专利名称：一种聚丙烯腈磁珠及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种磁性生物材料及其制备方法以及作为固定化酶载体的应用，尤其涉及一种聚丙烯腈磁珠及其制备方法和应用。
固定化酶是将水溶性的酶用物理或化学方法处理，使之变成不溶于水的仍具有酶活性的酶衍生物。固定化酶不但应具有酶的高度专一性及温和条件下高效率催化的特点，还应具有一定的机械强度，使生产连续化、自动化，不带进杂质，产物容易精制，收率较高。同时，固定化酶还应能够反复使用，并具有较高的稳定性。随着生物技术的迅速发展，固定化酶在工业生产中的应用日益广泛，在食品、制药生产中起着十分重要的作用。特别使用化学工艺很难进行的操着，用固定化酶就较容易解决。
能够作为固定化酶载体的材料很多，如大孔树脂、壳聚糖、几丁质多糖等。但在生产实际中发现它们单位质量载体固定的酶量十分有限。聚丙烯腈由于丙烯腈单体都含有一个腈基(-CN)，可以被氢化为氨基(-NH3)，容易实现酶的固定化。然而，文献(Japanese published unexamined patent applications No.121592/1976和No.7485/1979，Auslegeschrift No.122633)报导，聚丙烯腈即使在其氢化后，其吸附酶的能力仍较低，而且吸附很不稳定，酶易于从载体表面释放出去。
为了克服上述困难，美国专利U.S.P.4486549采用氢化的孔状纤维结构的聚丙烯腈作为酶载体，实验发现，带有氨基(-NH3)的孔状聚丙烯腈纤维对酶的吸附量和结合能力都大大提高，可以达到2至30倍。然而，这种方法，面临的一个突出问题是固定化材料的回收和重复利用比较困难。
高分子包埋纳米磁性粒子形成的磁珠，对其表面改性可以接枝各种功能分子，如酶、抗体、DNA等。利用外加磁场可以进行回收和重复利用。但是，目前所用的高分子磁珠大都为乙烯基芳香族聚合物微珠，典型的制备方法可见USP4358388的报导。然而采用这类方法，很难制成聚丙烯腈磁珠。因为纳米磁性粒子很难均匀分散于丙烯腈中，且不能聚合成球。
本发明的目的之一在于解决现有技术中存在的上述缺陷，公开一种酶吸附量高，分离周期短、载体回收效率高的聚丙烯腈磁珠；本发明的目的之二在于提供上述聚丙烯腈磁珠制备方法；本发明的目的之三在于上述聚丙烯腈磁珠作为固定化酶载体的应用。
本发明的构思是这样的(1)采用聚丙烯腈和水溶性磁流体为主要原料，先将水溶性磁流体分散在聚丙烯腈的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，然后喷雾造粒，获得聚丙烯腈磁珠。
(2)将酶交联到氢化后的聚丙烯腈磁珠表面，在催化反应结束后，利用磁场进行回收，从而发挥固定化优势。
本发明所说的磁珠由聚丙烯腈和纳米磁性粒子所构成，其组分和重量百分比含量为聚丙烯腈 40～90％纳米磁性粒子 10～60％所说的纳米磁性粒子为Fe3O4；优选的重量百分比含量为聚丙烯腈60～90％纳米磁性粒子10～40％最优选的为聚丙烯腈70～80％纳米磁性粒子20～30％磁珠的直径在0.2～7μm之间，最佳为1～5μm。
上述的聚丙烯腈磁珠的制备包括如下步骤①超顺磁性的纳米Fe3O4粒子悬浮液的制备所说的超顺磁性是指该磁性粒子具有在磁场作用下显示磁性，撤去磁场后即无剩磁的性质。
将碱加入二价铁和三价铁的硫酸盐或氯化物混合水溶液，三价铁盐与二价铁的摩尔比为1.0～3.0，最好是1.8～2.2，这样能得到符合要求的超顺磁性材料的尺寸和磁性能。
二价过渡金属盐如铬、钴、铜、镁、锰、镍、锌盐和它们的混合物可以部分或全部取代二价铁盐；所说的碱为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠或碳酸钾等无机碱中的一种或一种以上，优选的是氢氧化钠或氨水；碱的加入量以使溶液的pH值达到8～12为好，最好为10～11；制备条件为在55～90℃，进行反应，得到黑色超顺磁性的纳米Fe3O4粒子悬浮液。
