数为20。如上所述确定重组蛋白的表达。在该载体中产生的重组蛋白携带一个His-标签，因此也按照上面所描述的，在Ni2+亲和柱上对其进行纯化。该蛋白由10-180位氨基酸组成，而且通过SDS-PAGE确定分子量为20kD。
然后制备了其它真核转染子。为了进行该实验，从如上所述pQE9载体中分离NY-ESO-1编码序列，然后克隆至真核表达载体pcDNA3.1的BamHⅠ-HindⅢ位点中。接着，通过将COS-7细胞样品同150ng上述质粒和150ng含有HLA-A2.1的cDNA或HLA-A1的cDNA的质粒pcDNA 1 Amp相接触，而用该载体转染COS-7细胞。利用了众所周知的DEAE-葡聚糖氯奎方法。然后将细胞在37℃孵育48小时，之后在CTL刺激实验中对它们进行检测。具体地按照Traversari等，免疫遗传学(Immunogenetics)35:145-148(1992)进行该实验，其被引入作为参考。简言之，将在补充有10％人血清的RPMI 100μl中的2500个CTLs(NW38-IVS-1，见实施例9，如下)和25U/ml的重组IL-2加入到含有COS-7转染子的微孔中(20,000细胞/孔)。24小时后，从每孔中收集50μl的上清，并在一个标准的检测，即一种利用MTT测定对WEHI 164克隆13细胞的细胞毒性的方法中测定TNF-α的水平。将阳性细胞用于蛋白质印迹(Westem Blot)分析，其在随后的实施例中进行了描述。
所用的CTL为CTL NW38-IVS-1，其按照引入作为参考的Knuth等，美国国家科学院进展81:3511-3515(1984)来制备。具体为，通过将105个自体NW38-MEL-1肿瘤细胞和取自受试者的106个外周血淋巴细胞合并来建立混合的T淋巴细胞培养。加入细胞因子IL-2，并在37℃将混合培养孵育一周。去除肿瘤细胞，加入一份新的5×104个肿瘤细胞及IL-2。该步骤每周重复一次，直到对51Cr标记的NW-MEL-38细胞进行检测时观察到强的反应。收集反应T细胞并冻存直至在进一步实验中使用。
实施例8然后利用上面所描述的血清样品以及取自上面所描述的NW-MEL-38细胞系和上面所描述的COS-7转染子的细胞裂解液及也是上面所描述的纯化的重组蛋白来进行蛋白质印迹分析。血清样品取自患者治疗过程中的各个时刻。结果无差别。
在这些检测中，将1μg的重组NY-ESO-1蛋白或5μl每种类型细胞的裂解液稀释于SDS中，并煮沸5分钟，然后在15％的SDS凝胶中电泳。在向硝酸纤维素膜(0.45μm)上转印过夜，并用3％BSA封闭后，将印迹同以1∶1000、1∶10,000和1∶100,000稀释的血清或稀释至1∶50的抗NY-ESO-1单克隆抗体(为阳性对照)进行孵育。单克隆抗体通过Chen等，美国国家科学院进展5915-5919(1996)来制备，其被引入作为参考并详细描述如下。通过以2-3周的间隔将重组NY-ESO-1蛋白进行5次皮下注射对BALB/C小鼠进行免疫。免疫制剂包括在佐剂中的50μg的重组蛋白。第一次注射利用完全弗氏佐剂，其后利用不完全弗氏佐剂。从免疫的小鼠中取脾细胞，同小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0进行融合来产生杂交瘤。将代表性的杂交瘤E978用于制备mAb。
一旦产生了杂交瘤，便对它们进行克隆，并在微量滴定板上利用标准的固相ELISA筛选上清中的重组蛋白。按照Dippold等，美国国家科学院进展77:6114-6118(1980)进行该检测，其被引入作为参考。利用重组的NY-ESO-1还设置一系列阴性对照。利用碱性磷酸酶标记的1∶10,000稀释的山羊抗人IgG对上述大肠杆菌所产生的结合重组蛋白的血清抗体进行显色，然后利用NBT-磷酸盐显色。未转染的COS-7细胞也被用做对照。取自一个健康个体的血清也用做对照。
在低至1∶100,000的血清稀释度时发现针对重组蛋白的强反应性，而且还有针对NW-MEL-38裂解液的反应性。对于未转染的COS-7细胞无反应性，取自健康个体的血清也未显示反应性。
实施例9上面描述了4种不同形式的NY-ESO-1，即在大肠杆菌中由SEQ IDNO:1产生的形式和由10-180位氨基酸组成的形式、由10-121位氨基酸组成的形式以及在上面所讨论的杆状病毒载体系统中表达的由10-180位氨基酸组成的形式。按照上面所描述的方法，将每种形式均用于ELISA。所有形式的蛋白质均被发现与取自各种患者的抗体以及上面所讨论的小鼠单克隆抗体有同等的反应。
实施例10在检测上面的COS-7转染子时以及在本实施例所讨论的检测法中利用了一个溶细胞性T细胞系“NW38-IVS-1”。该“CTL”是通过利用肿瘤细胞系NW-MEL-38体外刺激上面所提到的外周血淋巴细胞而产生的。这是利用标准的技术来进行的。
将CTL同NW-MEL-38(其为HLA-A1、A2阳性，而NY-ESO-1阳性)、两种NY-ESO-1和HLA-A2阳性的同种异型细胞系(SK-MEL-37和MZ-MEL-19)、MHCⅠ类阴性的一个细胞系(SK-MEL-19)、HLA-A2阳性而NY-ESO-1阴性的一个细胞系(NW-MEL-145)、以及对照细胞系K562和植物血凝素刺激的自体母细胞一起用于细胞毒性检测。利用了各种效应/靶细胞比，并以51Cr标记的靶细胞的裂解为测定参数。由图5示之。
