专利名称：：用于诱导神经发生的氧化氮供体的制作方法
技术领域：
：的方法和化合物。更明确的讲，本发明涉及促进神经系统的神经发生和可塑性的方法和组合物。
背景技术：
：如果大脑部分梗塞就会发生中风，就会由于脑部供血中断而造成脑组织坏死。伴随急性中风的脑血栓可造成突然和剧烈的神经损伤。在美国的成年人中，中风是第三大死因，也是致残的重要因素。药理学上的各种干涉试图使那些有可能存活下去的受中风影响的大脑区域血流量达到最大，但是临床效果让人很事困惑。正如Harrison的PrinciplesofInternalMedicine(9thED.，1980，p.1926)中所讲的，尽管实验证明...(脑血管扩张)增加了脑部血液流量，正如氧化氮方法检测的结果，它们还没有证明这在对瞬时局部缺血攻击、血栓形成或慢性中风阶段的人类中风的仔细研究是有帮助的。给药烟酸、烟酸千唑啉、乙醇、罂粟碱和吸入5%二氧化碳是对的...与应用这些方法相反的建议就是血管扩张药物是有害的，而不是有益的，因为他们降低了系统血压，从而降低了与硕腔相吻合的血流，或者通过扩张大脑正常区域的血管来从梗阻处银取血流。因此，开发一种化合物和方法，通过产生神经发生来緩解中风的影响是有用的。
发明内容按照本发明，它提供了一种方法，可通过对需要促进神经发生的患者给药以治疗剂量的氧化氮供体来促进神经发生。在没有受到损伤的大脑中也可促进神经发生。并且提供了一种化合物，它含有足以促进神经发生的有效剂量的氧化氮供体来诱导神经发生。也提供了一种促进神经发生的氧化氮化合物。此外，本发明也提供了一种方法，它通过对需要增强神经细胞产生的位点给药以有效剂量的氧化氮供体化合物就可增强此处神经细胞的产生。本发明提供了一种方法，它通过对患者给药以有效剂量的氧化氮供体化合物来增强神经功能和认知功能。结合其中的图表，只要通过参考下面的发明详述你就可更好的理解本发明，你也就很容易的意识到本发明的其他优点。图l是一张照片，它展示了所选区域的BrdU-阳性细胞核；图2A和2B是两个图表，它们显示了在subventricular区(SVZ)的BrdU-阳性细月包数量；图3显示了在锯齿状脑回中的BrdU-阳性细胞数量；图4A和4B是两个图表，它显示在锯齿状脑回中BrdU细胞的分布百分比；图5是一张照片，它展示了免疫反应性细胞相对于粒细胞层中的粒细胞的大小；图6A和6B显示了SVZ中的BrdU-阳性细胞数量；图7A和7B显示了嗅觉球(0B)中的BrdU-阳性细胞数量；图8A和8B显示了锯齿状脑回中的BrdU-阳性细胞数量；图9显示了损害体积研究；图10显示了时间相对于粘连性去除检测的结果-MCAo变化；图ll显示了Rotarod检测的结果；图12显示了NSS检测的结果；图13显示了重量百分比；图14显示了Rotarod检测的结果；图15显示了Rotarod检测的进一步结果；图16显示了footfault检测的结果；以及图17显示了进一步的粘连性去除检测的结果。发明详述一般的讲，本发明提供了促进神经发生的方法和化合物。更明确的讲，本发明提供了可促进神经发生的方法和化合物，它是通过利用有效剂量的可促进神经发生的氧化氮供体来促进神经发生的。多种部位可需要神经发生，这包括但不局限于大脑、CNS、耳或其中含有损伤的神经细胞的部位。'氧化氮供体，是指一类化合物，它能提供氧化氮或促进氧化氮浓度的增加..有多类化合物可提供氧化氮。这些化合物包括DETAN0N0ate(DETAN0N0，.N0N0ate或1-取代diazen-1-ium-1,2-diolate是含有[N(NO)NO]-功能基团的化合物；DEA/NO;SPER/NO;DETA/NO;OXI/NO;SULF/NO;PAPA/NO;MAHMA/NO以及DPTA/NO);PAPANONOate,SNAP(S-亚硝基-N-乙酰青霉胺)，硝普钠，硝化甘油钠。这些化合物可促进氧化氮的提高，例如磷酸二酯酶抑制剂和L-精氨酸.此处所用的'促进神经发生'是指促进或增强神经增长.它可包括但不局限于，新神经细胞的增长或增强已存在的神经细胞的生长，以及实质细胞和可促进组织可塑'逸的细胞的增殖和生长。神经发生也包括，但并不局限于，轴突和树突延伸和突触发生.此处所用的'增强，指在特定条件下，按照要求对生长进行增强和抑制。因此，如果需要额外的神经元生长，添加氧化氮供体就能提高这种生长。氧化氮供体，或氧化氮源，通过增强受体活化和促进细胞形态改变和细胞增殖使脑组织准备来补偿由于损伤、神经变性或老化引起的损伤.此处所用的'神经，和'认知'功能指大脑中的神经生长增强了患者思考、官能或其他的能力，接受氧化氮治疗的正常人增强了脑细胞的产生，加快了认知、记忆和运动神经的功能。此外，当进行氧化氮治疗之后，遭受神经疾病或损伤的患者可提高认知、记忆和运动神经细胞的功能。