专利名称：：一种分离小分子rna的方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
。更具体地说，本发明涉及一种纯化小分子RNA的方法及用于该方法的试剂盒。
背景技术：
：目前，小分子RNA—一100个核苷酸或更小的RNA分子是极为引人关注的领域，并且在分子治疗领域很有前途。这些小分子RNA主要包括微小RNA分子(microRNA，简写做miRNA)和小干扰RNA分子(smallinterferingRNA，简写做siRNA)，由于这两种RNA分子都能够与耙mRNA杂交，所以能够调节基因表达。在不同的组织、器官和不同的发育时期，miRNA和/或siRNA的表达是不同的，它们可能在各种生物发育、生理活动、疾病发生过程中起重要的调节作用。这些小分子RNA的错误表达会导致肿瘤、自身免疫性疾病等的发生。因此，对这些小分子RNA的研究，尤其是对它们的定量研究将对它们的生物功能的研究起到重要推动作用。但是，以目前广泛进行的miRNA的研究为例，无论是Northernblot、miRNA克隆还是实时定量PCR方法，都是使用总RNA作为样品。由于成熟的miRNA分子产生于miRNA前体，与其前体具有共同的序列，因此使用总RNA进行研究必然导致不准确的结果。对于小分子RNA研究来说，一个关键问题就是分离得到这些小分子RNA。因此，本领域仍需提供一种简单高效的分离小分子RNA的方法。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种小分子RNA的分离方法，该方法利用分子筛的原理，利用外力使含有小分子RNA的样品通过固体支持物，大分子物质被固体支持物所截留，小分子的RNA能够通过固体支持物上的微孔并被收集。为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种分离小分子RNA的方法，该方法包括以下步骤1)将含有小分子RNA的样品施加到固体支持物上；2)施加外力使含有小分子RNA的样品通过固体支持物；3)收集通过固体支持物的小分子RNA;4)使用或表征所述小分子RNA。本发明涉及的小分子RNA，通常被理解为至多含有100个核苷酸或更少。小分子RNA包括miRNA和siRNA分子。在本发明的一些实施方式中，小分子RNA最多有100个核苷酸或更少，最多有70个核苷酸或更少，或最多有30个核苷酸或更少，或最多有25、24.、23、22、21、20、19、18、17个核苷酸或更少。在一些情况下，小分子RNA是双链的。在另一些情况下，小分子RNA是单链的，单链的小分子RNA可以含有自互补区域。这样的自互补区域可以是l个，也可以是多个。这些区域可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO或更多碱基对，而且这些互补可以是100%互补或包含一些错配，如这些区域中可包含l、2、3、4、5、6、7、8、9、IO或更多碱基错配。具体来讲，本发明方法可用于分离最长有100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17或更少个核苷酸的小分子RNA，和从这些整数中可以引出的所有范围。可用于分离小分子RNA的样品包括含有这种分子的任何样品。该样品可以是包含细胞、组织、器官或其他生物样品的物质，或者该样品可以是反应混合物，如通过酶学、合成和/或重组方法生产的小分子RNA的混合物。使含有小分子RNA的样品通过固体支持物的外力包括离心力和空气压力。所述离心力的大小为9530g12530g，所述空气压力大小为函MPa2200MPa。在较佳的实施方案中，所述含有小分子RNA的样品为自组织中提取的总RNA。分离时使用的固体支持物为离心纯化柱，纯化柱上的滤膜的规格为2500035000Dalton，优选为30000Dalton。使含有小分子RNA的样品通过离心纯化柱的外力为离心力，离心力大小为953012530g，优选为ll画go本发明另一方面还提供了一种用于分离小分子RNA的试剂盒，该试剂盒含有固体支持物、按照上述分离小分子RNA的方法进行纯化的说明书。由于小分子RNA在生物生长发育和疾病发生过程中具有重要作用，对小分子RNA的研究具有重要的应用前景和临床价值。因此，本发明提供的小分子RNA分离纯化方法及其试剂盒对小分子RNA研究具有重要意义。图l为纯化前后RNA电泳图，从左至右依次是纯化后的RNA、未经纯化的总RNA，DL2000分子量标记。图2为纯化前后U6snRNA荧光定量PCR曲线图，曲线从左至右依次为未经纯化的总RNA样品中U6snRNA扩增的三重复曲线、纯化后的RNA样品中U6snRNA扩增的三重复曲线、U6snRNA的无模板对照图3为纯化前后hsa-mir-21荧光定量PCR曲线图，曲线从左至右依次为未经纯化的总RNA样品中hsa-mir-21扩增的三重复曲线、纯化后的RNA样品中hsa-mir-21扩增的三重复曲线、hsa-mir-21的无模板对照.具体实施例方式下面将结合实施例及附图进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。实施例1总RNA的制备(1).往离心管中加入500ulEzo1。(2).称取适量的组织样品(1020mg左右)于2ml离心管中，匀浆。(3).匀浆后补加500ulEzo1，将离心管上下颠倒混匀，室温放置10min。(4).加入200ulRNA专用的三氯甲垸，剧烈上下颠倒混匀，直至离心管中的液体彻底混匀，成乳白色状。(5).室温放置5min，12000rpm/min离心15min。(6).小心将上清转移至另一干净的1.5ml离心管中，避免吸动中层蛋白相和下层有机相。(7).往上清中加入500iM预冷的RNA专用的异丙醇，室温放置5min。10000rpm/min离心10min。(8).小心弃尽上清，加入lmlRNA专用的75%的乙醇洗涤沉淀，10000rpm/min离心10min。(9).小心弃尽上清，置于室温晾千乙醇，每管加入20nlDEPC水溶解，混匀。