专利名称：：消泡剂的新用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及微生物发酵领域。更具体地涉及消泡剂在微生物发酵中的新应用。
背景技术：
：在抗生素深层发酵过程中，因搅拌和通气会形成大量泡沫，发酵液中蛋白质、糖和代谢物等具有稳定泡沫的作用。过多的泡沫给发酵带来了许多不利影响，如降低设备利用率，增加染菌机会等。泡沫严重时还会影响通气、搅拌正常操作，造成代谢异常。然而，适当的泡沫形成对抗生素发酵氧传递速率(OTR)的提高有显著作用。因此，筛选适合的消泡剂对泡沫适量控制是抗生素发酵过程中的重要环节之一。通常消泡的方法包括物理方法和化学方法。物理方法主要有机械搅拌、静电消泡、冷冻法、高速离心法、加压减压法和超声波等；化学方法则通过使用消泡剂来减少或控制泡沫，目前应用广泛。发酵工业常用的消泡剂分为油脂类、聚醚类、有机硅和聚醚改性硅氧垸类等四类。消泡剂虽然可以迅速消泡，但是也抑制气泡的分散，使体积氧传质系数KLa降低，从而显著影响氧的传质速率，使溶氧(DO)迅速下降甚至到零，如果D0长时间低于临界值，将对发酵过程产生严重后果。消泡剂不仅具有消泡的物理作用，也将影响抗生素产生菌的生理代谢作用，但多数消泡剂是起负面影响。因此本领域迫切需要提供一种物质，它既具有理想的消泡、抑泡能力，又不影响抗生素产生菌的生理代谢；更佳地本领域还需要提供这种物质的优化使用量，既提高发酵单位，也能达到理想的消泡效果，从而找到生理作用和物理作用的平衡点。
发明内容本发明旨在提供消泡剂在大环内酯类抗生素产生菌发酵过程中的用途。本发明的另一个目的是提供消泡剂在大环内酯类抗生素产生菌发酵过程中的使用方法。在本发明的第一方面，提供了一种消泡剂在大环内酯类抗生素产生菌发酵过程中的应用，所述的消泡剂具有消泡、抑泡和促进生物合成的作用；所述的消泡剂选自C12-C22的高碳醇、聚醚改性硅或硅类物质。在另一优选例中，所述的促进生物合成的作用包括增加产生菌菌体浓度和提高产生菌生物效价。在另一优选例中，所述的大环内酯类抗生素选自螺旋霉素、红霉素、麦迪霉素、或吉他霉素；优选红霉素或螺旋霉素；更优选必特螺旋霉素。在另一优选例中，所述的C12-C22的高碳醇是酯与聚多元醇的混合物，所述的聚醚改性硅是聚醚改性聚硅氧浣类物质，所述的硅类物质是带有二甲基硅氧烷的植物性垸基化脂肪酸酯。在另一优选例中，所述的C12-C22的高碳醇是型号为SB2023的产品，所述的聚醚改性聚硅氧烷类物质是型号为XPJ680、或BX-828的产品，所述的硅类物质是型号为SB2450的产品；优选上海博易和化工有限公司生产的型号为BX-828的产品。在另一优选例中，所述的消泡剂在大环内酯类抗生素产生菌发酵过程中的浓度以发酵体系为基准为0.01-0.99%。。在本发明的第二方面，提供了一种消泡剂的使用方法，所述的方法包括步骤将消泡剂和大环内酯类抗生素产生菌发酵培养基混合，得到一发酵体系，所述发酵体系中消泡剂的浓度以发酵体系为基准为0.01-0.99%。；所述的消泡剂选自C12-C22的高碳醇、聚醚改性硅或硅类物质。在另一优选例中，所述发酵体系中消泡剂的浓度为0.05-0.5%。；优选浓度为0.08-0.3%。。在另一优选例中，所述的C12-C22的高碳醇是酯与聚多元醇的混合物，所述的聚醚改性硅是聚醚改性聚硅氧垸类物质，所述的硅类物质是带有二甲基硅氧烷的植物性烷基化脂肪酸酯；优选所述的C12-C22的高碳醇是型号为SB2023的产品，所述的聚醚改性聚硅氧垸类物质是型号为XPJ680、或BX-828的产品，所述的硅类物质是型号为SB2450的产品；更优选上海博易和化工有限公司生产的型号为BX-828的产品。在另一优选例中，所述的大环内酯类抗生素选自螺旋霉素、红霉素、麦迪霉素、或吉他霉素；优选红霉素或螺旋霉素；更优选必特螺旋霉素。据此，本发明提供了一种物质，它既具有理想的消泡、抑泡能力，又不影响抗生素产生菌的生理代谢；更佳地本发明还提供了这种物质的优化使用量，既提高发酵单位，也能达到理想的消泡效果，即找到了生理作用和物理作用的平衡点。图1是消泡剂物理性能检测装置。图2显示了添加消泡剂对必特螺旋霉素效价的影响；其中，1号消泡剂的终浓度分别设为0.25%、0.5%和1%，其它消泡剂使其终浓度为O.01%、0.02%和0.03%，12号消泡剂再加上0.04%的浓度;其中，1、4、7、10—13分别表示实施例1表1中的1号、4号、7号、和10—13号消泡剂。