一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法
【专利摘要】一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法，通过ELISA方法从蝴蝶兰检测到齿兰环斑病毒ORSV-GZ，利用其枯斑寄主苋色黎进行纯化，RT-PCR扩增该病毒外壳蛋白CP基因并将其克隆至pMD18-T载体后测序并进行核苷酸序列分析。本发明从分子水平对ORSV蝴蝶兰分离物进行鉴定，完成了该病毒分离物的分子鉴定，为兰花病毒的检测、防控及兰花种质资源的保护提供理论基础。
【专利说明】-种齿兰环斑病毒分罔物分子鉴定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方 法。
【背景技术】
[0002] 齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, 0RSV)，隶属烟草花叶病毒属 (Tobamovirus)，基因组为（+)ssRNA。其外壳蛋白（Coat protein，CP)基因的ORF长度为 477bp，编码158个氨基酸残基，蛋白分子量约为18. OkDa，病毒颗粒呈杆状，无包被，长约 300nm，宽约18nm，螺旋对称，螺纹明显，颗粒中轴有沟状构造，病毒颗粒分散在细胞质内呈 晶格排列。ORSV在世界各地商业生产的兰花中分布非常广泛，至少可以感染包括文心兰属 (Oncidium)在内的35种兰属，其所导致的病变症状主要是花叶、环斑、碎色等。除此之外， 齿兰环斑病毒还常与建兰花叶病毒（CymMV)复合侵染兰花，使其叶片形成不规则的褪绿、 条纹、圆斑甚至坏死等症状，进而导致植株生长不良、花小而少，花期缩短等，使兰花的商业 价值大打折扣。
[0003] 近年来，随着兰花市场和种植规模的不断发展，兰花病虫害的发生也日趋严重，其 中以病毒病的危害最重，这些都对兰花产业的健康发展构成极大的威胁。本发明采用血清 学和分子生物学技术（如ELISA、RT-PCR等）从蝴蝶兰分离获得0RSV，克隆其CP基因并对 其序列进行分析，完成了该病毒分离物的分子鉴定，为兰花病毒的检测、防控及兰花种质资 源的保护提供理论基础。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在提供一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法。
[0005] 本发明主要通过ELISA方法从蝴蝶兰检测到齿兰环斑病毒0RSV-GZ，利用其枯斑 寄主苋色黎进行纯化，RT-PCR扩增该病毒外壳蛋白（CP)基因并将其克隆至pMD18-T载体 后测序并进行核苷酸序列分析。具体通过以下技术方案实现：
[0006] -种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法，包括以下步骤：
[0007] 1)采集表现出花叶、褪绿、环斑、碎色的毒病症状的蝴蝶兰样品，经过ELISA检测 为ORSV阳性后摩擦接种于苋色藜，三次单斑分离后保存于苋色藜，并将该病毒分离物命名 为 ORSV-GZ ;
[0008] 2)称取感染ORSV-GZ的新鲜苋色黎叶片，用RNAiso Plus试剂提取其总RNA， 于-80°C保存备用；
[0009] 3)根据GenBank已报道的ORSV外壳蛋白基因设计引物，上游引物：0RSV-CP-F为： 5' -CCGGATCCTATGTCTTACACTATTACAGACCC-3，，下游引物 ORSV-CP-R为：5' -CTCAAGCTTAG GAAGAGGTCCAAGTAAGT-3 ^，以 I ii L 提取的总 RNA 为模板，进行一步 RT-PCR 扩增 ORSV 的 CP 基因，PCR 反应条件：50°C 30min ;94°C 2min ;94°C 30s，53°C 30s，72°C lmin，反应 30 个循环； 72°C延伸lOmin，取I ii L RT-PCR产物进行I %的琼脂糖凝胶电泳分析，应在约477bp左右 观察到DNA条带；
[0010] 4)将上步获得的RT-PCR产物进行纯化，RT-PCR产物纯化后，进行1 %的琼脂糖 凝胶电泳分析并使用微量核酸蛋白分析仪测定其浓度，将RT-PCR产物即ORSV CP基因与 PMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5 a并做过夜培养；
[0011] 5)随机挑取平板上的大肠杆菌单菌落若干分别转入5mL含IOOil g/mL氨苄青霉素 的LB液体培养基中进行振荡培养16h (37°C，200rpm)，采用菌液PCR的方法对各培养物进行 阳性重组子的筛选，提取重组质粒DNA并送上海生工进行基因测序；
[0012] 6)采用DNAMAN7. 0软件对ORSV-GZ和其他11种ORSV分离物的CP基因进行同源 性分析，利用MEGA5. 0软件构建基于其CP基因的系统进化树，采用Neighbor-Joining聚类 分析方法。