②超顺磁性的纳米Fe3O4粒子的制备在上述的纳米Fe3O4粒子悬浮液中再加入5～15％重量比的阴离子表面活性剂，如十二烷基苯磺酸钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠等，熟化30～60min后，冷却至室温，用酸如HCl调pH至4～6，然后过滤，水洗，冷冻干燥，即得到超顺磁性的纳米Fe3O4粒子；③聚丙烯腈磁珠的制备在上述的纳米Fe3O4粒子中加入5～15％重量比的阴离子表面活性剂，如十二烷基苯磺酸钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠等，制成重量百分比浓度为10～70％的水溶性的磁流体，备用；按照常规的方法制备聚丙烯腈，该方法为现有技术，简述如下称取0.1～0.5g偶氮二异丁腈倒入500mL的小烧杯中，加入20～40mL丙烯腈，1.0～2.0mL甲基丙烯酸甲脂，搅拌至偶氮二异丁腈完全溶解。加入0.5～2.5％的聚乙烯醇水溶液20～80mL，去离子水60～100mL，均匀分散后，将其倒入三口烧瓶反应器中，再在60～80℃搅拌条件下反应3～5小时出料，用去离子水250mL水透析3～5次，真空干燥，得到聚丙烯腈；将聚丙烯腈的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，配制成浓度为0.5～3g/1000mL的溶液，再将上述水溶性磁流体均匀分散在上述聚丙烯腈的溶液中，配制成磁流体含量为10～50％的混合溶液，然后用喷雾干燥机进行喷雾造粒，喷雾干燥机的干燥温度为160～200℃，进料速率为1.0～4.0mL/s，旋转盘旋转速率为20000～40000r/min，得到本发明所说的聚丙烯腈磁珠。
上述聚丙烯腈磁珠可以作为一种固定化酶载体，用于固定等电点偏酸性的生物酶，如青霉素酰化酶、胆碱氧化酶、葡萄糖氧化酶等。
该聚丙烯腈磁珠具有十分优异的性能，其固定量可比聚丙烯腈纤维或其他固定化载体高30％以上，且固定化过程简单，分离回收便利。
具体的应用方法如下将所说的聚丙烯腈磁珠置于浓度为0.01～0.05g/mL的LiAlH4的无水乙醚溶液中，在40～80℃的水浴中回流反应10分钟～30小时，然后依次用无水乙醚、稀盐酸、去离子水、碱溶液和去离子水洗涤聚丙烯腈磁珠，获得一种氢化的聚丙烯腈磁珠；聚丙烯腈磁珠与LiAlH4的加入比例为1∶1～1∶4；将上述化氢化的聚丙烯腈磁珠置于浓度为10～20％、pH为8～9的戊二醛和硼酸盐缓冲溶液中，在0℃下充分搅拌，然后在磁场中用pH为8～9的硼酸盐缓冲溶液和pH为7.5的0.1M的磷酸酸盐水溶液洗涤，将洗涤后的氢化聚丙烯腈磁珠迅速放入置有酶的磷酸盐缓冲溶液(pH为7.5)的试管中，在0～40℃的条件下反应0.5～5小时，然后将磁珠分离出溶液，即获得含有酶的聚丙烯腈磁珠。
聚丙烯腈磁珠与戊二醛和硼酸盐缓冲溶液的比例为1∶40～1∶100；所说的聚丙烯腈磁珠的酶吸附量高，且反应后可回收重复使用。回收方法如下在含有酶的聚丙烯腈磁珠经过催化反应后，用磁场对反应溶液进行分离，具体过程如下将含有聚丙烯腈磁珠的母液置于1特斯拉的磁场中，由于磁珠中包含的磁粉在磁场的作用下迅速富集，即可进行分离，然后经过洗涤，便可重复使用。
下面将结合实施例进一步阐明本发明的内容，但这些实施例并不限制本发明的保护范围。
实施例1将浓度为1.0mol/L的NaOH水溶液缓慢加入浓度为1.0mol/L的FeCl2和浓度为2.0mol/L的FeCl3混合水溶液(1∶2，摩尔比)，在85℃、pH为10的条件下反应，获得纳米Fe3O4粒子悬浮液；加入10％(重量)的油酸钠，熟化30秒，冷却至室温，用HCl调节溶液的pH至5，然后过滤，洗涤，冷冻干燥，获得超顺磁性的纳米Fe3O4粒子；
然后在上述的纳米Fe3O4粒子再中加入10％(重量)的油酸钠和水，制成水溶性的磁流体，用电子显微镜观察，其粒径为8～12nm。
实施例2称取0.2克偶氮二异丁腈倒入500mL的小烧杯中，加入30mL丙烯腈，1.5mL甲基丙烯酸甲脂，搅拌至偶氮二异丁腈完全溶解，加入2％的聚乙烯醇水溶液50mL，去离子水80mL，均匀分散后将其倒入反应瓶中，再在70℃下搅拌反应4小时，用去离子水透析5次，真空干燥，获得聚丙烯腈。