结果表明，CTL NW-38-IVS-1裂解自体细胞系NW-MEL-38以及HLA-A2和ESO-1均为阳性的同种异型细胞系。因此，CTL可与同种异型物质反应。见图6。
实施例11由于患者NW38为HLA-A1和HLA-A2双阳性，所以进行实验来确定哪种MHC分子是提呈分子。
进行与上面所描述的对COS-7细胞的相同实验，不同的是注意保证使HLA-A1 cDNA或HLA-A2 cDNA分别转化而非一起转化的共转化子分离。这些结果显示，CTL NW38-IVS-1只裂解含有NY-ESO-1和HLA-A2的COS-7转染子。见图6。该工作还证实CTL的特异性，因为在实施例9中所描述的NY-ESO-1阴性、HLA-A2阳性细胞中含有其它已知被加工成由HLA-A2分子提呈的肽的分子。
实施例12一旦提呈的MHC分子被确定为HLA-A2，便利用引入作为参考的由D’Amaro等，人类免疫学(Human Immunol)43:13-18(1995)和Drijfhout等，人类免疫学43:1-12(1995)所提出的模型筛选NY-ESO-1氨基酸序列来鉴定能与该基元相配的所有肽。利用标准的技术合成了由此所推断的所有氨基酸序列的相应肽，然后按照引入作为参考的Knuth等，美国国家科学院进展81:3511-3515(1984)将其用于细胞毒性检测。特别地，利用了细胞系CEMX721.174.T2(此后为“T2”)，因为其不将抗原加工成MHC复合肽，因此使其非常适于进行本文所述的实验类型。利用标准的方法用100μCi的Na(51Cr)O4对T2细胞样品进行标记，然后洗涤3次，随后同10μg/ml的肽和2.5μg/ml的β2-微球蛋白孵育。室温孵育1小时。然后以90∶1的效应/靶细胞比加入反应细胞(100μl的CTL NW38-IVS-1悬液)，并于37℃在有5％CO2的水饱和空气中孵育4小时。然后将滴定板以200×g离心5分钟，移取100μl上清，并测定放射活性。按照已知的策略确定51Cr释放的百分比。发现肽SLLMWITQCFL(SEQ ID NO:4)、SLLMWITQC(SEQ IDNO:5)和QLSLLMWIT(SEQ ID NO:6)为三个最佳的CTL刺激物。在用NW-MEL-38和细胞系SK-MEL-37和MZ-MEL-19做靶标时发现相似的结果，如上所示。
实施例13对由SEQ ID NO:1所编码蛋白的氨基酸序列分析了对应于HLA结合基元的肽序列。利用由Parker等，免疫学杂志(J.Immunol.)142:163(1994)所教授的算法进行，其被引入作为参考。在随后的表中给出了氨基酸序列、其可能结合的HLA分子以及在SEQ ID NO:1中的位置。所获复合物应引发溶细胞性T细胞应答。这可以由本领域的技术人员按照，例如由引入参考的van der Bruggen等，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol)24:3038-3043(1994)所教授的方法来确定。序列MHC/HLA分子 位置GPESRLLEFHLA-A1 82-90LLMWITQCFHLA-A3 158-166LMWITQCFLHLA-A3 159-167EPTVSGNILHLA-A24 125-133LQLSISACLHLA-A24 145-153GARGPESRLHLA-B7 79-87APRGPHGGAHLA-B7 60-68ESRLLEFYLHLA-B7 84-92APPLPVPGVHLA-B7 113-121FATPMEAELHLA-B7 96-104AADHRQLQLHLA-B7 139-147GARGPESRLHLA-B8 79-87ESRLLEFYLHLA-B8 84-92VPGVLKEF HLA-B35 118-126ESRLLEFYLHLA-B35 84-92GARGPESRLHLA-B35 79-87LEFYLAMPFHLA-B44 88-96PESRLLEFYHLA-B44 83-91AELARRSLAHLA-B44 102-110MEAELARRSHLA-B44 100-108QQLSLLMWIHLA-B52 154-162AQDAPPLPVHLA-B52 110-118LQLSISSCLHLA-B52 145-153ITQCFLPVFHLA-B52 162-170LLEFYLAMPF HLA-A1 87-96GPESRLLEFY HLA-A1 82-91PLPVPGVLLK HLA-A3 115-124RSLAQDAPPL HLA-A24 107-116APPLPVPGVL HLA-B7 113-122GARGPESRLL HLA-B7 79-88GPHGGAASLG HLA-B7 63-72APRGPHGGAA HLA-B7 60-69GPRGAGAARA HLA-B7 44-53TAADHRQLQL HLA-B8 138-147APPLPVPGVL HLA-B52 113-122QQLSLLMWIT HLA-B52 154-163LQQLSLLMWI HLA-B52 153-162KEFTVSFNIL HLA-B52 124-133实施例14进行进一步的实验来确定其它相关的肽。