专利名称：利用小鼠一氧化氮合成酶基因提高植物的抗旱性的制作方法
技术领域：
本发明属于作物遗传育种领域，具体地说利用农杆菌将小鼠一氧化氮合成 酶基因转化到植物巾，使之能在植物中高效表达，提高植物的抗旱能力。
背景技术：
干旱是影响植物生长发育的主耍环境因子之一，干旱能影响植物的水分状态，使植物缺水遭受伤害。据统计，世界干旱、半干旱地区占陆地面积的34. 9 %， 干旱对世界作物产量的影响，在诸多自然逆境中占首位，其危害相当于其它灾 害之和。我国干旱、半干旱地区约占国土面积的52%，全国灌溉区年缺水约300 亿立方。因缺水而少收粮食350 400亿公斤；特别是我国主要产粮区如华北、 东北和西北，是我国缺水最严重的地区。在我国西部和北部地区，干旱胁迫还 严重地影响了地表植被的生长，导致了越来越严重的牛态问题。如草地退化、 土壤荒漠化等。因此了解干旱胁迫下细胞内保存水分的机制很重要。在干旱胁 迫条件下，植物会诱导表达一些基因，通过研究这些被干旱胁迫所诱导的基因， 可能找到植物对干旱胁迫的适应及抵御机理，并为植物抗早基因工程提供理论 支持。近年来，相继从拟南芥等植物中克隆出了一些受干旱诱导的基因，如蛋 白激酶基因、光合基因、渗透调节基因、功能蛋白基因等，干旱胁迫信号经历 一系列的传递过程，最后诱导这些特定基因的表达。同时也从高等植物中分离 出一系列调控干旱相关基因表达的编码转录因子的基因，通过转录因子之间以 及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制干旱等胁迫因子诱导的基因表 达。一氧化氮(NO)是近年来发现的一种非常重要的生物活性分子，它普遍存 在于原生动物、细菌、酵母、动植物屮。NO可以作为动物生理代谢过程中一种 关键的第二信使,参与血管松弛、神经传导以及先天性免疫反应。NO是一种具有 自由基性质的气体分子，它可以获得一个电子或者失去一个电子形成N(T和NO—。 由于N0有一个不配对的电/，所以它很容易和氧气(02)、超氧(()々 )和其 它化合物发生反应，在供氧充足的情况下N0可以与0—2'反应生成过氧化亚硝酸(0N00—)。自1996年后，越来越多的研究表明NO参与很多植物生理代谢调 节。NO可以作为植物抗逆反应的信号分于，同时参与植物的呼吸作用、光形态 建成、种子萌发、根的生长发育、果实组织的成熟和衰老。但总体来说，大多 数领域的研究仍处于起步阶段，很多问题，诸如NO在植物生长发育中的作用、 N0与植物抗逆性、NO与植物内源激素的关系、NO的分子作用机制等，都有待进 一步深入探时。植物受到干旱胁迫时，体内活性氧的浓度发生了很大变化。解除活性氧种 类毒害的酶，例如谷胱甘肽还原酶、超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化物酶， 在对干旱胁迫的反应中增加；降低叶片含水量和随后的气孔关闭均能产生超氧 阴离子自由基；在干旱过程中光呼吸活性也伴随乙醇酸氧化酶活性的增加，提 高过氧化氢的合成。大量试验证实了NO参与活性氧自由基的形成，并与活性氧协同作用诱导植 物抗逆反应。NO可以抑制烟草的过氧化氢酶和抗坏血酸酶的活性。N0通过抑制 顺乌头酸酶来参与植物的抗逆反应， 一方面是由于线粒体顺乌头酸酶被NO失活 后，降低经线粒体的电子传递链电子流，从而减少活性氧(R0S)的生成；另一方 面由T顺乌头酸酶活性被抑制后导致细胞内柠檬酸浓度升高，诱导与抗逆有关 的交替氧化酶(A0X)活性上升，而后者也可以减少ROS的产牛。Jiang等在玉 米干旱胁迫响应中，观察到由于ABA诱导NADra氧化酶活性增强而使R0S水平 升高，这表明ABA、 R0S和N0之间关系紧密(植物2002) 。 Zhang等在研究外 源NO影响渗透胁迫下小麦种子萌发及活性氧代谢时，发现NO供体硝普钠(SNP) 通过促进渗透胁迫下过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的上升 和脯氨酸含量的积累，抑制脂氧合酶(LOX)的活性，提高渗透胁迫下小麦种子萌 发过程中的抗氧化能力(植物学报2003)。NO可能通过脱落酸调节植物的抗旱反应。干旱胁迫能迅速在植物根系、叶 片等部位诱发植物激素脱落酸(ABA)的合成。早在上世纪60年代，Wright等证 明渗透胁迫可诱导细胞合成ABA，当植物受到干旱、低温、盐害等环境胁迫时(自 然杂志1969)，细胞迅速积累ABA。 ABA积累与植物品种间抗早性强弱有关，ABA含量可作为抗旱性鉴定的评价指标之一。