专利名称：与hla-a2分子形成复合物的分离的mage-3衍生肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫遗传学和肽化学，尤其涉及在各方面用途广泛的九肽、十肽、十一肽等肽类，包括免疫原及HLA-A2分子的配位体。更具体地，本发明涉及所谓的“肿瘤排斥抗原”，它来源于MAGE-3基因编码的肿瘤排斥抗原前体并由MHCI类分子HLA-A2所呈递。背景和现有技术有关癌细胞被宿主有机体识别或是这种识别作用的丧失的研究已在许多不同的方向上开展起来。对该领域的了解意味着对基础的免疫学及肿瘤学的一些了解。
在小鼠肿瘤方面的早期研究揭示出，这些被呈递的分子能够在把肿瘤细胞移植到同源动物体内时导致对这些肿瘤细胞的排斥作用。这些分子被受体动物的T-细胞“识别”，唤起一种细胞溶解性T-细胞反应，将移植的细胞溶解。这一证据的第一次获得是在体外用化学致癌物质，例如甲基胆蒽诱发的肿瘤中。后来发现由肿瘤所表达的能引起T-细胞反应的抗原在每种肿瘤中是不同的。见以下有关讲授用化学致癌物诱发肿瘤及细胞表面抗原差异的文献普莱恩等，全国癌症研究所杂志18769-778(1957)；克莱恩等，癌症研究201561-1572(1960)；格罗斯，癌症研究3326-333(1943)；巴索莫布里奥，癌症研究302458-2462(1970)。这一类抗原后来被称作“肿瘤特异性移植抗原”或“TSTAS”。在观察到当用化学致癌物诱导时这类抗原的存在以后，当在体外通过紫外照射诱发肿瘤时也得到了类似的结果。见克里普克，全国癌症研究所杂志53333-1336(1974)。
当在上述类型的肿瘤中观察到T-细胞介导的免疫反应时，自发性肿瘤通常被认为是非免疫原性的。因而相信在这些肿瘤携带者体内不会出现能引起针对这些肿瘤的反应的抗原。见惠特等，英国癌症杂志33241-259(1976)。
tum-抗原呈递细胞株家族是通过诱变小鼠肿瘤细胞或细胞株而得到的致免疫性突变体，如博恩等，实验医学杂志1521184-1193(1980)所述，该文献引入本文作参考。为了验证，通过突变在同源小鼠中不产生免疫应答并将形成肿瘤的肿瘤细胞(即“tum-”细胞)而获得tum-抗原。当这些tum+细胞被诱变时，它们被同源小鼠排斥，不能形成肿瘤(因而叫“tum-”)。见博恩等，美国全国科学进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)74272(1977)(引入本文作参考)许多种类型的肿瘤已被发现表现出这种现象。见弗罗斯特等，癌症研究43125(1983)。
因为tum-突变体能产生一个免疫排斥过程，因而它们似乎不能形成进行性的肿瘤。支持该假说的证据包括，不能以正常方式形成肿瘤的“tum-”肿瘤突变体，在其免疫系统被亚致死量射线处理抑制过的小鼠中又恢复了形成肿瘤的能力。见范佩尔等，美国全国科学进展765282-5285(1979)。还包括观察到的腹腔注射的肥大细胞瘤P815 tum-细胞在以指数级数增殖12-15天后，在注入淋巴细胞及巨噬细胞仅仅几天后就消失了。(乌滕霍夫等，实验医学杂志1521175-1183，1980)。更多的证据包括观察到小鼠获得了一种免疫记忆，这样使得它们能抵抗随后的同种tum-突变体的攻击，即使是在给予同种tum-突变体之前给予免疫抑制量的射线时。见博恩等，美国全国科学进展74272-275(1977)；范佩尔等，同上；乌滕霍夫等，同上。
后期的研究发现，当自发性肿瘤易被诱变时，就生产出能引起反应的致免疫性突变体。确实，这些突变体能够引发一种针对原始肿瘤的免疫保护性反应。见范佩尔等，实验医学杂志1571992-2001(1983)。由此可见在肿瘤中引起作为同源排斥反应的靶的物的“肿瘤排斥抗原”的呈递是可能的。在外源基因转染到自发性肿瘤中时也得到了类似的结果。见费尔龙等，癌症研究482975-1980(1988)。