在这些实验中，利用了一个稳定的肿瘤细胞系，即，MZ-MEL-19。该细胞系是利用由被引入作为参考的 等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)187:265-269(1998)所描述的方法从一名被称为MZ19的患者建立的。利用MZ-MEL-19和在上述实施例7以及上述Jager等的方法还建立了一种溶细胞性T细胞系，即，MZ2-MEL 19-IVS-1。该CTL以HLA-A2限制的方式裂解自体肿瘤细胞系。这可用标准方法确定。将上面由D’Amaro等所提出的模型用于鉴定在ESO-l中与HLA-A2结合基元相配的所有序列。用该方式确定了26个肽。利用标准的方法对所有这些肽进行合成、纯化，并检测完整性。然后合成肽，并在随后的实验中进行测试。利用了MZ19-IVS-1以及实施例12中所描述的T2细胞。SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的肽结合HLA-A2分子，并被CTLMZ19-IVS-1识别，随后裂解这些细胞。该CTL还识别HLA-A2和十肽LLMWITQCFL(SEQ ID NO:7)形成的复合物，该十肽被发现位于SEQ IDNO:1的156-167位点处。
实施例15通过进一步的研究确定CD4+辅助T细胞是否识别MHCⅡ类分子和肽的复合物。
肿瘤细胞系MZ-MEL-19的配型为HLA-DR53阳性。因此，对NY-ESO-1利用Futaki等，免疫遗传学42:299-301(1995)来筛选，其被引入作为参考，文中指出HLA-DR53的结合基元。一共28个肽理论上独自可以结合HLA-DR53和抗原提呈细胞。
外周血淋巴细胞(“PBL”)分离自2个具有转移的黑色素瘤的患者，他们的配型为HLA-DR53阳性。
利用标准的市售试剂进行配型。一个患者的配型为HLA-DRB1(等位基因1501-05、1601-1603、1605和0701)、HLA DRB4*(等位基因0101-0103)和DRB5*(等位基因0101)阳性，而第二个患者的配型为HLA-DRB1*(等位基因1401、1407、1408和0901)、HLA-DRB3*(等位基因0201-0203)和DRB4*(等位基因0101-0103)阳性。按照Bodmer等，人类免疫学34:4-18(1992)，其被引入作为参考，HLA-DRB4*的所有等位基因被称为HLA-DR53。
用包被有适当抗体的磁珠处理PBL来清除CD4+和CD8+T淋巴细胞。将其余的细胞以4×106个细胞/孔接种于24孔板中，并使其贴壁于孔塑料24小时。去除任何未贴壁的细胞，并将其余的细胞用做抗原提呈细胞。在用5μg/ml的抗γ干扰素抗体4℃包被过夜的96孔平底硝酸纤维素板中，用GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)刺激这些细胞5天。细胞以3.5×105个细胞/孔进行接种。
然后用4μg/孔的测试肽或2μg/孔的完整NY-ESO-1蛋白做为对照进行冲击。
然后以1×105个细胞/孔加入CD4+T细胞，细胞悬浮于RPMI 1640培养基和2.5ng/ml的IL-2中，终体积为100μl，其中RPMI 1640培养基中添加有10％人血清、L-天冬酰胺(50mg/l)、L-精氨酸(242mg/l)和L-谷氨酰胺(300mg/l)。
将混合物于37℃在水饱和的空气中孵育48小时。然后，用0.05％的Tween 20/PBS溶液洗板6次，随后以0.5μg/ml加入生物素化的抗γ干扰素抗体。将抗体在37℃孵育2小时，随后用标准的试剂处理培养板1小时。加入底物3-乙基-9-氨基咔唑，并孵育5分钟，阳性表现为红色的斑点。每个孔中红色斑点的数量表示CD4+T淋巴细胞的频率，该CD4+T淋巴细胞识别肽和HLA-DR53的复合物或HLA-DR53和由重组NY-ESO-1所加工的肽的复合物。单用试剂(即单纯CD4+细胞和单纯染色剂)进行测试作为对照。
发现下面的肽使CD4+T淋巴细胞致敏而释放γ干扰素。
AADHRQLQLSISSCLQQLVLLKEFTVSGNILTIRLTPLPVPGVLLKEFTVSGNI(SEQ ID NOS:8-10)这3种肽与Futaki等的上述结合HLA-DR53的基元相配，其为Tyr、Phe、Trp或Leu的一个锚定残基，随后为Ala或Ser的三残基下游。
发现其它结合HLA-DR53的肽。
这些肽为GAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEATVSGNILTIRLTAADHRQ(SEQ ID NOS:11-13)
上述的实施例描述了编码一种食管癌相关抗原的核酸分子的分离。本文使用了“相关”，因为虽然该相关分子由食管癌所表达是清楚的，但其它癌也表达该抗原，例如黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和肺癌。