Zhao等用离体小麦根尖为材料进行研究，发现干旱胁迫后20min， N0合成 酶活性明显增髙；60min后ABA开始积累。这种积累能够被N0合成酶抑制剂或 NO清除剂所阻断，而且外源N0供体硝普盐同样可在根尖中诱导ABA的积累，这些结果说明NO参与水分胁迫下小麦根尖中植物激素ABA的合成(澳大利亚植 物生理学杂志2001) 。 Lamattinat等研究发现SNP预处理的植物叶片在干旱胁 迫后保持的相对含水量(RWC)较高，蒸腾速率和气孔开度下降，离子渗漏减小； SNP的这些作用均能被NO的特异清除剂cPTIO所逆转(植物生理学2004) 。 NO 可能通过环化鸟苷酸(cGMP)途径参与植物的抗逆反应。动物细胞内，NO信号传 导过程中鸟苷酸环化酶起关键作用，NO可通过与血红素铁结合或使半胱氨酸残 基发生S-亚硝基化而激活胞内可溶性的鸟苷酸环化酶，导致cGMP 二级信号的迅 速增加，然后NO通过cGMP激活环式ADP-核糖(cADPR)合成酶，使cADPR大 量合成，cADPR可与胞内转通道结合，促进钙粒子从储存的细胞器中释放。NO 在植物体内存在和动物相似的信号传导模式。利用NO处理烟草叶片或悬浮系细 胞均能诱发内源cGMP的大量积累；而cADPR可诱导液胞中钙的释放，NO处理 蚕豆保卫细胞也能增加细胞质中钙离子浓度。有研究表明，ABA诱导的气孔关 闭现象是通过NO调节保卫细胞中钙离子来实现的，气孔的开关有赖于细胞中的 钾离子和氯离子浓度，ABA提高外向整流的氯离子通道活性和抑制内向整流的 钾离子通道活性都依赖钙离子，NO清除剂cPTIO能够阻止ABA诱导气孔关闭。 有研究表明，NO和ABA可以各自独立诱导气孔关闭，但也存在正协同效应，NO 是一个介导ABA诱导气孔关闭的关键信号分子。以上研究结果都表明，NO可能 是楨物干旱胁迫下一个重要调节分子。作为一个渗透性很强的小分子，它可以 穿过若干层细胞长距离在细胞间穿梭和跨膜扩散，刺激细胞作出应答。在其行 使功能过程中，NO能与其他信号分子如cGMP、 Ca2+、 H202、 ROS和SA等构成 个复杂的信号网络，并调控很多基因的转录。迄今为止，NO的研究结果大都是通过外源NO或者外加NO供体等体外试验 获得，前人的研究报道常出现一些矛盾的结果。本发明通过改变植物内源一氧 化氮含量，提高植物的抗旱性能。发明内容本发明的目的是提供一种小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因，然后该基因转 化入植物中，提高植物的抗旱能力。该基因消除诱导型一氧化氮合成酶基因中591位BamHI切点，763和1070 位EcoRI切点，399， 540和1008位Sacl的切点，故不能被B舰III、 EcoRI和 Sac I限制性内切酶切开。本发明将含有3435bp的小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因(muiN0S) (丽一010927)(美国国立生物技术信息中心)进行改造，利用定点突变方法(Peng 2006，应用微生物和生物技术)将其巾的591位BamHI切点，763和1070位EcoRI 切点，399， 540和1008位SacI切点消除，获得目的基因muiNOS。方法如下 分别在上述6个酶切位点设计正反两个引物591位BamHI切点突变引物591Z:5， CCTCGCTGCA， TCGGCAGG AT， GCAG; 591F 5， CAGGTTGGAC，CACTGCATCC， TGCCGATG。763位EcoRI切点突变引物763Z:5' CAGGCTCTGG， ACTTCACAGC， TCATCC; 763F:5' GCTGTGAAGT， CCAGAGCCTG， AAG。1070位EcoRI切点突变引物:1070Z: 5， GTGGCCTCGA， CTTCCCAGC C， TGC; 1070F:5' CTGGGAAGTC' GAGGCCACCC， ACCTCCAG。399位Sacl切点突变引物399Z: 5 ， CAAGCCTACC， CCTCTGGAGG， AGGTCC TG; 399F:5' CAATGGCATG， AGGCAGGACC， TCCTC。540位SacI切点突变引物540Z:5， CTCACTCTGG，ATGACCTCAT，C; 540F:5， TGGCAAAGAT， GAGGTCATCC， AGAGTG。