本发明的目的就是通过诱导神经发生和细胞变化来促进功能的提高，从而促进在局部缺血性脑损伤或其他神经损伤治疗中取得改良性的成果。在患有中风、CNS损伤和神经变性疾病之后，患者会遭受神经和功能性缺陷。这些发现提供了一种方法来增强大脑在CNS损伤或恶化之后的补偿机制。在患者遭受中风、损伤、老化和退化疾病之后，通过对氧化氮给药来诱导神经元和细胞的变化就可促进患者的功能性改进这种方法也有益于遭受其他神经疾病，例如，但又不局限于ALS、MS和Huntingtons的患者，在遭受CNS损伤之后，在适当的时间对氧化氮给药可促进大脑的神经发生，并且能加快神经发生。这种效果的主要机制是NO活化了谷氨酸受体。这些谷氨酸受体促进了长期增强作用，并且随后诱导了神经元的再生.在最初的实验中，选用一种长半衰期(约为50小时)并可产生NO的化合物——DETA/NO来进行实验。在从中风起始计245小时时和24小时以外时对这种4匕合物给药，检测新神经元增加的数百。本文包括的实验数据表明一种设计来诱导NO产生的药理学介入能促进神经发生。选用两种化合物，DETAN0N0ate和SNAP,这两种化合物成功的诱导了中风后的神经发生和提高了功能性结果(functionaloutcome),选用的这些化合物可能跨过了血脑屏障。在神经科学研究中，神经发生是主要的最后目标。发明一种方法来促进神经元的产生将会为治疗多种神经疾病、CNS损伤和神经变性提供机会.也可能在非损伤大脑中增强神经元的产生，从而可提高其功能.能促进神经元产生的一族药物的市场是巨大的.氧化氮供体，其中DETAN0N0时一个例子，可促进神经发生.提高神经发生可转化为一种方法，它可随着年龄增长和在损伤与疾病后提高、改进神经、行为和认知功能。上迷讨论为使用氧化氮来促迎神经发生提供了一个事实基础。应用的方法和这些方法在本发明中的应用可通过随后的这些非限制性示例和图表来展示。方法分子生物学中的一般方法本领域中熟知的和没有特别描述的标准分子生物学技术一般是按照ColdSpringHarborLaboratorypress,NevYork(1989)出版的、Sambrook等编写的MolecularCloning:ALaboratoryManual和JohnffileyandSons，Baltimore，Maryland(1989)出版的、Ausubel等编著的CurrentProtocolsinMolecularBiology,以及Perbal编箸的、JohnWiley$Sons，NevYork(1988)出版的APracticalGuidetoMolecularCloning,以及Watson等编著的、ScientificAmericanBooks,NeirYork出版的RecombinantDNA，以及Biiren等编著、ColdSpringHarborLaboratorypress,NewYork(1998)出版的GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries,Vols.1-4中的技术，并且美国专利4，666,828、4,683,202、4,801，531、5,192,659和5,272，057中提出的方法也在此处一并应用作为参考。多聚酶链式反应(PCR)—般时按照AcademicPress,SanDiego,CA(1990)出版的PCRprotocols:AGuidetoMethodsandApplications中的方法进行的.将原位(in-cell)PCR和流动血细胞计数结合来检测含有特定DNA和mRNA序列的细胞(Testonietal，1996,Blood87:3822).免疫学中的一般方法本领域中熟知的和没有特别描述的标准免疫学方法一般是参考Appleton&Lange,Norwalk，CT(1994)出版的、Stites等编著的basicandClinicalImmunology(8thEdition)和W.H,FreemanandCo,,Newyourk(1980)出版的、Mishell和Shiigi(eds)编著的SelectedMethodsinCellularImmunology,治疗剂的传送本发明中的化合物的给药和剂量确定是按照良好的医学实践进行的，要考虑到医生已知的个体患者的医疗条件、给药位点和方法、给药的时间安排、患者年龄、性别、体重以及其他的因素.在此处来讲，药理学上的有效剂量是通过这些本领域中熟知的考虑事项来确定的.这个剂量必须能够取得有效成果.它包括但并不局限于增加的存活率或更快的恢复、或增加或减少一些症状或由本领域中的熟练技术人员精选出来作为适当标准的其他的指标.在本发明的方法中，本发明中的化合物可以多种方式给药.