本发明涉及那些核酸分子，其编码所述抗原，而且其在严谨的条件下同参照序列SEQ ID NO:1杂交。本文所用的“严谨的条件”指例如那些在美国专利5,342,774号中所定义的条件，即在65℃杂交18小时，随后4次在2×SSC、0.1％SDS中洗涤1小时，最后在0.2×SSC、更优选0.1×SSC,0.1％SDS中洗涤30分钟，以及其他提供相同水平严谨度的条件和更严谨的条件。
本发明的一部分还为表达载体，其包括有与一个启动子可操作连接(即“可操作地连接于”)的本发明的核酸分子。此类载体的构建在本领域的技术人员中是已知的，细胞的转化或转染、制备编码目的分子的真核细胞系或原核细胞系同样也是已知的。在这种方式中可以选用的宿主细胞的实例是COS细胞、CHO细胞、酵母细胞、昆虫细胞(例如，草地夜蛾)、NIH 3T3细胞等等。原核细胞，例如大肠杆菌和其它细菌也可使用。
本发明还有一部分为本文所描述的抗原，其为原始肽形式和翻译后的修饰形式，以及由SEQ ID NO:1所编码蛋白的至少10-121位氨基酸和最多10-180位氨基酸所组成的蛋白。该分子不经任何翻译后修饰便大到足以具有抗原性，因此当同一种佐剂(或没有它)联合时，其以前体或翻译后修饰的形式都可用作免疫原。如上所示，这些蛋白可以用来确定在样品，例如血清或血液中是否存在抗体。利用该抗原制备的抗体，不论多克隆还是单克隆，以及产生单克隆抗体的杂交瘤，也均为本发明的一部分。这些抗体可作为完整分子或其部分用于治疗或诊断，如下述。本发明还有一部分为反应性片段，例如Fab、F(ab)2’和其它片段，以及嵌合体、人源化抗体、重组制备的抗体等等。特别优选的是嵌合体，其中除了互补性决定区“CDR”以外的整个抗体是人的，而CDR是小鼠的。
本公开显示，本发明的蛋白和核酸分子可用于诊断。本文所讨论的SEREX方法学是以对一种病理学相关抗原的免疫应答为前提的。因此，可以通过例如检测受检者的一种体液标本，如血清，同抗原本身的反应性来检测相关病理学。反应性可以被认为是该病理学可能存在的指征。因此，也可以通过任何本领域众所周知而无需详细说明的标准核酸杂交检测法来检测抗原的表达。也可用标准的免疫检测法检测针对受试分子的抗体。
SEQ ID NO:1的分析表明其中存在5’和3’非编码区。本发明涉及那些分离的核酸分子，其包括至少编码片段，即SEQ ID NO:1的54-593位核苷酸，而且其可能含有SEQ ID NO:1的1-53和/或594-747位核苷酸的任何一个或全部。
如上面所讨论的，进一步的研究揭示这些分子也被加工成引发溶细胞性T细胞裂解的肽。实施例7显示对HLA-A2分子如何进行这类基元分析。对于各种MHC或HLA分子的基元已有了大量的工作，其在此处是适用的。因此，本发明的另一方面为一种治疗方法，其中将结合患者肿瘤细胞表面HLA分子的一个或多个肽，以它们足以结合MHC/HLA分子并激发T细胞对细胞的裂解的数量施予患者。上述HLA-A2分子的实例绝非该方法可利用的唯一类型。任何肽组合也可以使用，如其它HLA分子的那些肽，如上述。可以单独或联合使用的这些肽，以及整个蛋白或其免疫反应性部分可以根据受试者的需要利用任何标准的施药形式，例如静脉内、皮内、皮下、经口、直肠、以及穿皮，施予受试者。标准的药用载体、佐剂，如皂苷、GM-CSF和白细胞介素等也可以使用。此外，这些肽和蛋白可以同所列举的材料一起制成疫苗，如同可与树突状细胞或提呈相关MHC/肽复合物的其它细胞一起配制一样。这些肽还可以用于形成HLA/肽的多体复合物，例如那些由Dunbar等，现代生物学(Curr.Biol.)8:413-416(1998)，其被引入作为参考，其中将4种肽/MHC/生物素复合物连接至链亲和素或亲和素分子。此类复合物可用来鉴定和/或刺激T细胞前体。
相似地，本发明设想一些疗法，其中将编码NY-ESO-1的核酸分子插入到载体例如基于腺病毒的载体中，使其能够转染到真核细胞例如人的细胞中。类似地，编码这些肽中的一或多种的核酸分子可以插入到这些载体中，其随后成为核酸为基础的疗法的主要组成部分。
这些检测法中的任何检测法也可以用于进展/消退研究。仅用上面提出的方法中的任何或所有方法监测蛋白的水平、其表达等等就可以监测涉及NY-ESO-1表达的异常过程。
应该清楚的是这些方法也可以用于跟踪一种治疗方案的疗效。基本上，利用上面讨论的检测法中的任何方法可以获得NY-ESO-1的基线值，施予给定的治疗剂，然后监测其后该蛋白的水平，观察ESO-1水平的改变作为该治疗方案疗效的指标。
如上所示，本发明特别涉及对NY-ESO分子的“整合”免疫应答的识别。其一个分支为监测癌症治疗过程的能力。在作为本发明的一个部分的此方法中，一个需要治疗的受试者接受本文所描述的一类接种。这样一种接种引起例如针对表面提呈HLA/肽复合物的细胞的T细胞应答。应答还包括一种抗体应答，可能是通过T细胞对细胞的裂解使抗体激发蛋白释放的结果。因此，通过监测免疫应答可以监测疫苗的效果。如上所示，抗体滴度或T细胞数的升高可以当作疫苗进展的一个指标，反之亦然。因此，本发明的另一个方面为施药后通过测定受试者中特异性针对疫苗本身或疫苗为其一部分的一个大分子的抗体水平来监测疫苗效果的方法。