已经辩认出一种抗原，它被呈递于肿瘤细胞的表面，并被细胞溶解性T细胞所识别，从而导致溶解。后文中将把这类抗原称作“肿瘤排斥抗原”或“TRAs”。TRAs可能也可能不会引起抗体反应。有关这些抗原的进一步的研究是通过体外的细胞溶解性T细胞特征研究，例如通过特定细胞溶解性T细胞亚系(后文中称之为“CTL”)对抗原的鉴定的研究而进行的。该亚系在识别被呈递的肿瘤排斥抗原后增殖，呈递抗原的细胞被溶解。特征性研究已经鉴别出特异性裂解表达该抗原的细胞的CTL克隆。这些工作的实例可见莱维等，最新癌症研究241-59(1977)；博恩等，实验医学杂志1521184-1193(1980)；布鲁纳等，免疫学杂志1241627-1634(1980)；马延可斯基等，欧洲免疫学杂志1241627-1634(1980)；马延可斯基等，欧洲免疫学杂志126406-412(1982)；帕拉第诺等，癌症研究475074-5079(1987)。其它类型的被CTLS识别的抗原也要求进行这类分析，包括次要组织相容性抗原，雄性特异性H-Y抗原，以及在此讨论的被认为是“tum-”抗原的抗原。
以上所述的肿瘤的一个范例是P185。见德普林恩等，美国全国科学进展852274-2278(1988)；兹科拉等，EMBO J.91041-1050(1990)，以及西比尔等，实验医学杂志17235-45(1990)，所述文献引入本文作参考。P815肿瘤是一种肥大细胞瘤，用甲基胆蒽在DBA/2小鼠中诱发，并以体外肿瘤及细胞株形式培养。P815株经过诱变后产生许多tum-突变体，包括P91A(德普林恩，同上)，35B(兹科拉，同上)以及P198(西比尔，同上)突变体。与肿瘤排斥抗原形成对照的是-并且这是一个关键性的差别-tum-抗原仅仅在肿瘤细胞被诱变后才呈递。肿瘤排斥抗原呈递于给定的无须诱变的肿瘤细胞。因此，一种细胞株可以是tum+的，例如称作P1的株，也能够被引发而产生tum-突变体。由于tum-的表型与其父代细胞株有差异，因此可以预期这两种细胞株的DNA也会有差别，这种差别就可以被开发来在tum-细胞中定位感兴趣的基因。其结果是，已经发现tum-突变体，例如P91A，35B和P198，其基因与其正常等位基因的差别在于基因的编码区域发生了点突变。见兹科拉和西比尔，同上，以及卢尔秦等，细胞58293-303(1989)。已证明本发明的TRAs不是这种情况。这些文献还阐明了衍生于tum-抗原的肽为了被CTLs识别而被Ld分子呈递。P91A被Ld呈递。P35被Dd以及P198被Kd所呈递。
于1992年5月22日申请的PCT申请PCT/US92/04354，讲授了一个人的肿瘤排斥抗原前体编码基因家族，称作MAGE家族。这些基因中的几个还在以下文献中讨论过范德布鲁根等，科学2541643(1991)。现已清楚MAGE家族的各种基因在肿瘤细胞中表达，并可作为诊断这种肿瘤的标记，并用于该文讨论的各种应用。另外参见特拉韦尔萨里等，免疫遗传学35145(1992)；范德布鲁根等，科学2541643(1991)。有关某蛋白质被修饰及其在细胞表面呈递的机制现在已得到很好的证明。对该领域发展的粗略的了解可参看巴林纳戈“获得一些‘基础’MHC如何结合肽”，科学257880(1992)；弗里蒙特等，科学257919(1992)；马兹目拉等，科学257927(1992)，拉特恩等，科学257964(1992)。这些文献普遍地指出的一个要求是，这些结合到MHC/HLA分子的肽长度为9个氨基酸(一种“九肽”)，而且九肽的第一个和第九个残基很重要。
有关MAGE家族基因的研究现已揭示出，在一些肿瘤细胞的表面确实呈递着某特定的九肽，而且要求呈递九肽的分子是HLA-A1。MAGE-1肿瘤排斥抗原(TRAs或九肽)复合物导致呈递它的细胞被细胞溶解性T细胞(“CTLs”)所溶解。
应注意的是，例如汤森德等的申请号___，申请日____，以及梅利夫的申请号___，申请日___中的其它MAGE衍生肽类。
美国专利申请Serial No.07/938,334(1992年8月31日申请)及073,103，(1993年6月7日申请)的研究表明，比较MAGE-1基因中编码相关九肽的区域与各种MAGE基因的同源区域时，有着大量的同源性。实际上，这些观察结果导致本发明的一个方面，即九肽家族中的所有成员具有相同的N-端和C-端氨基酸。这些九肽可用于各种目的，包括用作免疫原，无论是单独使用还是与载体肽偶联。九肽已有足够的大小以构成抗原决定簇，由其而产生的抗体可用来鉴定这些九肽，无论其单独存在，或者作为一个较大的多肽的一部分。
