专利名称：：一种金钗石斛多糖提取物的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明属中药提取物,具体涉及一种金钗石斛多糖提取物制备方法及其应用。
背景技术：
：石斛是常用名贵中药材,为兰科(Oc/zWaceae)石斛属(Z)em/ra&wwSw.)多种植物的新鲜或干燥茎的统称。石斛属是兰科植物中一个较大的属，全世界约IIOO种，我国有约76种。石斛始载于《神农本草经》，被列为上品，具有滋阴清热、益胃生津、润肺止咳等功效。《中国药典》2005年版收载了金钗石斛(D."o^7eLindl.)、铁皮石斛(D.ofc/"a/eKimuraetMigo)和马鞭石斛(D./mZW"&wHook.)三种。现代化学药理研究表明，金钗石斛主要含有多糖类，生物碱类，酚类等活性物质，其中多糖类成分具有抑制肿瘤，增强或恢复免疫功能，降血糖等作用。目前石斛多糖的研究存在物质基础不明确，质量不可控，分离纯化工艺粗糙等弊端，缺乏活性成分含量高，化学成分明确，药效活性显著的文献及专利报道。而且，市面上也未见关于金钗石斛多糖的药物或药物组合物的出现。
发明内容本发明的目的是提供一种金钗石斛多糖提取物的制备方法，所述的金钗石斛多糖提取物中主要含有多糖，其中，以重量百分比计，多糖的含量为90%以上。优选多糖的含量为93%-98%。通过以下步骤实现(1)脱脂取金钗石斛饮片，用8-15倍量有机溶剂浸泡后回流1-3次，过滤，挥干有机溶剂得药渣；(2)提取上述药渣加水浸泡后，水浴提取l-3次，每次l-3小时，过滤，浓縮滤液至每ml相当于含生药0.5-2.0g;(3)醇沉向上述浓縮液中加入适量乙醇，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品I;(4)除蛋白取上述多糖提取物粗品I适量溶于水中，加入体积比为5:1的氯仿正丁醇，搅拌后分层，上层重复操作4-8次后，加入适量乙醇，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得多糖提取物粗品II;(5)除单糖及寡糖取上述多糖提取物粗品II适量溶于水中，用透析膜(截止分子量8000-14000)透析2天后，取出透析袋内液体加入适量乙醇，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品m;(6)凝胶柱纯化将上述多糖提取物粗品m用凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入适量乙醇，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得白色金钗石斛多糖提取物。步骤(1)所述的有机溶剂为石油醚，乙酸乙酯，乙醇或高浓度乙醇水溶液。步骤(2)所述的药渣加水浸泡，其中加水量为药渣的4-10倍量，优选8-10倍量；提取温度为30-80'C，优选的为40-60°C。步骤(3)-(6)中所述的加入乙醇后，乙醇的体积百分含量为50%-80%，优选的乙醇的体积百分含量为70%-80%。步骤(4)-(6)中所述的冰浴放置时间为12小时以上，优选的冰浴放置24小时。本发明的另一个目的是提供所述的金钗石斛多糖提取物在制备治疗和预防心血管疾病药物中的应用。所制备的药物还含有制剂允许的药物赋形剂或载体。本发明的有益之处是提取的石斛多糖的质量可控，提取的活性成分含量高，化学成分明确，药效活性显著。本发明提取物的制备方法的分离纯化工艺设计合理，操作简便。本发明提供的药物或药物组合物的出现，为金钗石斛多糖提供了广泛的医药用途。具体实施例方式下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。