图3显示了添加消泡剂对菌浓(PMV)的影响；其中，1号消泡剂的终浓度分别设为0.25%、0.5%和1%，其它消泡剂使其终浓度为0.01%、0.02%和0.03%，12号消泡剂加上0.04%的浓度；其中，1、4、7、10—13分别表示实施例1表1中的1号、4号、7号、和10—13号消泡剂。图4显示了添加0.01%12号消泡剂(上海博易和化工有限公司生产，型号BX-828)对氨基氮、总糖和还原糖的影响。图5显示了添加0.01%12号消泡剂(上海博易和化工有限公司生产，型号BX-828)对pH、菌浓和效价的影响。图6显示了添加12号消泡剂(上海博易和化工有限公司生产，型号BX-828)对红霉素效价的影响。具体实施例方式发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现有一类物质，它在抗生素产生菌的发酵过程中，同时兼具物理和生理作用，即不但可以有良好的消泡、抑泡作用，同时还对产生菌的生理代谢具有促进作用。具体地，发明人发现一些消泡剂在大环内酯类抗生素产生菌发酵过程中，6不但具有消泡、抑泡作用，还同时可以促进菌体生长和提高生物效价。发明人还发现在一定浓度范围内，这类物质在发酵过程中的生理作用和物理作用可以达到平衡，既提高发酵单位，又能达到理想的消泡效果。所述的大环内酯类抗生素选自螺旋霉素、红霉素、麦迪霉素、或吉他霉素；较佳地为螺旋霉素；更佳地为必特螺旋霉素。如本文所用，"消泡剂"是指一种加入到反应混合物中能促进气泡破裂和气体释放以及能消除因混合、喷射或搅拌所产生的泡沫的表面活性化学物质。消泡剂可以预防、消除和/或减少泡沫。如本文所用，"消泡剂的物理作用"、"消泡剂的物理性能"和"物理作用"可互换使用，都是指消泡剂在预防、消除和/或减少泡沫方面的作用，它包括消泡作用和抑泡作用。如本文所用，"消泡"、"消泡作用"、"消泡效果"、"消泡性能"和"消泡效能"可互换使用，都是指让泡沫自然消失的作用。如本文所用，"抑泡"、"抑泡作用"、"抑泡效果"、"抑泡性能"和"抑泡效能"可互换使用，都是指使起泡能力受到抑制的作用。本发明中的消泡剂是本领域熟知的适合发酵行业使用的具有消泡、抑泡作用的消泡剂，可以是通过商业购得，选自C12-C22的高碳醇、聚醚改性硅或硅类物质。较佳地，所述的C12-C22的高碳醇是酯与聚多元醇的混合物，所述的聚醚改性硅是聚醚改性聚硅氧烷类物质，所述的硅类物质是带有二甲基硅氧垸的植物性垸基化脂肪酸酯；更佳地，所述的C12-C22的高碳醇是型号为SB2023的产品，所述的聚醚改性聚硅氧烷类物质是型号为XPJ680、或BX-828的产品，所述的硅类物质是型号为SB2450的产品；最佳地，上海博易和化工有限公司生产的型号为BX-828的产品。如本文所用，"高碳醇"和"高碳醇类消泡剂"可互换使用，都是指强疏水弱亲水的线型分子。如本文所用，"聚醚改性聚硅氧院类物质"和"聚醚改性聚硅氧垸类消泡剂"可互换使用，都是指选择具有较强抑泡作用的聚醚和疏水性强、破泡迅速的二甲基硅油为主要成分和能使硅油与聚醚有机结合起来的乳化剂、稳定剂等成分组成的兼有有机硅特性和聚醚特性的稳定的消泡剂。如本文所用，"硅类"和"硅类消泡剂"可互换使用，都是指主链为硅氧键的非极性分子。本发明所述的大环内酯类抗生素产生菌可以是本领域熟知的能通过发酵产生大环内酯类抗生素的菌株。本发明所述的大环内酯类抗生素产生菌发酵培养基可以是本领域熟知的培养大环内酯类抗生素微生物的培养基。本发明所述的必特螺旋霉素产生菌可以是本领域熟知的能通过发酵产生必特螺旋霉素的菌株，优选基因工程菌，最佳地是必特螺旋霉素基因工程菌WSJ-1-195。本发明所述的必特螺旋霉素产生菌发酵培养基可以是本领域熟知的培养必特螺旋霉素微生物的培养基。在本发明中，"生物合成"是指微生物通过发酵产生次级代谢产物的过程，尤其是指大环内酯类抗生素产生菌通过发酵产生大环内酯类抗生素的过程，特别是指必特螺旋霉素产生菌通过发酵产生必特螺旋霉素的过程。在本发明中，"生物效价"、"发酵效价"和"效价"可以互换使用，是指大环内酯类抗生素产生菌所产生的次级代谢产物的能力，尤其是指必特螺旋霉素产生菌所产生的次级代谢产物的能力。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的主要优点在于对聚醚改性聚硅氧烷类消泡剂进行合理使用，使其在发酵过程中同时具有消泡、抑泡和促进生物合成的作用。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例11材料与方法1.1菌种必特螺旋霉素基因工程菌WSJ-1-195，由沈阳同联制药集团上海研究所提供。