应该指出的是他们可以化合物或药物上可接受的盐的形式给药，也可单独给药或作为活性组分与药物上可接受的载体、溶剂、助剂和媒介物结合给药。这些化合物可通过口、皮下或包括静脉内、动脉内、肌肉、腹膜内和鼻内在内的肠胃外注射，以及鞘内注射和输注技术来给药.将化合物植入的给药方式也是有效的。接受治疗的患者是温血动物，并且特别是哺乳动物，包括人.药物上接受的载体、溶剂、助剂和媒介物以及植入栽体一般指惰性的、无毒的固态或液态填充物、溶剂或不与本发明中的活性成分反应的胶嚢包被物质.必须指出的是对人进行的治疗时间要比对鼠或此处示例中的其他实验动物的治疗时间要长，这些治疗时间是与患病时间和药效成比例的。这些药剂可以是长时间的单独给药或重复给药，但优逸的是单独给药这些药剂可以是长时间的单独给药或重复给药.治疗时间是与患病时间和药效以及接受治疗的患者的种类相适合的.当对本发明中的化合物进行肠胃外给药时，一般是将这些化合物制备为单位剂量的可注射形式(溶^0悬浮液，乳状液).适于注射的药物制剂包括无菌水溶液或悬浮泉以及可重构于无菌可注射溶液或悬浮液中的无菌粉.载体可以是溶剂或分散介质，包括如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙烯乙二醇、液态丙烯乙二醇等等)、它们的运当混合物以及植物油。适当的流动性是可以维持的，例如，可通过应用糖衣如卵磷脂、通过在悬浮液中维持所要求的颗粒大小以及通过使用变性剂，非水媒介物，如棉籽油、芝麻油、大豆油、玉米油、向曰葵油或花生油以及醋如异丙基豆蔻酸酯也可用做复合组合物的溶剂体系。此外，也可添加多种可增强组合物的稳定性、无菌状态以及等张性的添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂以及緩冲液，通过添加多种抗真菌和抗细菌药物，如对羟基笨甲酸酯类、酚、山梨酸等可保证预防徵生物的作用。在很多情况下最好是包括等张因子，如糖、氯化钠等。对可注射药物形式的延长吸收可通过应用延緩吸收的药物如单硬脂酸铝和凝胶来实现。然而，按照本发明，应用的所有稀释剂或添加剂都要与这些化合物相协调。将本发明示例中使用的化合物连同其他需要的多种成分溶解到所要求量的溶剂中，就可制备无菌注射溶液.本发明中的药剂可以含有多种载体，如多种媒介物、助剂、添加剂以及稀释剂的注射制剂形式对患者给药；或者本发明中的化合物可以緩释皮下植入物或耙定传送体系，如单克隆抗体、载体传送、离子电渗析、聚合物基质、脂质体和徵球体等形式进行肠胃外给药。本发明中有效的传送体系示例包括5,225,182;5,169,383;5,167,616;4，959，217;4，925，678;4,487，603;4，486，194;4，447，233;4,447,224;4,439,196;以及4，475,196.许多其他的植入物、传送体系和组件对于本领域中的熟练技术人员来讲是熟知的。本发明中的化合物药剂可以口服形式对患者给药.传统的给药方法入对这些化合物以片剂、悬浮波、溶液、乳剂、胶嚢、粉剂、糖浆等都是适用的.优选的是那些已知可经口或皮下传送药物并且能保留药物的生物活性的技术.在本发明的一个实施方案中，本发明中的药物最初是通过皮下注射给药使血液水平达到一个合适的水平.然后再通过口S^药剂的形式来维持患者体内的水平，其他依赖患者身体情况的给药形式以及上面提到的给药形式都可使用.给药量因接受治疗的患者不同而不同，大约为100ng/kg体重/天一100mg/kg体重/天，优选的使10mg/kg体重/天一10mg/kg体重/天。示例示例1发明了一种药物学方法来促进大脑的神经发生.通过在雄性Wistar鼠的右MCA的起端放入动脉内凝块使得大鼠患中脑动脉(MCA)梗塞.在诱导中风之后的第24和48小叶对动物给药(iv/ip)以氧化氮供体化合物(DETANONO)(组1)，或者在24小时之后每天注射(ip)NO供体化合物(组2)。BrdU是一种胸普类似物，它可检测新细胞的形成，从局部缺血后开始每天注射(ip)BrdU,并持续14天。通过特异细胞的免疫活性标记来确定细胞类型.因此，可通过表达NeuN和MAP2来检测神经细胞，通过GFAP来检测星形胶质细胞.在大脑特定区域、subventricularzone和锯齿状脑回检测神经发生.结果数据表明，相对于没有进行治疗的组，接受DETANONO治疗的大鼠中可观察到BrdU阳性细胞数量的显著增加.对于组2来讲，结果如下subventricularzone:2748±326/1653±91.4,锯齿状脑回粒状细胞层，135±18.9/37.3±3.6;53.7±6.3/34.9±2.8,解门，43.8±10.2/10.1±2.4,对组1来讲，分别在接受治疗的鼠的粒状细胞层和未接受治疗的鼠的粒状细胞层中检测到89.5±12/37.3±3.6的BrdU细胞数量显著增加。