这些文献，尤其是申请号为073,103的申请，显示出在HLA-A1与MAGE-3之间的一种联系；然而，仅仅有大约26％的白人和17％的黑人在其细胞表面呈递HLA-A1分子。因此，寻找一些能被其它类型的MHC分子呈递的肽的信息是极其有用的，这样相当比例的人口将从以上的讨论过的研究工作中受益。
现在已经发现，MAGE-3衍生肽的抗原呈递并非仅仅局限于HLA-A1分子。本发明鉴定出了一些肽类，它们能与MHCI类分子HLA-A2形成复合物。这一发现的应用，包括在治疗和诊断方面的用途，都在本发明的内容之内并在下文中描述。优选实施方案的详细描述实施例1如上文所述的申请No.073,230和PCT/US92/04354(引入本文作参考)，MAGE-3基因序列已知。类似地，已知HLA-A2细胞由编码MAGE-3的核酸分子转染后被细胞溶解性T细胞溶解(参看申请No.037,230及申请No.073,103，全文引入本文作参考)。
这些发现建议了MAGE-3基因编码的氨基酸序列以及尼吉曼等，欧洲免疫学杂志231215(1993)(引入本文作参考)所开发的计数系统以鉴定源自MAGE-3并推定结合HLA-A2MHC分子的肽类。这篇文献描述了一个系统，其中“锚着”(anchor)，“强”和“弱”氨基酸沿多肽分布。锚着位在第二与第九氨基酸。强氨基酸可以分布在3个可能位置上，弱氨基酸可能分布在4个位置上。九肽的最大数目可能62×43×24或36，864。这种肽类已得到鉴定，并在下文进一步引用。
实施例2用蛋白合成仪合成了用前述方法鉴定的肽类，并以0.5mM溶解在0.9％NaCl，5％DMSO(或5％DMF，专为肽SEQ ID NO3)。这些肽溶液贮存在-80℃以备使用。
为测定肽类是否结合到HLA-A2分子，使用了细胞系174CEMT2。该细胞系在舍兰德罗等，自然345449-452(1990)和斯派斯等，自然348744-747(1990)(引入本文作参考)中有述。这个细胞系在肽类向内质网即MHCI类异二聚体组装场所转移途径中有缺陷，其可以组装MHCI类分子但不稳定，当细胞溶解时经过夜培养而会分解成自由重链和轻链。然而，这种异二聚体会在体外因加入合适的肽配位体而稳定。参看汤森德等，自然340443-448(1989)；汤森德等，细胞62285-195(1990)；舍兰德罗等，上述文献；舒马赫等，自然350703-706(1991)；埃里奥特等，自然351402-406(1991)；埃尔文等，欧洲免疫学杂志2172025-2031(1991)。这样稳定下来的分子能用MHCI类分子专一的抗体免疫沉淀。
考虑到这一背景，用不含IMDM培养基的血清清洗T2细胞，然后每400ul不含IMDM培养基的血清中悬浮1.0×106个细胞，并加入100ul合成的多肽(终浓度0.1mM，1％DMSO)。所得混合物在37℃孵育过夜。孵育后，细胞先经清洗，然后依次用HLA-A2专一性单克隆抗体BB7.2和FITC标记的多克隆羊抗鼠IgG的结合片段染色。荧光比率用下述公式计算。
实验样品的平均荧光/背景的平均荧光这一公式的值称为“平均荧光比率”或MFR。根据尼吉曼等，上述文献，大于1.5的MFR表示可结合HLA-A2。
鉴定了5种预计可专一结合HLA-A2分子的肽类。用上述方法检定，其中3种即SEQ ID NOS1，3和4可结合HLA-A2分子，其MFR值大于1.5，即肽 MFRM3-44.53STLVEVTLGEV(SEQ ID NO1)3.5M3-108.115 ALSRKVAEL (SEQ ID NO2)2.17(也有小于1.5)M3-195.203 IMPKAGLLI (SEQ ID NO3)2.37M3-220.228 KIWEELSVL (SEQ ID NO4)2.37M3-227.286 ALVETSYVKV (SEQ ID NO5)1.8 (也有小于1.5)肽M3108.116和M3-277，286在某些实验中MFR值小于1.5，未进一步研究。
实施例3根据实施例2中所得结果做了进一步实验。肽M3-220-228用以产生细胞溶解性T细胞克隆，称为CTL4.2。CTL克隆根据赫比尔斯等，欧洲免疫学杂志232072(1993)(引入本文作参考)用T2细胞得到。