1.2培养基配方(参见王以光，金莲舫，金文藻，等.4'酰化酶基因的克隆及在螺旋霉素产生菌中的表达[J].生物工程学报，1992，8(1):1)1.2.1斜面培养基淀粉，黄豆饼粉，NaCl，CaCO:,，KH2P04，蛋白胨等。1.2.2种子培养基淀粉，黄豆饼粉，NaCl,CaCO:,,KH2P04,蛋白胨等。1.2.3发酵摇瓶培养基葡萄糖，淀粉，鱼粉，NH4N03，CaCO:,，KH2P04,MgS047H20，NaCl等。1.2.4生物效价测定培养基牛肉膏，蛋白胨，葡萄糖，酵母膏，琼脂等。1.3培养方法1.3.1斜面培养方法茄子瓶中加入40ml斜面培养基，12rC灭菌30分钟。挖块接种，37'C培养13d，然后放置在4'C冰箱，保存备用。1.3.2种子摇瓶培养方法从茄子瓶中挖下lcmX2cm斜面孢子，然后接种至装有50ml种子培养基的500ml摇瓶中，置于摇床28'C培养48—52小时。然后按10%接种量接于二级种子培养基28'C培养24—26小时，摇床转速220转/分钟。1.3.3发酵摇瓶培养方法按4%接种量，将培养好的二级种子液接种到发酵培养基中。置于摇床28。C培养92—96小时，摇床转速220转/分钟。1.4生理参数测定方法1.4.1发酵液中总糖(还原糖)的测定采用斐林法[:']。1.4.2氨基氮含量的测定釆用甲醛法测定[4]。1.4.3菌浓(Packedmassvolume，PMV)测定取10ml发酵液，于TGL-16型高速台式离心机3000转/分钟离心10分钟，测定菌体百分比浓度。1.4.4生物效价的测定短小芽孢杆菌(&"7/"s/^w7m)作为鉴定菌，按文献(王以光，金莲舫，金文藻，等.4'酰化酶基因的克隆及在螺旋霉素产生菌中的表达[J].生物工程学报，1992，8(1):1)进行。1.4.5菌丝形态观察(参见曾小鲁.实用生物制片技术[M].北京高等教育出版社，1989:60)用普通光学显微镜，菌丝经美蓝染色。1.5消泡剂的消泡和抑泡性能测定方法1.5.1供试消泡剂消泡剂均采购于市场，分类情况见表l-表l消泡剂种类<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>1.5.2装置实验装置如图l所示。采用直径6cm、高35cm带有刻度的玻璃量筒，导入一根空气导管到量筒底部。向玻璃量筒内注入一定量的发酵液，以恒定空气速率通过玻璃量筒底部，使发酵液产生气泡，通过读取刻度可记录泡沫高度。1.5.3测定方法为了测定的方便，规定消泡性能的衡量指标是消去1700ml泡沫需要的时间，时间愈短，消泡效果愈好。抑泡性能的衡量指标是在培养基中加入消泡剂后，生成200ml泡沫所需时间，时间愈长，抑泡效果愈好。在2000ml玻璃量筒中加入200ml发酵液以恒定通气速率(3L/分钟)通入空气，当泡沫体积达到2000ml时，记录生成此体积泡沫所需时间和自然下降至300ml刻度处(即消去1700ml泡沫)时所需时间。测定消泡性能，先重新鼓泡，泡沫达到2000ml时，加入一定量的消泡剂，然后记录泡沫从2000ml降至300ml所需时间。测定抑泡性能时，首先向未鼓泡的200ml发酵液中加入一定量的消泡剂，搅拌使其分散均匀，然后鼓泡，记录生成200ml泡沫所需时间即为该消泡剂的抑泡时间。2实验结果2..1消泡剂对发酵液物理作用测定结果消泡剂的物理作用包括消泡作用和抑泡效果。消泡剂在发酵液中的消泡和抑泡性能如表2和表3所示。表2消泡性能比较\^泡时间(秒)消泡剂种类^^\消泡剂加量(l(T6g/ml)1.563.126.2512.525l号3842号3042059625193号23117413597324号35727221094455号21016913282316号1501203519107号86563519108号18214512172109号143111805217IO号645247198U号4229218612号3525108513号55301810511<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>试验中通过镜检菌丝，我们发现含有12号消泡剂试验组的菌丝细长结成网状，而对照组菌丝则比较短，且粗，部分成团，说明12号消泡剂有利于菌丝的舒展生长，同样这也有利于摇瓶中氧的传递，据戴剑漉报道，相对高的溶氧有利于必特螺旋霉素的生物合成。