通过监测接受疫苗的受试者的T细胞应答也可测定疫苗的效果。多种检测法可以用于测定这些体外刺激的T细胞中前体的频率。这些包括，但不限于，铬释放检测法、TNF释放检测法、IFNγ释放检测法、ELISPOT检测法等等。可以测定前体T细胞频率的改变而且其与疫苗的效果相关。其它可以利用的方法包括MHC/肽的多体复合物的使用。此类复合物的一个实例是Dunbar等，现代生物学8:413-416(1998)(其被引入作为参考)的四聚HLA/肽-生物素-链亲和素系统。
对在病理学状态例如癌症中所涉及的NY-ESO-1蛋白的鉴定也提示除了上面所讨论的那些外的多种治疗方法。上述实验证实，抗体是应答蛋白质的表达而产生的。因此，本发明的另一个实施方案为通过施予抗体，如人源化抗体、抗体片段等等，对以NY-ESO-1蛋白的异常或不正常水平为特征的状态进行治疗。这些抗体或片段可以连接有或标记有适当的细胞抑制性或细胞毒性试剂。
也可施予T细胞。要注明的是，可以在体外利用免疫反应细胞，例如树突状细胞、淋巴细胞或其它任何免疫反应细胞诱导T细胞，并将其回输到待治疗受试者中。
要注明的是，T细胞和/或抗体的产生也可以通过施予细胞来完成，优选经处理使其具有不增殖性的细胞，所述细胞提呈与应答相关的T细胞或B细胞表位，例如上面讨论的表位。
治疗方法还可以包括反义疗法，其中将一种反义分子，优选长度为10到100个核苷酸的反义分子，“单纯”或者在一种促进其掺入细胞的载体，例如脂质体中施予受试者，随后抑制该蛋白的表达。此类反义序列也可以掺入到适当的疫苗中，例如病毒载体(如痘苗病毒)、细菌构建体，例如已知BCG疫苗的变体等中。
本发明还有一个部分为肽，其可以是被定义为具有LLMWIT(SEQ IDNO:14)核心序列的九聚体、十聚体或十一聚体，其在第一个L残基后具有至少一个额外的残基，优选为丝氨酸，且可以具有多达3个残基，其中丝氨酸连接于L形成-SL-，而且在C-末端具有0-4个额外的氨基酸，其如上所示结合HLA-A2分子，从而引发CTL应答。这些肽可通过施予HLA-A2阳性并在病理情况中表达NY-ESO-1的患者而用于治疗，也可用于诊断，即确定的HLA-A2阳性细胞是否存在或者相关的CTL是否存在等等。
HLA-A2分子是MHCⅠ类分子，针对肽和Ⅰ类分子的复合物应答的T细胞通常为CD8+细胞。另一亚群的T细胞，CD4+细胞，针对MHCⅡ类分子和肽的复合物应答，而且在黑色素瘤患者中已检测到由自体培养的树突状细胞提呈的针对重组NY-ESO-1的MHCⅡ类分子限制性CD4+T细胞应答。特别地，在本文未描述的结果中，利用众所周知的技术，使CD4+细胞从PBL或血清样品中与其它细胞分离。然后将它们同用NY-ESO-1蛋白冲击过的树突状细胞相混合。观察到CD4+细胞的增殖，从另一个侧面反映本文所讨论的整合免疫应答。因此，本发明的另一方面为这些CD4+T细胞、结合MHCⅡ类分子的肽以及它们在治疗中的应用。
由SEQ ID NO:14的核心序列所定义的肽的实例为由SEQ ID NO:7所定义的肽。如所示的，该肽结合HLA-A2分子。因此，它是HLA-A2的“标志物”，也是如上刺激CTL增殖的肽/MHC复合物的一个组分。
如实施例所示，ESO-1也被加工成与MHCⅡ类分子，特别是HLA-DR53形成复合物的肽。这些分子与上面Futaki等所描述的基元相配，即Tyr、Phe、Trp或Leu，随后有3个氨基酸，之后为Ala或Ser。此类肽长度必需为至少18个氨基酸，而且优选不超过25个氨基酸。它们优选由18个氨基酸组成，例如SEQ ID NO:8、9、10、11、12和13。这些肽用于鉴定HLA-DR53阳性细胞。此外，诸如SEQ ID NO:8、9和10的肽可用来激发辅助T细胞的增殖，如实施例所示。上述关于MHCⅠ类限制性肽的所有应用也可用于这些MHCⅡ类限制性肽。此外，由于对MHCⅠ类分子/肽复合物的免疫应答不同于对MHCⅠ类分子/肽复合物的免疫应答，所以可使两类肽组合如在免疫组合物中，由此产生组合免疫应答。因此，所述所有应用可仅针对Ⅰ类分子限制性肽、也可仅针对Ⅱ类分子限制性肽、或者针对两者的组合。
本发明的其它特征和应用对于普通技术人员是清楚的，因此本文无需描述。
所用的术语和表述用作描述的而非限制的术语，而且无意利用这些术语和表述来排除所显示和所描述特征或其部分的任何等价体，需承认各种修饰都可能在本发明的范围内。
序列表(1)一般信息(ⅱ)申请人Stockert,Elisabeth；Jager,Elke；Chen,Yao-Tseng；Scanlan,Matthew；Knuth,Alexander；Old,Lloyd J.(ⅱ)发明的标题结合NY-ESO-1癌症相关蛋白的抗体、其应用、NY-ESO-1的截断形式、以及由其衍生的HLA结合肽(ⅲ)序列数7(ⅳ)联系地址(A)收信人Felfe&Lynch(B)街道第三大街805号(C)城市纽约市(D)州纽约(E)美国(F)邮编10022(ⅴ)计算机可读形式(A)媒介类型磁盘，3.5英寸，144kb容量(B)计算机IBM(C)操作系统PC-DOS(D)软件WordPerfect(ⅵ)当前申请数据(A)申请号(B)提交日期(C)分类(ⅶ)在先申请数据(A)申请号08/937,263(B)提交日期1997年9月15日(ⅶ)在先申请数据(C)申请号US 08/752,182(D)提交日期1996年10月3日(ⅷ)律师/代理人信息
(A)姓名Hanson,Norman D.