实施例一金钗石斛多糖提取物的制备(1)脱脂取金钗石斛饮片，用8倍量乙醇浸泡后回流2次，过滤，挥干有机溶剂得药渣；(2)提取上述药渣加水IO倍量浸泡后，水浴提取3次，每次1小时，过滤，浓縮滤液至每ml相当于含生药1.0g;(3)醇沉向上述浓縮液中加入适量乙醇至乙醇含量为80%，冰浴放置12小时，过滤，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品I;(4)除蛋白取上述多糖提取物粗品I适量溶于水中，加入适量氯仿及正丁醇，搅拌后分层，上层重复操作4次后，加入适量乙醇至乙醇含量为80%，冰浴放置12小时，过滤，沉淀冷冻干燥，得多糖提取物粗品II;(5)除单糖及寡糖取上述多糖提取物粗品II适量溶于水中，用透析膜(截止分子量8000-14000)透析2天后，取出透析袋内液体加入适量乙醇至乙醇含量为70%，冰浴放置12小时，过滤，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品III;(6)凝胶柱纯化将上述多糖提取物粗品m用凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入适量乙醇至乙醇含量为70%，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得白色金钗石斛多糖提取物。苯酚硫酸法测定多糖得含量为91%，bradford法测定蛋白分别为1.0%。实施例二金钗石斛多糖提取物的制备(1)脱脂取金钗石斛饮片，用10倍量80%乙醇浸泡后回流2次，过滤，挥干有机溶剂得药渣；(2)提取上述药渣加水8倍量浸泡后，水浴提取2次，每次1小时，过滤，浓縮滤液至每ml相当于含生药1.5g;(3)醇沉向上述浓缩液中加入适量乙醇至乙醇含量为80%，冰浴放置24小时，过滤，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品I;(4)除蛋白取上述多糖提取物粗品I适量溶于水中，加入适量氯仿及正丁醇，搅拌后分层，上层重复操作8次后，加入适量乙醇至乙醇含量为80%，冰浴放置24小时，过滤，沉淀冷冻干燥，得多糖提取物粗品II;(5)除单糖及寡糖取上述多糖提取物粗品n适量溶于水中，用透析膜(截止分子量8000-14000)透析2天后，取出透析袋内液体加入适量乙醇至乙醇含量为80%，冰浴放置24小时，过滤，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品III;(6)凝胶柱纯化将上述多糖提取物粗品m用凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入适量乙醇至乙醇含量为80%，冰浴放置24小时，过滤，沉淀冷冻干燥，得白色多糖CP50精品。苯酚硫酸法测定多糖得含量为93%，bradford法测定蛋白分别为1.0%。实施例三金钗石斛多糖提取物的制备(1)脱脂称取石斛药材4kg(干燥品，块状饮片)，加80%乙醇8倍量浸泡3小时(W/V)，85。C回流5小时，2次。过滤，药渣平摊，挥干乙醇；(2)提取上述药渣挥至无醇味，加4倍量蒸馏水(W/V)，浸泡12小时，5(TC水浴提取2小时，2次。四层纱布布氏漏斗抽滤，收集滤液，合并，于6(TC旋转蒸发浓縮至3000ml;(3)醇沉向上述浓縮液加约9000ml无水乙醇，用酒精比重计调节为80%乙醇含量，冰浴放置24小时，出现絮状沉淀，用四层纱布布氏漏斗抽滤，沉淀冷冻干燥得多糖提取物粗品I;(4)除蛋白称取上述多糖提取物粗品l5.0g，溶解于500ml蒸馏水中，加入CHCl3l00ml，正丁醇20ml，电动搅拌30分钟，分液漏斗静置IO分钟，分离弃去下层液，上层液重复脱蛋白操作6次。之后，上层液加无水乙醇至80%，冰浴放置24小时，离心，沉淀冷冻干燥，得多糖提取物粗品II;(5)除单糖及寡糖取上述多糖提取物粗品II适量溶于300ml蒸馏水中，用透析膜(截止分子量800014000)透析，透析袋外用磁力搅拌子匀速搅拌，每2小时换水1次，透析2天。透析袋内液体取出加无水乙醇至80%，冰浴24小时，离心，得灰色沉淀，冷冻干燥得多糖提取物粗品III;(6)凝胶柱纯化将上述多糖提取物粗品III用DeaesepharoseFF凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入适量乙醇至80%，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得白色多糖CP50精品。苯酚硫酸法测定多糖得含量为95%，bradford法测定蛋白分别为0.9°/。。实施例四乳鼠心肌细胞H202损伤模型将金钗石斛多糖提取物用优级纯的DMSO溶成浓度为50mg/mL，振摇，离心。在-20。C下储存，备用。首先进行细胞培养。