一旦CTL克隆分离出来，即被用于铬释放检测，方法按照博恩等，实验医学杂志1521184(1980)(引入本文作参考)。除了T2细胞，能呈递HLA-A2的SK23细胞系也作了检测，结果如下效应细胞(E)CTL4.2靶细胞(T)HLA-A2细胞加SEQ ID NO4E/T比率 ％51Cr释放T2T2+肽 SK23 SK23+肽30 0 91 0 357.5 0 88-1 331.9-1 84-1 140.5-1 57-1 2这些数据表明用SEQ ID NO4脉冲的靶细胞可被细胞溶解性T细胞克隆4.2所专一性溶解。肽不存在时不会发生溶解。
以上描述了源自MAGE-3肿瘤排斥抗原前体而且能与MHCI类分子HLA-A2作用的肽类的鉴定。特别感兴趣的并是本发明的一部分的是以SEQ ID NO3和SEQ ID NO4为代表的肽。这些肽易于通过Mernfield或其它肽合成方法合成。因此SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的分离的肽是本发明的特征。
正如所指出的，这些肽能与HLA-A2结合，这些复合体已被免疫沉淀，导致了本发明的另一方面，即分离的由这些肽中的任何一个与HLA-A2分子形成的复合体。
这些肽及其复合体在多个方面都是有用的。正如所显示出来的，这些肽与HLA-A2可结合，因而它们可用来分析在一个样品中是否存在HLA-A2呈递细胞。肽可以以某种可确定的形式与感兴趣的样品接触，例如一种被标记的肽(放射性标记、显色标记、等等)，或结合到固相支持物上，例如一种柱子或琼脂糖或SEPHAROSE微粒上，以及使用标准的分析方法，结合待确定的细胞。
这些肽及其分离的复合体均可用于生产对前面所提到的复合体有特异性的单克隆抗体或细胞溶解性T细胞克隆。完成此工作所需的方法对本领域熟练技术人员来说很熟悉，而且有关细胞溶解性T细胞克隆的生产在前面已有例子。由于某些癌症细胞呈递MAGE-3衍生肽如SEQ ID NOS3或SEQ ID NO4与HLA-A2的复合体，这些单克隆抗体和细胞溶解性T细胞克隆可做为试剂用于诊断癌症。上述的铬释放分析是用CTLs确定感兴趣的靶细胞的一种分析方法的范例，而且现有技术非常熟悉免疫分析及其操作方法。
如此衍生而来的细胞溶解性T细胞可用于诸如过继转移等方案。见格林伯格等，免疫学杂志136(5)1917(1986)；瑞德尔等，科学257238(1992)；林奇等，欧洲免疫学杂志211403(1991)；开斯特等，细胞59603(1989)所有文献引入本文作参考。在这种方法中，前面所列举出的肽与抗原呈递细胞(“APCS”)结合形成稳定的复合体。已知许多这类方法，例如，披露于刘舍尔等，自然35172-74(1991)；罗美托等，实验医学杂志174603-612(1991)；刘舍尔等，免疫学杂志1481003-1011(1992)；罗美托等，免疫学杂志1503825-3831(1993)；Romero et al.，J.Exp.Med.1771247-1256(1993)；罗美托等，美国专利申请133,407(1993年10月5日申请)等文献上的方法(所有文献引入本文作参考)。随后，使呈递细胞接触细胞溶解性T细胞(源)，产生对感兴趣的复合体有特异性的细胞溶解性T细胞克隆。较好的做法是使用发现于待用CTLs治疗的患者血样中的一种自体性T细胞克隆。CTLs产生之后，就重注入待治疗的对象体内，其剂量应足以改善癌变的状况，如通过溶解癌细胞，抑制其繁殖等。
本发明的其它方面对于熟练技术人员很清楚，在此无须重述。
在此处所用的一些术语与表达仅是出于描述的需要而非限制，并且这些术语和表达的使用不排除任意等价的被显示或描述的特征或其部分，在本发明的范畴之内各种修改是可能的。
序列表(1)一般信息(i)申请人皮埃尔·范德布鲁根蒂尔瑞·博恩-法勒尔卡蒂亚·特拉韦尔萨里凯瑟琳娜·弗莱舍尔(ii)发明名称与HLA-A2分子形成复合物的分离的MAGE-3衍生肽及其应用(iii)序列数5(iv)联系地址(A)联系人Felfe & Lynch(B)街道805第3大道(C)城市纽约市(D)州纽约州(E)国家美国(F)邮编10022(v)计算机可读形式(A)媒体类型软盘5.25寸，360kb存储量(B)计算机IBM PS/2(C)操作系统PC-DOS(D)软件Wordperfect(vi)本申请资料(A)申请号08/217,187(B)申请日1994年3月24日(C)分类435(viii)代理人/代理信息(A)姓名诺曼·D·汉森(B)登记号30,946(C)案号/文档号LUD 