3结论从13种不同类型的消泡剂中筛选得到12号消泡剂，其对必特螺旋霉素发酵液的消泡、抑泡有良好的作用，而且还对必特螺旋霉素生物合成有促进作用，在0.01%使用浓度下，使发酵单位提高了34.5%,因此，该消泡剂适合在必特螺旋霉素的发酵过程中使用。实施例2在红霉素发酵中的生理效果实施例1中的12号消泡剂在另一大环内酯类抗生素一一红霉素发酵中验证了同样效果。操作条件挖取新鲜斜面(lcmXlcm)接到装有80raL种子培养基的500mL摇瓶中，温度34。C，转速220r/min，培养44-48h后，转到发酵瓶中培养，接种量为5%，温度34。C，转速240r/min,培养144h。试验组在培养基中添加不同浓度12号消泡剂，以不加消泡剂作对照，发酵结束后测定生物效价。图6显示添加0.02%优选消泡剂组，红霉素发酵单位提高30.9%。结果表明，12号消泡剂对必特螺旋霉素发酵液的消泡、抑泡有良好的作用，而且还对红霉素生物合成有促进作用，在0.02%使用浓度下，使发酵单位提高了30.9%，因此，该消泡剂适合在红霉素的发酵过程中使用。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。权利要求1.一种消泡剂在大环内酯类抗生素产生菌发酵过程中的应用，其特征在于，所述的消泡剂具有消泡、抑泡和促进生物合成的作用；所述的消泡剂选自C12-C22的高碳醇、聚醚改性硅或硅类物质。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的促进生物合成的作用包括增加产生菌菌体浓度和提高产生菌生物效价。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的大环内酯类抗生素选自螺旋霉素、红霉素、麦迪霉素、或吉他霉素；优选红霉素或螺旋霉素；更优选必特螺旋霉素。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的C12-C22的高碳醇是酯与聚多元醇的混合物，所述的聚醚改性硅是聚醚改性聚硅氧烷类物质，所述的硅类物质是带有二甲基硅氧烷的植物性烷基化脂肪酸酯。5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的C12-C22的高碳醇是型号为SB2023的产品，所述的聚醚改性聚硅氧烷类物质是型号为XPJ680、或BX-828的产品，所述的硅类物质是型号为SB2450的产品；优选上海博易和化工有限公司生产的型号为BX-828的产品。6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的消泡剂在大环内酯类抗生素产生菌发酵过程中的浓度以发酵体系为基准为0.01-0.99%。。7.—种消泡剂的使用方法，其特征在于，所述的方法包括步骤将消泡剂和大环内酯类抗生素产生菌发酵培养基混合，得到一发酵体系，所述发酵体系中消泡剂的浓度以发酵体系为基准为0.01-0.99%。；所述的消泡剂选自C12-C22的高碳醇、聚醚改性硅或硅类物质。8.如权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述发酵体系中消泡剂的浓度为0.05-0.5%。；优选浓度为0.08-0.3%。。9.如权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述的C12-C22的高碳醇是酯与聚多元醇的混合物，所述的聚醚改性硅是聚醚改性聚硅氧烷类物质，所述的硅类物质是带有二甲基硅氧烷的植物性垸基化脂肪酸酯；优选所述的C12-C22的高碳醇是型号为SB2023的产品，所述的聚醚改性聚硅氧垸类物质是型号为XPJ680、或BX-828的产品，所述的硅类物质是型号为SB2450的产品；更优选上海博易和化工有限公司生产的型号为BX-828的产品。10.如权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述的大环内酯类抗生素选自螺旋霉素、红霉素、麦迪霉素、或吉他霉素；优选红霉素或螺旋霉素；更优选必特螺旋霉素。全文摘要本发明公开了聚醚改性聚硅氧烷类物质在大环内酯类抗生素产生菌发酵过程中能同时具有消泡、抑泡和促进生物合成的作用。本发明还公开了这类物质的使用方法。文档编号C12P19/00GK101560540SQ200810036228公开日2009年10月21日申请日期2008年4月18日优先权日2008年4月18日发明者炬储,刘延茂,庄英萍,张嗣良,王军峰,王永红,郝玉有申请人:华东理工大学;上海同联制药有限公司