在锯齿状脑回中绝大多数新形成的细胞(>90%)是神经细胞。在大脑的其他区域，新形成的细胞具有神经胶质细胞和星形胶质细胞表型.对非局部缺血大脑的DETANONO治疗对没有接受任何外科手术的大鼠进行DETANONO治疗。药物是以单剂量(iv0.12mg)给药的。在开始治疗后持续14天每天注射BrdlL—组大鼠(组3)在BrdU注射的最后一天处理.另一组(组4)在最后的BrdU注射后4星期处理。按照与接受DETANONO治疗的鼠(组5)的方法对不进行DETANANO给药的动物进行BrdU注射.组3/组5的结果如下在subventricularzone结果分别是2952±102.6/1432±104.6和2725.3±115.5/1655.2土102.9;在锯齿状脑回(粒状细胞层)是73.7±6.11/39.9±7.26.在纟且4/纟且5中，在subventricularzone结果分另'J是456-5±42.3/214.6±67.9和518.4±67.2/233.1±49.2;在锯齿状脑回(解门)是7.71±89/3.23±1.22。相对于没有接受处理的组，接受DETAN0N0治疗的大鼠在两个时间点都表现出新形成细胞的显著增加。新形成细胞在subventricularzone和海马状突起有明显增加.用神经标记物NeuN和MAP2以及星形胶质细胞标记物GFAP对BrdU活性细胞进行双重标记。新形成的细胞表达神经细胞或星形胶质细胞蛋白.图1表明遭受中风并且接受DETAN0N0治疗的鼠中，在海马状突起通过BrdU和神经标记物NeuN和MAP2、BrdU和星形胶质细胞标记物以及GFAP进行双重标记免疫组织化学。细胞对这些标记都表现了免疫组织活性，这表明新形成细胞是神经细胞元(neuronalcell)和星形胶质细胞表型。估计在海马状突起中新形成的细胞大于90X是神经细胞表型.这些数据表明对NO供体给药促进了局部缺血大脑的神经发生。这种方法适用于多种形式的CNS病理和损伤。此外，NO液促进了正常成人大脑中的神经发生。本发明的目的是通过诱导神经发生来促进在对大脑局部缺血损伤或其他神经损伤进行的治疗方面取得改进性成果。在患有中风、CNS损伤和神经变性疾病之后，患者会遭受神经和功能缺陷.这些发现提供了一种方法来增强大脑补偿性机制以提高遭受CNS损伤和神经变性后的大脑功能。神经元诱导将促进中风后官能提高。在遭受CNS损伤之后，在适当的时间对氧化氮给药可促进大脑的神经发生，并且能加快神经发生。这种效果的主要机制是N0活化了谷氨酸受体。这些谷氨酸受体促进了长期增强作用，并且随后诱导了神经元的再生。在最初的实验中，选用一种长半衰期(约为50小时)并可产生N0的化合物---DETA/N0来进行实验。在从中风起始计24小时时和24小时以上时对这种化合物给药，检测新神经元增加的数目。本文包括的实验数据表明一种设计来诱导N0产生的药理学介入能促进神经发生。选用两种化合物，DETAN0N0ate和SNAP,这两种化合物成功的诱导了中风后的神经发生和提高了功能性成果。选用的这些化合物可能跨过了血脑屏障。在神经科学研究中，神经发生时主要的最后目标。发明一种方法来促进神经元的产生将会对治疗多种神经疾病、CNS损伤和神经变性提供机会.也可能在非损伤大脑中增强神经元的产生，从而可提高其功能.能促进神经元产生的一族药物的市场时巨大的。氧化氮供体，其中DETAN0N0时一个例子，可促进神经发生。提高的神经发生可转化为一种方法，它可随着年龄增长和在损伤与疾病后提高、改进神经、行为和i人知功能.在此之前没有NO供体或药物，尤其是中风后可诱导神经发生的药物的专利申请.在成年啮齿类动物的整个生命过程中，在其大脑的subventricularzone(SVZ)和海马状突起的锯齿状脑回能够产生神经祖细胞。然而，祖细胞增殖和分化的信号还不为所知，氧化氮(N0)是生物体系中的一种化学信使，可作为大脑中的一幹神经递质.在本发明的研究中，探讨了N0对成年鼠SVZ和锯齿状脑回的神经粗细胞增殖的影响.进行了两个实验.在第一个实验中，检测了N0对非局部缺血成年鼠的SVZ和锯齿状脑回的神经祖紐胞增殖的影响，在第二个实验中，检测了NO对局部缺血成年鼠的SVZ和锯齿状脑回的神经祖细胞增殖的影响。本发明中选用的是体重为300-350克的成年Wistar鼠(CharlesriverBreedingCompany,Wilmington,MA).从ALEXISBiochemicalCorporation购买了生理状态的、半衰期为20小时的NO供体一DETANOPNOate.从Sigmachemical购买了作为有丝分裂标记的胸苷类似物一溴尿普(BrdU).从BoehringerMannheim购买了抗BrdU的鼠单克隆抗体。