1008位Sacl切点突变引物1008Z:5， GAGTGGTTCC， AGGAGGTC GG，GTTG; 1008F:5 ， CACTTCAACC， CGACCTCCTG， GAACCAC 。利用相邻位点的引物和基因两端的引物分别扩增出小片段，扩增条件为 94°C预热1 min; 94°C， 30 s， 60°C， 30 s， 72°C， 1 min。共25个循环，PCR 结束后，片断用10%丙烯酰胺胶回收，将上述7个回收片断取10-100 ng为模 板混合，以muiNOSZ和muiNOSF为引物将上述片断拼接，扩增条件为94°C预 热l min; 94°C, 30 s， 60°C， 30 s， 72°C， 4 min。共25个循环。本发明分别用BamHI和Sacl两个限制性内切酶酶切定点突变的小鼠诱导型 一氧化氮合成酶基因，经测定，591位BamHI切点序列改为GGATGC， 763位 EcoR工切点序列改为GACTTC， 1070位EcoRI切点序列改为GACTTC， 399位 Sacl切点序列改为GACCTC， 540位Sacl切点序列改为GACCTC， 1008位Sacl 切点序列改为GAGGTC。然后，37。C酶切2 h，通过T4 DNA连接酶将酶切好的 小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因(muiNOS)与含有双35S启动子的pYPX245 (AY178049)(美国国立生物技术信息中心)植物表达载体连接，酶切鉴定和序 列测定获得了含有目的基因muiNOS的重组质粒pYPXmuiNOS。该表达载体还包含 GUS报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因(中国专利ZL 00 1 19754.8)。本发明利用电击法将质粒导入根癌农杆菌中，根癌农杆菌菌株包括EHA105， LBA4404， GV3101, AGL-1 (购自美国菌种保藏中心)。农杆菌介导方法将小鼠 诱导型一氧化氮合成酶基因转化水稻(刘巧全1998，植物生理学报)、烟草和 番茄等植物中(美国专利6323396)，农杆菌粘花法转化将小鼠诱导型一氧化 氮合成酶基因转化到拟南芥中(Clough 1998，植物学杂志)，验证了转基因植 物对干早的耐受性。本发明有益效果1. 小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因能够持续在植物中表达，该酶产牛的NO 对植物的抗性具有持久性。2. 小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因安全稳定，对环境影响较小。
图1小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因改造方法图。图2小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因植物表达载体构建。图3转化小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因后水稻表现出抗旱能力的提高。
具体实施方式
实施例1:小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因改造首先获得小鼠一氧化氮合成酶基因。取约ioo克小鼠，宰杀后液氮速冻， 放置-7(TC冰箱中保存以备提取总RNA。 cDNA合成试剂盒为Clontech公司产品； DNA柱回收试剂盒购置Amersham公司；试剂RNA抽提试剂盒RNeasy Plant Mini Kit为QIAGEN公司产品；各种限制性内切酶和T4 DNA Ligase均购自上海Takara 公司。总RNA采用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit提取。小鼠cDNA的合成按Clontech公司SMART cDNA Library Construction Kit 说明书操作进行第一链合成。以合成的cDNA第一链为模板，以muiNOSZ: 5' AAG GATCCATGGCTTGCCCCTGGAAGTTTCTCTTC和muiNOSF: AAGAGCTCTCAGAGCCTCGTGGCTT TG GGCTCCTC为引物，利用PCR进行cDNA扩增，扩增条件为94°C预热1 min; 94°C， 30 s， 60°C， 30 s， 72°C， 3 min。