5344(ix)电信资料(A)电话(212)688-9200(B)传真(212)838-3884(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO1Thr Leu Val Glu Val Thr Leu Gly Glu Val5 10(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Ala Leu Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu5(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO3Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile5(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO4Lys Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu5(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO5Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val5 10
权利要求
1.分离的肽，选自SEQ ID NO3和SEQ ID NO4组成的一组。
2.权利要求1的分离的肽，命名为SEQ ID NO3。
3.权利要求1的分离的肽，命名为SEQ ID NO4。
4.HLA-A2与权利要求1的分离的肽形成的分离的复合物。
5.权利要求4的分离的复合物，其中所述的肽命名为SEQ ID NO3。
6.权利要求4的分离的复合物，其中所述的肽命名为SEQ ID NO4。
7.特异于HLA-A2与选自SEQ ID NO3和SEQ IDNO4的肽所形成复合物的分离的细胞溶解性T细胞克隆。
8.权利要求7的分离的细胞溶解性T细胞克隆，其中所述的肽是SEQID NO3。
9.权利要求7的分离的细胞溶解性T细胞克隆，其中所述的肽是SEQID NO4。
10.特异性结合HLA-A2与选自SEQ ID NO3和SEQID NO4的肽所形成的复合物的单克隆抗体。
11.权利要求10的单克隆抗体，其中所述的肽是SEQ ID NO3。
12.权利要求10的单克隆抗体，其中所述的肽是SEQ ID NO4。
13.治疗患有癌症的患者的方法，所述癌症的特征是其表面呈递HLA-A2与选自SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的肽所形成的复合物的癌细胞，所述的方法包括将足以溶解所述的癌细胞的量的权利要求7的分离的细胞溶解性T细胞克隆给予患者。
14.权利要求13的方法，其中所述的肽是SEQ ID NO3。
15.权利要求13的方法，其中所述的肽是SEQ ID NO4。
16.权利要求13的方法，其中所述的细胞溶解性T细胞来源于自体细胞溶解性T细胞。
17.鉴定患有癌症的患者的方法，包括在体外将取自所述患者者的样品与对HLA-A2和选自SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的肽形成的复合物有特异性的试剂接触，确定所述的试剂与所述的样品中的细胞的反应以确定癌症状况。
18.权利要求17的方法，其中所述试剂是细胞溶解性T细胞克隆。
19.权利要求17的方法，其中所述试剂是单克隆抗体。
全文摘要
本发明鉴定了源于肿瘤排斥抗原前体NAGE-3的肿瘤排斥抗原。这些“TRAs”结合到MHC I类分子HLA-A2，形成的复合物刺激溶解呈递细胞的细胞溶解性T细胞的产生。肽与复合物可在诊断、治疗中使用，可作为生产抗体的免疫原，或作为生成细胞溶解性T细胞克隆的靶。
文档编号C12N5/06GK1151167SQ95192260
公开日1997年6月4日 申请日期1995年3月21日 优先权日1994年3月24日
发明者皮埃尔·范德布鲁根, 蒂尔瑞·博恩-法勒尔, 卡蒂亚·特拉韦尔萨里, 凯瑟琳娜·弗莱舍尔 申请人:路德维格癌症研究所