将体重为300-350克的雄性Wistar(n=28)鼠通过面罩用氟烷(在70%N20和30%02混合物中的浓度为1-3.5%)进行麻痹.在整个外科手术过程中，通过反馈调节水加热系统将鼠直肠温度控制在37±1TC.在右股动脉和静脉中插入PE-50导管来分别进行血压持续监测和测量血波中的气体(pH、p02、pC02),以及给药.DETAN0N0ate是通过静脉或腹膜注射的方式对鼠给药的.DETAN0N0治疗将鼠随机分为4组.在组1(单Rx)中，每15分钟就皮下注射一个DETAN0N0大丸剂(每个0.lmg/kg),共注射4次(总共0.4mg/kg).在组2(2Rx)中，每15分钟就皮下注射一个DETAN0N0大丸剂(每个0.lmg/kg),共注射4次(总共0.4mg/kg),并且在24小时之后重复进行第二次治疗。在纽3(7Rx)中，在第一个实验曰，每15分钟就对鼠皮下注射一个DETANONO大丸剂(每个0.lmg/kg)，共注射4次(总共0.4mg/kg),以后每天腹膜注射一个DETANONO大丸剂(每个0.4fflg/kg),连续注射6天。在组4(对照)中，仅仅对鼠注射盐水(单剂量)。在进行DETANONO治疗的第一天，对鼠进行腹膜注射BrdU(50mg/kg),每天注射，连续14天.为了确定SVZ和锯齿状脑回中的细胞分化和增殖是否受到了NO的影响，在笫一剂DETANONO治疗后分别在第14天(n-3-5/组)和第42天(11=3-5/组)将鼠杀死.将鼠利用含在pH7.4的100毫升磷酸緩冲液中的4%多聚甲醛进行经心灌注.将脑取出并固定在4%甲醛中。对于BrdU免疫染色来讲，首先通过将脑切片(6uin)在65C、50%甲酰胺2XSSC中培育2小时进ff变性，然后在37C的2NHC1中培育30分钟.然后用Tris緩冲液冲洗脑切片，并且用1%11202处理来阻断内源过氧化物酶.脑切片在室温与抗BrdU(1:100)的第一种抗体培育1小时，然后与生物素化的第二种抗体(1:200，vector,burlingame，CA)共培育1小时，利用3'3'-4基联苯胺-四氢氯化物(DAB,Sigma)。在40X显徵镜(01ympusBX40)下通过MCID计算机成像分析系统(ImagingResearch,St.Catharines,Canada)将BrdU免疫染色切片进行数字化显示。在计算机监视器上进行BrdU核技术以提高可见性，并且使用单焦平面奉避免重复计数.对结构的取样是通过选择每个切片(RMS和OB)上预先确定的区域或通过分析每个切片(锯齿状脑回和SVZ)的整个结构来确定的。选取每只鼠在AP+10.6咖处的骄胝体膝和AP+8.74mm处的前联合交叉点之间总共7个切片的每个第40冠状部分(PaxinosandWaston，1986).对在側心室壁上的BrdU免疫反应阳性细胞核进行计数.在这些区域的所有BrdU免疫反应阳性细胞核都以BrdU免疫反应细胞数/咖2表示。将这七个切片的密度进行平均以获得每只鼠的平均密度.选取每只鼠在OB前沿皮层前后向上的连续总共6个切片的每个第20部分。如图1中所描述的，在每个部分上，对RMS中的两个预先确定区域(100x100um)和0B的粒状细胞层(GCL)中的四个区域进行了分析。在这些选定区域中，所有BrdU性细胞核都以BrdU免疫反应细胞数/咖2表示将这6个切片的密度进行平均以获得每只鼠的平均密度，选取每只鼠在AP+5.86mm和AP+2.96mm间，包括解门、亚粒状区(SGZ)和内部第一、笫二、第三束i状细胞层(GCL)在内总共8个切片的每个第50冠状切片。SGZ是GCL和解门交界处的一个有两个细胞厚的带，它一直是与GCL结合进行计数的.在这些选定区域中，所有BrdU阳性细胞核都以BrdU免疫反应细胞数/mn^表示.将这8个部分的密度进行平均以获得每只鼠的平均密度.结果相对于接受盐水治疗的鼠，在进行治疗后的第14天和第42天，接受DETANONO治疗的鼠的SVZ中的BrdU免疫反应细胞数量显著增加(P<0.05)(图2a).相对于在治疗后14天给药1和2剂DETANONO的鼠，给药7剂DETANONO的鼠显示了更高数量的免疫反应细胞.在给药1剂和7剂DETANONO鼠之间检测到BrdU细胞数量有显著的差异(图2b),这表明BrdU细胞数量的增加是以剂量依赖形式进行的.虽然相对于在处理后笫14天给药的鼠相比，BrdU细胞数量下降了，但是相对于对照的盐水组鼠BrdU细胞数量还是显著增加了(图2a)在处理后第42天和第14天进行DETANONO治疗的鼠的RMS中，BrdU细胞数量没有显著增加(表1)然而，相对于对照组，在接受单剂DETANONO治疗后第42天的OB中，以及在接受2剂和7剂DETANONO治疗后第42天的OB中检测到BrdU细胞数量显著增加(表1),这表明SVZ祖细胞的迁移增加.