共25个循环。PCR结束后，酚氯仿 抽提，再加入2倍体积的无水乙醇进行沉淀，沉淀用30W水溶解，获得小鼠一 氧化氮合成酶基因片段。8其次对小鼠一氧化氮合成酶基因进行定点突变，突变方法如图1。利用定点突变方法将591位BamHI， 763禾n 1070位EcoRI切点，以及399， 540禾Q 1008位SacI切点消除。591位BamHI切点突变引物591Z:5， CCTCGCTGCA， TCGGCAGG AT， GCAG; 591F 5' CAGGTTGGAC, CACTGCATCC， TGCCGATG。763位EcoRI切点突变引物763Z:5， CAGGCTCTGG， ACTTCACAGC， TCATCC; 763F:5' GCTGTGAAGT， CCAGAGCCTG， AAG。1070位EcoRI切点突变引物1070Z: 5， GTGGCCTCGA， CTTCCCAGC C， TGC; 1070F:5， CTGGGAAGTC， GAGGCCACCC， ACCTCCAG。399位Sacl切点突变引物399Z:5， CAAGCCTACC， CCTCTGGAGG， AGCTCC TG; 399F:5' CAATGGCATG， AGGCAGGACC， TCCTC。540位Sacl切点突变引物540Z:5， CTCACTCTGG， ATGACCTCAT，C; 540F:5' TGGCAAAGAT， GAGGTCATCC， AGAGTG。1008位Sacl切点突变引物1008Z:5' GAGTGGTTCC, AGGAGGTC GG，GTTG; 1008F:5 ， CACTTCAACC， CGACCTCCTG， GAACCAC 。取1W小鼠一氧化氮合成酶基因扩增片段为模板，以muiNOSZ和339F; 339Z 和540F; 540Z和591F; 591Z和763F; 763Z和1008F; 1008Z和1073F; 1073Z 和muiNOSF进行PCR扩增，扩增条件为94°C预热1 min; 94°C, 30 s， 60。C， 30 s， 72°C， 1 min。共25个循环，PCR结束后，片断用10%丙烯酰胺胶回收， 将上述7个回收片断取10-100 ng为模板混合，以muiNOSZ和muiNOSF为引物 将上述片断拼接，扩增条件为94°C预热lmin; 94°C， 30 s， 60°C, 30 s， 72 °C， 4 min。共25个循环。PCR结束后，酚氯仿抽提，再加入2倍体积的无水乙醇进行沉淀。各加入 Sacl和BamHI酶切消化，DNA柱回收酶切片断。将酶切处理好片段进行定向克 隆，高效转化大肠杆菌DH5a感受态中(宝生物大连生物技术有限公司)。实施例2:小鼠诱导型一氧化氮合成酶植物表达载体构建将上述克隆含有改造过的小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因片段的质粒，分 别用BaraHI和SacI进行双酶切，回收DNA片段，通过T4 DNA连接酶将小鼠诱 导型-氧化氮合成酶基因与含有双35S启动子的pYPX245质粒连接(美国国立生 物技术信息中心)，BamHI和SacI双酶切，片断长度为3435bp。利用DNA测序仪进行序列测定，获得了含有小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因的重组质粒 pYPXmuiNOS。如图示2。该表达载体还包含GUS报告基因和带内含子卡那霉素 抗性标记基因(中国专利ZL 00 1 19754.8)。 实施例3:农杆菌培养和植物转化农杆菌菌株为根癌农杆菌EHA105， LBA4404, GV3101, AGL-1菌株。质粒经 电击法导入农杆菌中(购自美国菌种保藏中心)。挑取单菌到25 ml含50mg/1 利福平的YEB培养基中培养过夜，取5 ml菌液转接到含50mg/l利福平的100 m丄 YEB培养基中，培养至0D600 二 0.7-0.8，菌液冰上放置10分钟，5000 rpm离 心10 min ， 4°C，收集菌体，加入100 ml无菌双蒸水清洗两次。加入4 ml 10% 甘油悬浮菌体，转到50 ml离心管。5500 rpm离心10 min ， 4°C。收集菌体， 加入500 W 10%甘油悬浮菌体，转到1.5 ml离心管。取70W感受态细胞，加 入重组质粒pYPXmuiNOS。用去头的黄枪头混匀，转到O. lcm电击杯中。