(B)注册号30,946(C)参考/案号LUD 5466.3(ⅸ)通讯信息(A)电话(212)688-9200(B)传真(212)838-3884(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度752个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑构型线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1ATCCTCGTGG GCCCTGACCT TCTCTCTGAG AGCCGGGCAG AGGCTCCGGA GCC 53ATG CAG GCC GAA GGC CGG GGC ACA GGG GGT TCG ACG GGC GAT GCT98Met Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala5 10 15GAT GGC CCA GGA GGC CCT GGC ATT CCT GAT GGC CCA GGG GGC AAT143Asp Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn20 25 30GCT GGC GGC CCA GGA GAG GCG GGT GCC ACG GGC GGC AGA GGT CCC188Ala Gly Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Aly Pro35 40 45CGG GGC GCA GGG GCA GCA AGG GCC TCG GGG CCG GGA GGA GGC GCC 233Arg Gly Ala Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala50 55 60CCG CGG GGT CCG CAT GGC GGC GCG GCT TCA GGG CTG AAT GGA TGC 278Pro Arg Gly Pro His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys65 70 75TGC AGA TGC GGG GCC AGG GGG CCG GAG AGC CGC CTG CTT GAG TTC 323Cys Arg Cys Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe80 80 90TAC CTC GCC ATG CCT TTC GCG ACA CCC ATG GAA GCA GAG CTG GCC 368Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala95 100 105CGC AGG AGC CTG GCC CAG GAT GCC CCA CCG CTT CCC GTG CCA GGG 413Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly110115 120GTG CTT CTG AAG GAG TTC ACT GTG TCC GGC AAC ATA CTG ACT ATC 458Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile125130 135CGA CTG ACT GCT GCA GAC CAC CGC CAA CTG CAG CTC TCC ATC AGC 503Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln Leu Gln Leu Ser Ile Ser140 145 150TCC TGT CTC CAG CAG CTT TCC CTG TTG ATG TGG ATC ACG CAG TGC 548Set Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys155160 165TTT CTG CCC GTG TTT TTG GCT CAG CCT CCC TCA GGG CAG AGG CGC 593Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg170175 180TAA GCCCAGCCTG GCGCCCCTTC CTAGGTCATG CCTCCTCCCC TAGGGAATGG646TCCCAGCACG AGTGGCCAGT TCATTGTGGG GGCCTGATTG TTTGTCGCTG GAGGAGGACG 706GCTTACATGT TTGTTTCTGT AGAAAATAAA ACTGAGCTAC GAAAAA752(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2CACACAGGAT CCATGGATGC TGCAGATGCG G 31(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(xⅰ)序列描述SEQ ID NO:3CACACAAAGC TTGGCTTAGC GCCTCTGCCC TG 32(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑构型线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu5 10(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(E)拓扑构型线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys5(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(F)拓扑构型线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp lle Thr5(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(G)拓扑构型线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7Leu Leu Met Trp Ile Thr权利要求