[0013] 所述的病毒接种分离过程为：用500目的金刚砂喷洒苋色藜待接种叶片，将感染 ORSV蝴蝶兰叶片于1%磷酸氢二钾溶液（l:10，m/V)中研磨提取（不超过2min)，并将提取 液摩擦接种于苋色藜叶片，随后立即用清水冲洗叶片，洗去金刚砂和多余的溶液，5-10天后 接种叶片应出现较明显的坏死小斑，剪取单个坏死斑点，采用上述接种方法重新接种至健 康的苋色藜叶片，3次单斑分离后可获得单一病毒或病毒株系。
[0014] 本发明步骤（5)中PCR过程为：PCR模板制备：取各培养物（菌液）100i! L， 12000rpm，离心Imin,弃上清，用400 y L无菌水重悬沉淀，沸水浴lOmin，12000rpm离心 5min，上清即为模板；正向通用引物：5 ' -GAGCGGATAACAATITCACACAGG ;反向通用引物： 5 ^ -CGCCAGGGITITCCCAGTCACGAC，退火温度 55°C :循环次数：25 ;取各 PCR 产物 I ii L 进行 1 %的琼脂糖凝胶电泳分析，若在约600bp处出现条带，贝U提取其剩余菌液中的质粒，质粒 送上海生工生物工程有限公司进行测序；
[0015] 本发明的有益效果为通过齿兰环斑病毒分离物的分子鉴定，为兰花病毒的检测、 防控及兰花种质资源的保护提供理论基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图 10RSV CP 基因 RT-PCR 产物；
[0017] 图2是pMD18T-0RSV CP重组质粒的菌液PCR筛选结果；
[0018] 图3是基于ORSV CP基因构建的系统进化树。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0020] 实施例1
[0021] 一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法，包括以下步骤：
[0022] 1)采集表现出花叶、褪绿、环斑、碎色等疑似病毒病症状的蝴蝶兰样品，通过 ELISA方法检测其病毒（ELISA试剂为美国Agdia公司产品，货号：SRA 54301，按其说明书 进行操作）。将ELISA检测为ORSV阳性的叶片研磨后摩擦接种于苋色藜，三次单斑分离后 保存于苋色藜，并将该病毒分离物命名为ORSV-GZ ;
[0023] 2)称取0. Ig感染ORSV-GZ的新鲜苋色黎叶片，用RNAiso Plus试剂提取其总RNA， 于-80°C保存备用；
[0024] 3)根据GenBank已报道的ORSV外壳蛋白基因设计引物。上游引物：0RSV-CP-F为： 5' -CCGGATCCTATGTCTTACACTATTACAGACCC-3，，下游引物 ORSV-CP-R为：5' -CTCAAGCTTAG GMGAGGTCCAAGTMGT-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成。以I ii L提取的总RNA为 模板，进行一步RT-PCR扩增ORSV的CP基因（使用商品化试剂盒"PrimeScript? One St印 RT-PCR Kit Ver. 2"，宝生物大连公司，货号：RR055A，或其它公司同类产品，操作按试剂盒 说明书进行），具体 PCR 反应条件：50°C 30min ;94°C 2min ;94°C 30s，53°C 30s，72°C lmin， 反应30个循环；72°C延伸lOmin。取I ii L RT-PCR产物进行I %的琼脂糖凝胶电泳分析，应 在约477bp左右观察到DNA条带（常规分子生物学实验方法）；
[0025] 4)采用"普通产物纯化试剂盒"（北京天根生化科技有限公司，货号：DP204,或其 它公司同类产品）将上步获得的RT-PCR产物进行纯化，操作按说明书进行。RT-PCR产物纯 化后，进行1%的琼脂糖凝胶电泳分析并使用微量核酸蛋白分析仪测定其浓度。将RT-PCR 产物（ORSV CP基因）克隆至pMD18-T载体中（宝生物大连公司，货号：6011，按载体说明书 进行克隆和大肠杆菌的转化操作）；
[0026] 5)随机挑取平板上的大肠杆菌单菌落若干分别转入5mL含100 y g/mL氨苄青霉素 的LB液体培养基中进行振荡培养16h (37°C，200rpm)。采用菌液PCR的方法对各培养物进 行阳性重组子的筛选，PCR条件：
[0027] @?〇?模板制备：取各培养物（菌液）1001^，12000印111，离心11^11，弃上清，用 400 ii L无菌水重悬沉淀，沸水浴lOmin，12000rpm离心5min，上清即为模板；
[0028] ②正向通用引物：5' -GAGCGGATAACAATITCACACAGG ;反向通用引物： 5' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC，退火温度55°C :循环次数：25)(常规分子生物学操作）。
[0029] ③取各PCR产物I y L进行1 %的琼脂糖凝胶电泳分析，若在约600bp处出现条带， 则提取其剩余菌液中的质粒（采用质粒小提试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司，产品 号：DP103,操作按试剂盒说明书进行）。质粒送上海生工生物工程有限公司进行测序；