电 击参数200Q， 1.7KV， 2.5F(美国伯乐公司)，电击后立即加入800W SOC 培养液。培养1小时后，取100W涂抗性板筛选转化子，28'C培养。拟南芥粘花法转化含目的质粒的农杆菌菌株单菌落接菌到5毫升含对应抗生素的LB培养基中 2『C培养2天。将5毫升菌液转到500毫升的液体LB培养基中28'C培养16-24 小时(0D=1. 5-2.0).液体可以在4。C保存30天。室温下离心收集菌体，4000 g 离心10分钟。用等休积5%的新鲜蔗糖溶液悬浮。加入0. 02%的Silwet-77混匀 后转移到烧杯中。每个菌株用300毫升转化，转2-3钵。隔7天后再转化1次。 将拟南芥倒置后浸入齒液中IO秒钟。莲座和花序都要侵染。侵染后将转化植株 菌液空干3-5秒。用保鲜膜将转化植株圈好，平放16-24小时。转化后不要放 置在高温和强光下。揭开保鲜膜，保持一定湿度，再生长1个月后收种子。利 用50 JLtg/mL潮霉素进行转化植株筛选。烟草和番茄转化挑选较饱满的种子，用75%的酒精清洗1分钟，次氯酸钠加1滴十温灭菌 IO分钟，种子铺在MSO培养基上，28度培养待发芽。将烟草幼叶，番茄子叶或 下胚轴剪成lcm2，放入MS0+NAAl(lug/ml)+BA2(4ug/ml)的培养基中，22度培养 l天。农杆菌培养ODO. 8-1. 0后离心5000 g离心8分钟，无菌水清洗一次，等 体积MS培养液悬浮侵染8分钟后，吸干放置在MS0+NAA1+BA2的培养基中，2210度共培养 3 天。然后转入筛选培养基MS0+IAA1(0. lug/ml) 十ZT(2ug/ml)+Cb(500ug/ml)+Km(50ug/ml)培养2-3周，再转入分化培养基 MS0十IAA1 (0. lug/ml) +ZT(2ug/ml)+ Cb(500ug/ml) +Km(100ug/ml)培养2-3周， 最后转入生根培养基1/2MS+IAA1 (0. lug/ml)培养。 水稻转化N6培养基为基本培养基，去壳的种子，授粉后12-15天的幼胚，经表面消 毒后接种到N6D2培养基中诱导愈伤组织(N6培养基，水解乳蛋A 500mg/L，蔗 糖30g/L, 2， 4-D 2mg/L，植物凝胶2. 5g/L， pH5. 8);培养4-7天后取愈伤组织进 行转化。农杆菌培养ODO. 8-1. O后离心5000 g离心8分钟，DDH20清洗一次， 等体积MS培养液悬浮侵染8分钟后，吸干放置在MS0+NAA1+BA2的培养基中， 22度共培养3灭。然后转入筛选培养基(加入头孢Cb(500ug/ml)和潮霉素 HAT(50ug/ml)，转化后的愈伤在含有和的抗性培养基上培养3 4代，转入分化 培养基中(2 mg/L KT);幼芽长至2腿转移到生根培养基(1/2MS+0. 5mg /L IBA)。以上培养基中分别加入500 mg/L酶水解乳蛋白(CH)， 0 700 mg /L谷氨酰胺或精氨酸，蔗糖30 S0 g/L，琼脂6 g几。pH 5. 8。继代周期 为25 d。将淡黄色的胚性愈伤组织转入分化培养基中，30 d左右分化出芽。光 照强度1 500 2 OOOlx， 12 14 h / d。从获得的抗性植株中取一部分叶子，侵入含有X-GLUC的染色液中，筛选叶 片变蓝的转基因植株进行分子检测，提取叶片总DNA，参照《分子克隆》的方法， 以muiNOSZ和muiNOSF为引物对对转基因植株进行PCR检测，扩增条件为94 。C预热1 min; 94。C， 30 s， 6CTC， 30 s， 72°C， 4 min。共25个循环。从分 子水平i:证明目的基因是否导入。实施例4:小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因转化植物后的抗旱分析 将转化植物自交纯合3代，获得纯合转化株，收取种子。播种后，移栽到 基本培养基中，培养20天，不浇水，等到植物萎蔫后，再进行.iH常浇水，观察 植物的抗旱效果。图示3显示小鼠诱导型一氧化氮合成酶明显提高单子叶植物 水稻的抗旱性能。
权利要求
1.一种消除小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因中591位BamHI切点，763和1070位EcoRI切点，399，540和1008位SacI切点的基因序列如下591位BamHI切点序列改为GG ATGC763位EcoRI切点序列改为GACTTC1070位EcoRI切点序列改为GACTTC399位SacI切点序列改为GACCTC540位SacI切点序列改为GACCTC1008位SacI切点序列改为GAGGTC。