在处理后第14天和笫42天，单剂量的DETANONO治疗没有显箸增加锯齿状脑回中的BrdU免疫反应细胞数量(图3)。相反，相对于对照组，在处理后第14天和第42天，接受2剂量和7剂量DETANONO治疗的鼠锯齿状脑回中的BrdU免疫反应细胞数量显著增加(图3)。相对于对照组，在处理后第42天和第14天，锯齿状脑回中的BrdU免疫反应细胞分配百分比表明DETANONO治疗显著降低了BrdU免疫反应细胞在亚粒状区域的百分比，但显著增加了在粒状细胞层的BrdU免疫反应细胞百分比(图4a和4b)，这暗示了NO促进了BrdU免疫反应细胞的迁移。在粒状细胞层中的BrdU克疫反应细胞是卵圓形的和圓形的，大小与粒状细胞的细胞核相同或比其小。数据表明，对成年鼠进行DETANONO治疗不仅增加了SVZ和锯齿狀脑回祖细胞的增殖，而且延长了增殖的祖细胞的存活.在锯齿状脑回中的一些BrdU免疫反应细胞具有粗状细胞的形态学特征。因此，数椐表明NO增强了成年鼠大脑的神经发生。基于以上数据，进行了第二个实验来探讨NO对focalemboliccerebralischemicbrain的影响。除下列搡作外，其他所有操作与第一个实验相同.体重为300-350克的雄性Winstar鼠(n=30)都遭受中脑动脉(MCA)栓塞.通过在MCA起端处放置栓塞物使MCA栓塞。简单的讲，就是利用15咖长、已经修饰过的PE-50导管在MCA起端放置一个完整且富舍血纤维蛋白、形成时间为24小时的同源血块(约lul)。实验分为四组.组I(对照组)中的鼠接受MCA血栓处理，并且在局部缺血后的第24小时接受连续4次皮下注射盐水大丸药(每次0.52ml,每隔15分钟一次)。组II(DETN0/N0预处理)中的鼠在栓塞前24小时接受连续4次对DETANONO大丸剂的皮下给药(每次0.lmg/kg,每隔15分钟一次，总剂量0.4mg/kg)组III(DETANONO两次组)中的鼠在拴塞后24小时和48小时接受连续四次DETANONO大丸剂皮下给药(每次0.lmg/kg,每隔15分钟一次，总剂量0.4fflg/kg).组IV(DETANONO七次组)中的鼠在栓塞后24小时接受连续4史对DETANONO大丸剂的皮下给药(每次0.lmg/kg，每隔15分钟一次，总剂量0.4mg/kg)。随后，每天对鼠进行腹膜内注射0.4mg/kgDETA/N0，持续6天.相对于非局部缺血鼠，在MCA栓塞后的第14天，栓塞性MCA栓塞造成同側SVZ和0B的Brdli免疫反应细胞数量显著增加(p<0.05)(表2),在MCA栓塞后第42天，BrdU免疫反应细胞数量降低，这表明灶性大脑局部缺血诱导了同側SVZ的祖细胞增殖的暂时增加(表2).MCA栓塞没有影响SVZ和0B对侧祖细胞和锯齿状脑回两側的祖细胞的增殖(表2)'相对于没有处理的MCA栓塞組，在预处理组中，在进行MCA栓塞后的第14天，在SVZ的对側和在第42天在SVZ的两側面检测到BrdU免疫反应细胞数量显著增加(p<0.05)(图6A,6B).两剂量组的鼠中，在进行MCA栓塞后第14天，在SVZ的同側面和第42天在SVZ两側面的BrdU免疫反应细胞数量都有显箸的增加(图6A，6B).在MCA栓塞后的第14天和笫42天，进行七次DETANONO注射组中的鼠的SVZ同側和对側面就表现BrdU免疫反应细胞数量的显著增加(图7A,7B).在MCA栓塞后的第14天和42天，进行DETANONO处理的缺血大鼠的0B中，检测到明显增加的BrdU免疫反应细胞(图7A，7B).相对于MCA栓塞对照组，在迚行MCA栓塞之后的第14天和第42天，接受DETANONO处理的局部缺血鼠的锯齿状脑回中BrdU免疫反应细胞数量显著增加(图8A，8B)。接受DETANONO处理的局部缺血鼠没有表现出局部缺血损伤体积的显著减小(图9).这些数据说明检塞性MCA检塞本身增加了SVZ同侧面祖细胞的增殖。许多在SVZ产生的细胞沿RMS迁移进OB，它们在那里分化为神经元，因此，OB同側面BrdU免疫反应细胞数量增加表明SVZ同側面祖细胞迁移的增加。这些数据也表明MCA栓塞后祖细胞增殖信号是短暂的和局部的.然而，但进行MCA栓塞后对局部缺血鼠进行DETANONO处理时的祖细胞增殖显箸增加至少持续42天。祖细胞增殖的增加是由NO诱导的，因为BrdU免疫反应细胞数量增加不仅涉及到SVZ两側面，而且涉及到锯齿状脑回的两侧面.然而，在接受DETANONO处理的非局部缺血鼠和接受处理的局部缺血鼠的BrdU细胞数量还是有区別的.在MCA栓塞后第14小时和42小时，接受DETANONO处理的非局部缺血鼠锯齿状脑回中的BrdU免疫反应细胞绝对数量要多于接受DETANONO处理的局部缺血鼠锯齿状脑回中的BrdU免疫反应细胞数量，这表明NO可通过局部缺血来增强已产生的信号以增加祖细胞的增殖.