实施例3将实施例2所获得的聚丙烯腈溶解于N’N-二甲基酰胺中，配制成浓度为1.5g/mL毫升的溶液，再将实施例1的水溶性的磁流体均匀分散在上述的聚丙烯腈溶液中，配制成磁流体含量为30％的混合溶液，然后用喷雾干燥机进行喷雾造粒，喷雾干燥机的干燥温度为180℃，进料速率为2.0mL/s，旋转盘转速为40000r/min，获得聚丙烯腈磁珠。用激光散射粒度仪测得平均粒径为1.6μm。
实施例4在250毫升烧瓶中加入120毫升的无水乙醚和1克LiAlH4，然后加入2.5克实施例3的聚丙烯腈磁珠，在40℃的水浴下回流反应30分钟，反应结束后，依次用无水乙醚、稀盐酸、去离子水、碱溶液和去离子水洗涤聚丙烯腈磁珠，获得一种氢化的聚丙烯腈磁珠。用热重仪测得Fe3O4含量为23.2％。
实施例5将180mg实施例4的氢化聚丙烯腈磁珠加入15mL浓度为12.5％，pH为8.5的戊二醛和硼酸盐缓冲溶液中，在0℃下充分搅拌，活化30min，然后在磁场中用pH为8.5的硼酸盐缓冲溶液洗涤，将洗涤后的氢化聚丙烯腈磁珠迅速放入置有10毫升的酶活为23u/mL的胆碱氧化酶溶液中，在30℃的条件下震荡反应2小时，依次用pH=7.5、7.0的磷酸盐缓冲溶液在磁场作用下对磁珠进行洗涤，即获得含有胆碱氧化酶的聚丙烯腈磁珠。通过检测酶活，测得聚丙烯腈磁珠固定化的胆碱氧化酶的含量为45u/mL。将磁珠固定化的酶进行催化反应后，再用磁场分离回收，磁珠可重复使用。
权利要求
1.一种聚丙烯腈磁珠，其特征在于，组分和重量百分比含量为聚丙烯腈40～90％纳米磁性粒子10～60％。所说的纳米磁性粒子为Fe3O4；
2．如权利要求1所述的磁珠，其特征在于，重量百分比含量为聚丙烯腈60～90％纳米磁性粒子10～40％。
3．如权利要求2所述的磁珠，其特征在于，重量百分比含量为聚丙烯腈70～80％纳米磁性粒子20～30％。
4．如权利要求1～3任一所述的磁珠，其特征在于，磁珠的直径为0.2～7μm。
5．如权利要求4所述的磁珠，其特征在于，磁珠的直径为1～5μm。
6．如权利要求1～3任一所述的磁珠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤①超顺磁性的纳米Fe3O4粒子悬浮液的制备将碱加入二价铁和三价铁的硫酸盐或氯化物混合水溶液，三价铁盐与二价铁的摩尔比为1.0～3.0；所说的碱为无机碱，碱的加入量使溶液的pH值达到8～12；②超顺磁性的纳米Fe3O4粒子的制备在上述的纳米Fe3O4粒子悬浮液中加入阴离子表面活性剂，用酸调pH至4～6，然后采用常规的方法收集超顺磁性的纳米Fe3O4粒子；③聚丙烯腈磁珠的制备在上述的纳米Fe3O4粒子中再加入阴离子表面活性剂，制成水溶性的磁流体，备用；将聚丙烯腈溶解在溶剂中，再将上述水溶性磁流体分散在上述聚丙烯腈的溶液中，然后进行喷雾造粒，即得到聚丙烯腈磁珠。
7．如权利要求6所述的磁珠的制备方法，其特征在于，所说的无机碱是氢氧化钠或氨水，碱的加入量使溶液的pH值达到10～11，三价铁盐与二价铁的摩尔比为1.8～2.2。
8．如权利要求6所述的磁珠的制备方法，其特征在于，以铬、钴、铜、镁、锰、镍或锌盐和它们的混合物部分或全部取代二价铁盐。
9．如权利要求7所述的磁珠的制备方法，其特征在于，以铬、钴、铜、镁、锰、镍或锌盐和它们的混合物部分或全部取代二价铁盐。
10．如权利要求1～3任一所述的磁珠的应用，其特征在于，可以作为一种固定化酶载体，用于固定等电点偏酸性的生物酶。
全文摘要
本发明公开了一种聚丙烯腈磁珠及其制备方法和应用。本发明采用聚丙烯腈和水溶性磁流体为主要原料,先将水溶性磁流体分散在聚丙烯腈的N,N－二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,然后喷雾造粒;获得聚丙烯腈磁珠,然后将酶交联到氢化后的聚丙烯腈磁珠表面,在催化反应结束后,利用磁场进行回收,从而发挥固定化优势。该聚丙烯腈磁珠具有十分优异的性能,其固定量高,且固定化过程简单,分离回收便利。
文档编号C08K7/18GK1296032SQ00127460
公开日2001年5月23日 申请日期2000年11月21日 优先权日2000年11月21日
发明者王强斌, 朱以华, 古宏晨, 张淑兰, 王胜林 申请人:上海博纳科技发展有限公司, 华东理工大学