1.与MHCⅡ类HLA-DR53分子结合的分离的多肽，其包括至少18个，不超过25个氨基酸，所述的多肽具有至少一个HLA-DR53结合基元，所述的基元由4个氨基酸组成，其中第一个氨基酸为Tyr、Phe、Trp或Leu，而第四个氨基酸为Ala或Ser。
2.权利要求1的分离的肽，其中所述肽刺激对特异性于所述肽与HLA-DR53分子之复合物的CD4+细胞的识别和增殖。
3.权利要求1的分离的肽，其由18个氨基酸组成。
4.权利要求1的分离的肽，其选自SEQ ID NO:8、9、10、11、12和13。
5.权利要求4的分离的肽，其选自SEQ ID NO:8、9和10。
6.分离的溶细胞性T细胞，其特异性针对MHCⅡ类分子HLA-DR53和SEQ ID NO:8、9或10的复合物。
7.分离的复合物，其由MHCⅡ类分子HLA-DR53与权利要求1的多肽组成。
8.权利要求6的分离的复合物，其中所述的肽为SEQ ID NO:8、9、10、11、12或13。
9.包括权利要求1的分离的多肽和至少一种佐剂的组合物。
10.权利要求9的组合物，其中所述的多肽为SEQ ID NO:8、9或10。
11.分离的核酸分子，其由编码权利要求1的分离的多肽的核苷酸序列组成。
12.权利要求11的分离的核酸分子，其中所述的分离的多肽为SEQ IDNO:8、9、10、11、12或13。
13.表达载体，其包括权利要求11的分离的核酸分子，所述的核酸分子可操作地受限于一启动子。
14.组合物，其包括由SEQ ID NO:8、9和10所定义的多肽中至少两个组成的混合物。
15.权利要求14的组合物，其还包括一种佐剂。
16.表达试剂盒，其包括如下两个独立的部分，(ⅰ)分离的核酸分子，其编码权利要求1的分离的肽，以及(ⅱ)分离的核酸分子，其编码HLA-DR53分子
17.重组细胞，其包含权利要求11的分离的核酸分子。
18.重组细胞，其包含权利要求13的表达载体。
19.刺激辅助性T细胞增殖的方法，其包括使含有T细胞的样品接触MHCⅡ类分子HLA-DR53与权利要求5的肽所形成的复合物，该复合物的用量足以刺激识别该复合物的辅助性T细胞增殖。
20.权利要求19的方法，其中所述的复合物位于细胞的表面。
21.权利要求20的方法，其中所述细胞是被施予这些细胞的受试者的自体细胞。
22.权利要求20的方法，其中所述的细胞为不能增殖的细胞。
23.权利要求20的方法，其中所述的细胞为一种重组细胞。
24.权利要求19的方法，其中所述的复合物处于游离的形式。
25.刺激辅助性T细胞增殖的方法，其包括将权利要求5的至少一种肽以一定量的施予HLA-DR53阳性受试者，所述肽的用量足以形成该肽和HLA-DR53的复合物，所述复合物足以刺激其特异性T辅助细胞增殖。
26.权利要求25的方法，其包括局部施予所述至少一种肽。
27.权利要求25的方法，其包括以组合物的形式施予所述至少一种肽，该组合物包括至少一种佐剂。
28.在受试者中刺激辅助性T细胞增殖的方法，其包括施予所述受试者一定量的多肽或蛋白，其氨基酸序列包括包括至少SEQ ID NO:8、9或10之一，所述多肽或蛋白的量足以被加工成至少一种由所述受试者的MHCⅡ类分子提呈的肽，其量足以形成MHCⅡ类分子与所述至少一种肽的复合物的足够数量，该量足以刺激该复合物特异性T辅助细胞的增殖。
29.权利要求28的方法，其中所述受试者为HLA-DR53阳性。
30.权利要求28的方法，其中所述蛋白由SEQ ID NO:1编码。
31.权利要求28的方法，其中所述多肽包括SEQ ID NO:8、9或10的多个拷贝。
32.在受试者中刺激辅助性T细胞增殖的方法，其包括施予所述受试者一定量的细胞，所述细胞转染有(ⅰ)编码NY-ESO-1的核酸序列和(ⅱ)编码提呈NY-ESO-1肽的MHCⅡ类分子的核酸序列，其中所述肽由所述癌症状态的相关细胞提呈，其量足以缓解所述的癌症状态。
33.权利要求32的方法，其还包括处理所述细胞使其具有不增殖性。
34.在受试者中刺激辅助性T细胞增殖的方法，其包括施予所述受试者一定量的基本上由不增殖的细胞所组成的试剂，所述的不增殖的细胞在其表面表达MHCⅡ类分子和ESO-1肽的非共价复合物。
35.治疗罹患有一种癌症状态的受试者的方法，其包括向所述受试者施以一种抗体，该抗体可与相关于所述状态的癌症细胞表面所表达的ESO-1肽特异性结合，所述抗体与一种抗癌剂偶联，其用量足以治疗所述癌症状态。
36.在受试者中预防癌症状态发生的方法，其包括施予一定量的权利要求9的组合物，其用量足以在所述的受试者中预防所述的癌症状态发生。
37.在受试者中预防癌症状态发生的方法，其包括施予一定量的权利要求10的组合物，其用量足以在所述受试者中预防所述癌症状态发生。
38.在受试者中预防癌症状态发生的方法，其包括施予一定量的权利要求14的组合物，其用量足以在所述受试者中预防所述癌症状态发生。
39.在受试者中预防癌症状态发生的方法，其包括施予一定量的权利要求13的表达载体，其用量足以在所述受试者中预防所述癌症状态发生。
40.在受试者中预防癌症状态发生的方法，其包括施予一定量的权利要求15的组合物，其用量足以在所述受试者中预防所述癌症状态发生。
41.在受试者中预防癌症状态发生的方法，其包括施予一定量的权利要求17的重组细胞，其用量足以在所述受试者中预防所述癌症状态发生。
42.在受试者中筛查癌症的方法，其包括检测取自所述受试者的标本的(ⅰ)MHCⅡ类分子和由SEQ ID NO:1所编码蛋白质衍生的肽的复合物，或者(ⅱ)特异性针对所述复合物的辅助性T细胞，其中(ⅰ)或(ⅱ)的存在表示在所述的受试者中癌症存在的可能性。
43.权利要求42所描述的方法，其中所述的肽由SEQ ID NO:8、9或10所定义。
44.用于在受试者中诊断癌症状态的方法，其包括将所述受试者含有免疫反应细胞的样品与由编码权利要求1的多肽的分离的核酸分子所转染的细胞系相接触，并确定所述被转染的细胞系与所述免疫反应细胞间的相互作用，该相互作用指示所述的癌症状态。
45.权利要求44的方法，其中所述的免疫反应细胞为辅助性T细胞。
46.权利要求44的方法，其中所述的多肽由SEQ ID NO:8、9或10所定义。