因此，数据暗示病灶性大脑局部缺血产生了短暂的祖细胞增殖，并且NO增强了局部缺血大脑中祖细胞的增殖。示例2对正常和局部缺血鼠给药以氧化氮供体(DETA/NO)促进了非局部缺血大脑和局部缺血大脑中的神经发生.此后，进行了额外实验来检验DETA/NO诱导的神经发生促进了中风后的大脑功能性改进这一假说；同时提供了数椐.在诱导中风后第一天(组1)或笫7天(组2)对实验鼠给药DETA/NO(iv/ip),随后是为时7天的每日给药DETA/NO(ip).另一种NO供体化合物(SWAP)在i秀导中风后的第一天和第二天对局部缺血鼠给药(iv)(组3)。组1和组2中是选用的幼鼠(3月)。组3中是选用中等年龄的鼠(10-12个月)。从诱导中风后的第一天到第42天，进行了一系列神经功能检验.这些检验包括1)神经严重性分数(NSS)检测运动功能、感觉功能和反射坊能，它类似于用来描述人的对侧忽略实验。分数越高，损伤越严重；2)Rotard检验检测前后肢运动协调和平衡，给出的数据是以下限值的百分数来表示的；3)footfault检验检测前后肢的运动协调作用。数值越高，损伤越严重；4)结合去除检验检测运动传感器损伤.数据以时间(秒)来表示。时间越长，损伤越严重；5)动物体重。结果组l:相对于对照组鼠，在接受DETA/N0处理的鼠中检测到运动和运动传感功能(图10为Rotard检验，图11为结合去除检验，图12为NSS检验)和实验鼠体重(图13)的显著提高。组2:相对于对照组鼠，在诱导中风后第28和42天仅仅在Rotard检验中检测到神经功能的显著提高(图14).组3:相对于对照组鼠，接受SNAP处理的实验鼠表现了在运动和运动传感功能上的显著提高(图15为Rotard检验，图16为footfault检验，图17为结合去除检验).结论这些数据表明1)对大脑局部缺血的鼠给药DETAN0N0可提高神经功能的恢复，并且甚至在中风七天后也能取得这些提高；2)除给药DETAN0N0外，对大脑局部缺血的鼠给药SNAP也提高了神经功能，这表明对NO供体化合物给药可增强神经功能的恢复；以及3)对中等年龄的鼠给药SNAP有效的促进了功能恢复，这是很重要的，并且是与临床相关的，因为中风患者是中年或更老.结合上述的数据，这些数据表明NO供体促进了神经发生，暗示NO供体化合物通过促进局部缺血大脑中的神经发生来增强中风后的神经功能恢复.在本专利申请中，多种出版物，包括美国专利是按照作者和年代来参考引用的，而专利是按照申请号来参考引用的。全文引用的文献如下所列.因此，全文引用这些出版物和专利作为参考文献以便更加全面的描述与本发明相关的领域的现状。本发明是以例证性的方式来播述的，应该明白，本专利中用到的术语在词汇本身是说明本发明，而不是进行限制本发明的。很显然，本发明可能按照上逸学说进行多种修饰和变动.因此，应该理解为在本发明描述的范围内，而不是明确描述，本发明是可以实施的。表l.大脑中新产生的细胞的密度<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>新产生的细胞的密度是以BrdU阳性细胞平均如/mm2土SEM来表示的.它们的值与盐水处理不同，*p<0.05,"p<0.01-表2.大脑中新产生细胞的密度<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>新产生的细胞的密度是以BrdU阳性细胞平均如/mn^士SEM来表示的.它们的值不同于非局部缺血組，-pO.05,"pO.01.参考文献BurkeandOlson,"在酵母人工染色体载体上制备克隆库，，inMethodsinEnzymology,Vol.194,"GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology".Eds.C.GuthrieandG.Fink,AcademicPress,inc.,Chap.17，pp.251-270(1991).Capecchi,"利用同源重组方法来修饰基因组，，science244:1288-1292(1989).Daviesetal.,酵母人工染色体中用于种间基因传递的耙定改造，NucleicAcidsResearch,Vol.20，No.11，pp.2693-2698(1992).Dicksonetal.，"通过可插入栽体进行的高频基因靶定"HumanMolecularGenetics,Vol,2,No-8，pp.1299-1302(1993).DuffandLincoln,"将病原t异基因插入携带有人APP基因的酵母人工染色体中并在ES细胞中表达，ResearchAdvancesinAlzheimer，sDiseaseandRelatedDisorders,1995.Huxleyetal.,"通过细胞融合技术将酵母染色体上的人HPRT基因转移入鼠细胞中后的基因是有功能的基因，Genomics,9;742-750(1991).Jokobovitsetal.,"起源于人的酵母人工染色体的细菌系传递和表达，，，Nature，Vol.362,pp.255-261(1993).Lambetal.