2. 根据权利要求1所述消除小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因中591位BamHI 切点，763和1070位EcoRI切点，399， 540和1008位Sacl切点的基因序 歹'J，其特征在于它们的突变引物分别为591位BamHI切点突变引物591Z: 5'CCTCGCTGCA, TCGGCAGG AT,GCAG; 59IF 5'CAGGTTGGAC,CACTGCATCC, TGCCGATG;763位EcoRI切点突变引物763Z: 5'CAGGCTCTGG， ACTTCACAGC， TCATCC; 763F:5， GCTGTGAAGT,CCAGAGCCTG,AAG;1070位EcoRI切点突变引物1070Z: 5， GTGGCCTCGA,CTTCCCAGC C，TGC; 1070F:5， CTGGGAAGTC,GAGGCCACCC,ACCTCCAG;399位Sacl切点突变引物399Z:5， CAAGCCTACC,CCTCTGGAGG, AGCTCC TG; 399F:5， CAATGGCATG,AGGCAGGACC,TCCTC;540位Sacl切点突变引物540Z: 5， CTCACTCTGG， ATGACCTCAT， C; 540F:5， TGGCAAAGAT,GAGGTCATCC，AGAGTG;1008位Sacl切点突变引物1008Z: 5'GAGTGGTTCC,AGGAGGTC GG,GTTG; 1008F:5' CACTTCAACC,CGACCTCCTG,GAACCAC。
3. 根据权利要求1所述的消除小鼠诱导性一氧化氮合成酶基因中591位 BamHI切点，763和1070位EcoRI切点，399， 540和1008位Sacl切点的基因序列的制备方法包括如下步骤a.利用定点突变方法将591位BamHI， 763和1070位EcoRI切点，以 及399， 540和1008位Sacl切点消除；b. 将上述克隆含有改造过的小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因片段的质粒，分别用Bamffl和Sacl进行双酶切，回收DNA片段，用T4 DNA连接酶将小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因与含有双35s启动子的 pYPX245质粒连接获得重组质粒pYPXmuiNOS;c. 将上述改造后的小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因(muiNOS)与植物 表达载体连接，获得了含有小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因的重组质 粒。
4.权利要求1所述消除小鼠诱导性一氧化氮合成酶基因中591位BamHI切 点763禾d 1070位EcoRI切点，399， 540禾B 1008位Sacl切点的基因序列 的用途在于该基因用于植物转化，提高植物的抗旱能力。
全文摘要
本发明是提供一种小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因，然后该基因转化入植物中，提高植物的抗旱能力。本发明分别用BamHI和SacI两个限制性内切酶酶切定点突变的小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因，通过T4DNA连接酶将酶切好的小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因(muiNOS)与含有双35S启动子的pYPX245(AY178049)植物表达载体连接，酶切鉴定和序列测定获得了含有目的基因muiNOS的重组质粒pYPXmuiNOS。最后将小鼠诱导型一氧化氮合成酶基因转化到植物中，获得了具有干旱耐受性的转基因植物。
文档编号C12N15/52GK101260407SQ20081003634
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月21日 优先权日2008年4月21日
发明者付晓燕, 姚泉洪, 彭日荷, 贤 李, 熊爱生, 田永生, 永 薛, 伟 赵, 峰 高 申请人:上海市农业科学院