47.测定癌症状态消退、进展或开始的方法，其包括对取自具有所述癌症状态的患者的样品监测一个参数，该参数选自(ⅰ)NY-ESO-1蛋白的衍生肽和MHCⅡ类分子的复合物，以及(ⅱ)特异性针对该复合物的辅助性T细胞，其中所述参数的量指示所述癌症状态的进展或消退或开始。
48.权利要求47的方法，其中所述的样品为体液或渗出液。
49.权利要求47的方法，其中所述的样品为组织。
50.权利要求47的方法，其包括将所述的样品与特异性结合所述复合物的抗体相接触。
51.权利要求50的方法，其中所述的抗体标记有放射性标记或酶。
52.权利要求50的方法，其中所述的抗体为单克隆抗体。
53.用于诊断癌症状态的方法，其包括检测受试者样品中针对NY-ESO-1所衍生的，与MHCⅡ类分子形成复合物的肽的特异性细胞，所述免疫反应细胞的存在指示所述的癌症状态。
54.权利要求53的方法，其中所述的免疫反应细胞为辅助性T细胞。
55.分离的肽，其由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成。
56.组合物，其包括权利要求55的分离的肽和一种佐剂。
57.组合物，其包括权利要求55的分离的肽和至少一种其它的肽，该其它肽的氨基酸序列在由SEQ ID NO:1所编码的蛋白中可以找到，而且它可与MHC分子形成复合物。
58.权利要求57的组合物，其中所述的MHC分子为Ⅰ类分子。
59.权利要求57的组合物，其中所述的MHC分子为Ⅱ类分子。
60.权利要求57的组合物，其中所述的至少一种其它的肽由SEQ IDNO:4、5、6、8、9或10所定义。
61.分离的核酸分子，其由编码权利要求55的分离的肽的核苷酸序列组成。
62.表达载体，其包括权利要求61的分离的核酸分子，其可操作地连接至一个启动子。
63.权利要求55的分离的肽和HLA-A2分子所形成的复合物。
64.重组细胞，其包括权利要求61的分离的核酸分子。
65.重组细胞，其包括权利要求62的表达载体。
66.不增殖的细胞，在其表面表达权利要求63的复合物。
67.组合物，其包括权利要求66的不增殖的细胞和一种佐剂。
68.用于刺激溶细胞性T细胞增殖的方法，其包括接触溶细胞性T细胞，所述的溶细胞性T细胞特异性针对权利要求55的肽与HLA-A2分子形成的复合物，所用的量足以刺激所述的溶细胞性T细胞增殖。
69.权利要求68的方法，其中所述的复合物是以组合物的形式施予。
70.权利要求68的方法，其包括以不增殖的细胞的形式施予所述的复合物，所述的细胞在其表面提呈该复合物。
71.用于刺激溶细胞性T细胞增殖的方法，其包括对HLA-A2阳性的细胞施予一定量的权利要求55的肽，所用的量足以产生刺激溶细胞性T细胞增殖所需足量的所述肽与HLA-A2分子的复合物。
72.权利要求71的方法，其包括施予包含在组合物中的所述肽，所述组合物中还包括一种佐剂。
73.权利要求71的方法，其中所述的组合物包括至少一种其它的肽。
74.分离的抗体或抗体的结合片段，其结合一种蛋白，所述的蛋白由分离的核酸分子编码，所述的核酸分子的互补序列在严谨的条件下同包括SEQ ID NO:1的54-593位核苷酸的核酸分子杂交。
75.权利要求74的分离的抗体，其中所述的抗体为单克隆抗体。
76.权利要求74的分离的抗体，其中所述的抗体为嵌合抗体。
77.权利要求76的分离的抗体，其中所述的嵌合抗体包括带有小鼠CDR区的人源化抗体。
78.杂交瘤细胞系，其产生权利要求75的单克隆抗体。
79.用于在样品中筛选癌症的方法，其包括将所述样品与权利要求74的分离的抗体相接触，并确定所述抗体与靶的结合作为癌症的指示物。
80.权利要求79的方法，其中所述的癌症为黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、甲状腺癌、膀胱癌或淋巴瘤。
81.用于在样品中确定抗癌症相关抗原的抗体存在的方法，其包括将所述样品与分离的蛋白相接触，并确定其针对抗体的结合，从而确定所述样品中抗癌症相关抗原的抗体的存在，其中所述蛋白由包括SEQ ID NO:1的54-593位核苷酸的核酸分子所编码。
82.用于确定癌症状态消退、进展或开始的方法，其包括监测有所述癌症状态之患者的样品中选自下组的参数(ⅰ)NY-ESO-1蛋白、以及(ⅱ)衍生自NY-ESO-1蛋白的肽，用可结合(ⅰ)或(ⅱ)的抗体实施监测，其中所述参数的量指示所述癌症状态的进展、消退或开始。
83.权利要求82所述的方法，其中所述样品为体液或渗出液。
84.权利要求82的方法，其中所述的样品为组织。
85.权利要求84的方法，其中所述的抗体标记有放射性标记或酶。
86.权利要求84的方法，其中所述的抗体为单克隆抗体。
87.用于治疗罹患有一种癌症状态的受试者的方法，其包括施予所述受试者一种抗体，其与相关于所述癌症状态的癌症细胞表面所表达的NY-ESO-1蛋白或ESO-1衍生的肽特异性结合，所述的抗体与一种抗癌剂偶联，其用量足以治疗所述的癌症状态。
88.用于治疗罹患有一种癌症状态的受试者的方法，其包括施予所述受试者一种特异性结合NY-ESO-1的抗体，所述抗体与一种抗癌剂偶联，其用量足以治疗所述的癌症状态。
89.分离的蛋白，其由含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的分离的核酸分子所编码的蛋白的至少10-121位氨基酸和最多10-180位氨基酸组成。
90.权利要求89的分离的蛋白，其由10-121位氨基酸组成。
91.权利要求89的分离的蛋白，其由10-180位氨基酸组成。
92.权利要求89的分离的蛋白，其中所述的蛋白已糖基化。
93.免疫原性组合物，其包括权利要求89的分离的蛋白和一种载体。
94.用于测定样品中针对癌症相关抗原的抗体存在的方法，其包括将所述样品与权利要求89的分离的蛋白相接触，并确定对所述蛋白的结合来确定所述样品中针对癌症相关抗原的抗体。
全文摘要
本发明涉及结合MHCⅠ类和MHCⅡ类分子的肽。这些肽在不同的治疗和诊断情况下是有用的。
文档编号C07K16/00GK1303300SQ99806448
公开日2001年7月11日 申请日期1999年3月24日 优先权日1998年4月17日
发明者伊丽莎白·斯托克特, 埃尔克·贾格尔, 陈耀桢, 马修·斯坎伦, 克努特·亚历山大, 劳埃德·J·奥尔德, 阿利·格里, 格尔德·里特, 简·W·德里奥特 申请人:路德维格癌症研究院