实施例2cDNA的制备(1).超滤纯化将按照实施例1制备的总RNA共200ul，混匀，取100ul加至超滤柱(超滤膜规格为30，000Dalton"87baseRNA，U6snRNA=106base,hsa-mir-21=22base),11000g离心15min后取21用作逆转录。另100ul则取出2ul直接用作逆转录。(2).RNA逆转录将上述抽提和纯化得到的RNA分别用U6和hsa-mir-21两种RNA特异逆转录引物(引物序列U6:GAACGCTTCACGAATTT;has-mir-21:5，-CGCGGTGACATCAGATGCGTTGCGTATACGCGCACCGCGTCAACA-3，)进行逆转录，制备cDNA模板。逆转录中所用的缓冲液和酶均为Promega公司产品。(i).逆转录体系:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(ii).逆转录反应条件:反应条件为16°C30min;42°C30min;85°C10min。。实施例3荧光定量PCR检测(1).cDNA模板的稀释将上述逆转录后得到的cDNA稀释3倍，往20n1的体系中加入40P1RNase應asefreeddH20，混匀。(2).荧光定量PCR体系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(3).反应条件:(i)95°C3min;(ii)95°C15s;(Hi)55°C30s;(iv)72。C30s;第ii至第iv步共40个循环。图1是利用本发明所述的分离小分子RNA方法对总RNA进行纯化前后的电泳对比图。条带1为对总RNA进行纯化之后的RNA，与条带2未进行纯化的总RNA进行比较，纯化后的RNA中基本不含有100bp以上的大分子的RNA。图2为纯化前后U6snRNA荧光定量PCR曲线图，曲线从左至右依次为未经纯化的总RNA样品中U6snRNA扩增的三重复曲线、纯化后的RNA样品中U6snRNA扩增的三重复曲线、U6snRNA的无模板对照。纯化过程中所采用的离心纯化柱中的超滤膜规格为30000Dalton，约等于87个碱基长度的RNA。实验中用于验证的U6snRNA长度为106个碱基，理论上总RNA经过纯化之后应该滤除全部U6snRNA。从图2定量PCR的结果可以看出，未经过纯化的总RNA样品中U6snRNA扩增的Ct平均值为11.75，而经过超滤纯化后的RNA样品中U6snRNA扩增的Ct平均值为22.80，两者相差11.05个循环，由于定量PCR中每隔3.3个循环，初始模板量就有10倍的差距，也就是说超滤后的U6snRNA的初始含量是未经超滤纯化处理的1/2200倍，即0.04%。这个实验结果说明99.96%的长度为106个碱基的U6snRNA被滤除了。图3为纯化前后hsa-mir-21荧光定量PCR图，曲线从左至右依次为未经纯化的总RNA样品中hsa-mir-21扩增的三重复曲线、纯化后的RNA样品中hsa-mir-21扩增的三重复曲线、hsa-mir-21无模板对照。实验中用于验证的hsa-mir-21长度为22个碱基，理论上hsa-mir-21不应该被滤除。从图3定量PCR的结果可以看出，纯化前后hsa-mir-21扩增的Ct值并未发生较大的改变，位于15.0115.82之间，表明纯化前后hsa-mir-21的初始模板的含量未发生变化，即长度为22bp的小分子RNA未被滤除。尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。权利要求1.一种从样品中分离小分子RNA的方法，该方法包括以下步骤1)将含有小分子RNA的样品施加到固体支持物上；2)施加外力使含有小分子RNA的样品通过固体支持物；3)收集通过固体支持物的小分子RNA；4)使用或表征所述小分子RNA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品为从细胞或组织中提取的总RNA。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小分子RNA包括microRNA和/或siRNA分子。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述小分子RNA是microRNA。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体支持物的规格为拦截分子量为25000Dalton及以上的分子。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述固体支持物的规格为拦截分子量为35000Dalton及以上的分子。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体支持物为离心纯化柱。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外力为离心力，离心力为9530g12530g。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外力为气体压力，气体压力为1200MPa2200MPa。10.—种分离小分子RNA的试剂盒，该试剂盒含有固体支持物、按照权利要求1所述方法进行纯化的说明书。全文摘要本发明提供了一种新的分离小分子RNA的方法，该方法包括以下步骤1)将含有小分子RNA的样品施加到固体支持物上，2)施加外力使含有小分子RNA的样品通过固体支持物，3)收集通过固体支持物的小分子RNA，4)使用或表征所述小分子RNA。本发明还提供了使用上述方法的纯化小分子RNA的试剂盒。文档编号C12N15/10GK101392247SQ200810036769公开日2009年3月25日申请日期2008年4月29日优先权日2008年4月29日发明者张佩琢,李志甲,段春晓,谭玉龙申请人:苏州吉玛基因药物科技有限公司