[0030] 6)采用DNAMAN7. O软件对ORSV-GZ和其他11种ORSV分离物的CP基因进行同源 性分析，利用MEGA5. O软件构建基于其CP基因的系统进化树，采用Neighbor-Joining聚类 分析方法。
[0031] 实施例2毒原分离
[0032] 用500目的金刚砂喷洒ORSV的枯斑寄主苋色藜叶片，将ELISA方法检测为ORSV 阳性的蝴蝶兰叶片于1 %磷酸氢二钾溶液（1:10, m/V)中研磨提取（不超过2min)，并将研 磨液摩擦接种于苋色藜叶片，随后立即用清水冲洗，洗去金刚砂和多余的溶液。苋色藜置于 防虫温室培养，每天观察。大约5-10天后接种叶片出现较明显的坏死小斑。剪取单个坏死 斑点，采用上述接种方法重新接种至健康的苋色藜叶片。经过3次单斑分离后可获得单一 病毒或病毒株系。活毒采取活体保存和真空冷冻干燥后低温保存备用。
[0033] 实施例3 ORSV CP基因的克隆及测序
[0034] 以感染ORSV-GZ病叶的总RNA为模板（总RNA的提取按"
【发明内容】
"第2)项进 行），采用商品化试剂盒（"？1~;[11165(31^。七1110116 5七6。1?1'-?0?1(;[1:￥61\2"，宝生物大连公 司，货号：RR055A，操作按试剂盒说明书进行），利用特异性引物5' -CCGGATCCTATGTCTTAC ACTATTACAGACCC-3'和 5' -CTCAAGCTTAGGAAGAGGTCCAAGTAAGT-3'进行一步 RT-PCR 扩增 ORSV CP基因。RT-PCR反应体系如表1 :
[0035] 表I RT-PCR反应体系
【权利要求】
1. 一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 采集表现出病毒病症状的蝴蝶兰样品，经过ELISA检测为ORSV阳性后摩擦接种于苋 色藜，单斑分离后保存于苋色藜，并将该病毒分离物命名为ORSV-GZ ; 2) 称取感染ORSV-GZ的新鲜苋色黎叶片，提取其总RNA，于-80°C保存备用； 3) 根据GenBank已报道的ORSV外壳蛋白基因设计引物，上游引物：ORSV-CP-F为：5' -CCGGATCCTATGTCTTACACTATTACAGACCC-3，，下游引物 ORSV-CP-R 为：5' -CTCAAGCTTAGGAA GAGGTCCAAGTAAGT-3';以1 ii L提取的总RNA为模板，进行一步RT-PCR扩增ORSV的CP基 因 ，PCR 反应条件：50°C 30min ;94°C 2min ;94°C 30s，53°C 30s，72°C lmin，反应 30 个循环； 72°C延伸lOmin ;取1 ii L RT-PCR产物进行1 %的琼脂糖凝胶电泳分析，应在约477bp左右 观察到DNA条带； 4) 将上步获得的RT-PCR产物进行纯化，RT-PCR产物纯化后，进行1%的琼脂糖凝胶 电泳分析并使用微量核酸蛋白分析仪测定其浓度，将RT-PCR产物即ORSV CP基因克隆至 PMD18-T载体中； 5) 随机挑取平板上的大肠杆菌单菌落若干分别转入5mL含100 y g/mL氨苄青霉素的 LB液体培养基中进行振荡培养，在37°C、200rpm调价下持续16h后，采用菌液PCR的方法对 各培养物进行阳性重组子的筛选； 6) 采用DNAMAN7. 0软件对ORSV-GZ和其他11种ORSV分离物的CP基因进行同源性分 析，利用MEGA5. 0软件构建基于其CP基因的系统进化树，采用Neighbor-Joining聚类分析 方法。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)病毒接种分离过程为：用500目 的金刚砂喷洒苋色藜接种叶片，将感染ORSV蝴蝶兰叶片于1 %磷酸氢二钾溶液中研磨提取 不超过2min，并将提取液摩擦接种于苋色藜叶片，随后立即用清水冲洗叶片，洗去金刚砂和 多余的溶液；5-10天后接种叶片应出现较明显的坏死小斑，剪取单个坏死斑点，采用上述 接种方法重新接种至健康的苋色藜叶片，3次单斑分离后获得单一病毒或病毒株系。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：感染ORSV蝴蝶兰叶片与1 %磷酸氢二钾 溶液的质量体积比为1:10。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5)中PCR过程为取各培养物菌液 100 ii L，12000rpm，离心lmin，弃上清，用400 y L无菌水重悬沉淀，沸水浴10min，12000rpm 离心5min，上清即为模板；正向通用引物：5' -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG ;反向通用引 物：5' -CGCCAGGGITITCCCAGTCACGAC，退火温度 55°C:循环次数：25 ;取各 PCR 产物 1 ii L 进 行1 %的琼脂糖凝胶电泳分析，若在约600bp处出现条带，则提取其剩余菌液中的质粒进行 测序。
【文档编号】C12Q1/70GK104450958SQ201410679529
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】乙引, 洪鲲, 万晴姣, 张宇斌 申请人:贵州师范大学