，"在转基因鼠中引入和表达400kb前体淀粉体蛋白基因，，，NatureGenetics,Vol.5,pp.2-29(1983).PearsonandChoi.，"在转基因鼠中表达取自酵母人工染色体的人b-淀粉体前体蛋白基因"，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993.90:10578-82Rothstein，"耙定、破坏、替代、等位基因拯救酵母中的整合DNA转化，'inMethodologyinEnzymology，vol.194,"GuidetoYeastGeneticsand'MolecularBiology"-Eds.C.GuthrieandG.Fink,AcademicPress,inc.,Chap.17,pp.281-301(1991).Sched丄etal.，"在转基因鼠中包含有酪氨酸酶基因的酵母人工染色体赋予了拷贝数量依赖型表达，，，Nature,Vol.362，卯.258-261(1993).Straussetal.，"鼠科动物中酵母人工染色体的细菌系传递，(1)胶原质位点"，Science,Vol.259，pp.1904-1907(1993).Gibola,E，Eglitis，MA,Kantoff，PW,anderson,WF:利用逆转录酶病毒来转移和表达克隆的基因".Biotechniques4(6):504-512,1986.CreggJl，VedvickTS，RaschkeWC:在Pichiapastoris中表达外源基因的进展，Bio/Technology11;905-910,1993.Culver,1998.用来修复人ADA基因突变的位点介导的重组.(Abstract)AntisenseDNA&RNAbasedtherapeutics,Febrary，1998，Coronado,CA.Hutsonetal,1991"单链Fv类似物和融合蛋白的蛋白质工程"inMethodsinEnzymology(JJLangone，ed.;Academicpress,NewYork,NY)203:46-88.JohnsonandBird,1991"单克隆抗体单链fvb衍生物的构建以及它们在大肠杆菌中的表达，'inMethodsinEnzymology(JJLangone，ed.;Academicpress,NevYork，NY)203:88-89.MemaughandMernaugh,1995"嗟菌体展示的重组抗体概观"inMolecularMethodsinplantPathology(RPSinghandUSSingh,eds.;CRCPressInc.,BocaRaton,FL)pp.359—365.2权利要求1.促进神经发生的方法，它包括对需要进行神经发生促进的患者给药治疗剂量的氧化氮供体。2.促进神经发生的化合物，包括足以促进神经发生的有效剂量的氧化氮供体。3.包括包含在药物上可接受的载体中的氧化氮供体的神经发生促进剂。4.权利要求3中的神经发生促进剂，其中该氧化氮供体增强了组织中的氧化氮。5.权利要求4中的神经发生促进剂，其中该氧化氮供体是选自基本上由磷酸二酯酶和L-精氨酸组成的组。6.增强神经细胞产生的方法，它是通过对需要这种增强作用的位点给药以有效剂量的氧化氮供体。7.提高神经功能的方法，它是通过对患者给药以有效剂量的氧化氮供体来实现的。8.提高认知功能和神经功能的方法，它是通过对患者给药以有效剂量的氧化氮供体来实现的。全文摘要本发明提供了用于诱导神经发生的氧化氮供体。本发明提供了促进神经发生的方法，它可通过对需要促进神经发生的患者给药以治疗剂量的氧化氮供体来达到促进神经发生的目的。并且对于促进神经发生来讲，本发明也提供了一种化合物，它含有足以促进神经发生的剂量的氧化氮供体。也提供了可促进神经发生的氧化氮化合物。此外，本发明也提供了一种方法，它通过对需要进行增强的位点给药以有效剂量的氧化氮供体就可增强脑细胞的产生和加快细胞结构和受体的改变。本发明还提供了一种方法，它可通过对患者给药以有效剂量的氧化氮供体来提高患者的神经功能和认知功能。文档编号A61K31/00GK101310772SQ20081009037公开日2008年11月26日申请日期2000年6月14日优先权日1999年6月14日发明者M·乔普,张瑞兰申请人:亨利福特保健系统公司