维护细胞的数量以保证其可供筛选所用，但细胞数也不能太多，否则会影响细胞的生长，要定时对其进行换液和传代。H9C2为贴壁细胞，换液只需吸去培养液上清，用PBS洗一遍，再加入新鲜培养液即可。传代吸去培养液上清，用PBS洗一遍，用胰酶消化，再加入培养液终止消化，离心传代即可(培养液为DMEM(高糖)+10。/。FBS(G)+l。/。非必需氨基酸+0.1%双抗)。等细胞数量达到一定时，就可种板，为加药做准备。在培养瓶中吹打分散细胞，把混合液转移到离心管中，吸取少许在血细胞计数器上用台盼兰排斥法计数，剩下的离心10分钟(900rpm)，吸去上清。再加入适量培养液，轻轻吹打使细胞混匀分散，吸取适量培养液加入到细胞槽中，使细胞密度约为lxl(^个/0.15mL。用八孔道排枪将细胞悬液均匀的加入96孔细胞培养板上，每孔0.15mL。种板后，放于恒温细胞培养箱中培养24小时后，对其进行11202损伤模型的制造。取板，吸取上清，用PBS洗一遍，去上清。加药，用有H202培养液对药物进行稀释，使得组分药物终浓度为50pg/mL，阳性药物终浓度为50pmol/mL，11202的终浓度为200|_imol/mL。将96孔板放入培养箱中(37°C，5%C02，21%02)，24小时后取板，MTT法测细胞活度。以50|imol/mL的VC为阳性药物。治疗率=(各加药组A值一DMSO组A值)/(DMSO组A值一空白组A值)xlOOQ%，结果见表l。表1乳鼠心肌细胞&02损伤模型<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例五乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型将金钗石斛多糖提取物用优级纯的DMSO溶成浓度为50mg/mL，振摇，离心。在-20。C下储存，备用。首先进行细胞培养。维护细胞的数量以保证其可供筛选所用，但细胞数也不能太多，否则会影响细胞的生长，要定时对其进行换液和传代。H9C2为贴壁细胞，换液只需吸去培养液上清，用PBS洗一遍，再加入新鲜培养液即可。传代吸去培养液上清，用PBS洗一遍，用胰酶消化，再加入培养液终止消化，离心传代即可(培养液为DMEM(高糖)+10。/。FBS(G)+lQ/。非必需氨基酸+0.1%双抗)。等细胞数量达到一定时，就可种板，为加药做准备。在培养瓶中吹打分散细胞，把混合液转移到离心管中，吸取少许在血细胞计数器上用台盼兰排斥法计数，剩下的离心10分钟(900rpm)，吸去上清。再加入适量培养液，轻轻吹打使细胞混匀分散，吸取适量培养液加入到细胞槽中，使细胞密度约为lxl(^个/0.15mL。用八孔道排枪将细胞悬液均匀的加入96孔细胞培养板上，每孔0.15mL。种板后，放于恒温细胞培养箱中培养24小时后，对其进行缺氧模型的制造。取若干无糖Hank，s，通N2lO分钟，取板，吸取上清，用无糖Hank's洗一遍，去上清。加药，用无糖Hank's对药物进行稀释，使得组分药物终浓度为50pg/mL，阳性药物终浓度为50|imol/mL。将96孔板放入密闭环境中，抽真空，通N2，使其内部保证低氧状态，放入三气培养箱中(37。C，5%C02，5%02)。缺氧6小时。6小时后，取板，每孔取上清10iiL，测LDH。上板在取出上清10piL后，吸取掉多余上清，加入培养液(低糖DMEM+FBS)，再加药补足，使每孔含有液体量为100(iL，并使得组分药物终浓度为50pg/mL，阳性药物终浓度为50|imol/mL。放入恒温培养箱中(37°C，5%C02)。孵育4小时。4小时后，取板，每孔取上清10pL，测LDH。取一细胞槽，将LDH试剂盒中R1和R2以2:l混合均匀，用八孔道排枪将混合液加入到需测定的96孔板中，每孔300fiL，37。C下孵育。设定一系列时间点，在340nm处测定LDH值。以50pmol/mL的VC为阳性药物。按治疗率=(DMSO组A值一各加药组A值)/DMSO组A值xl00X，结果见表2。表2乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例六滴丸剂的制备取金钗石斛多糖提取物0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至68t:液体石蜡中，除油，制得滴丸300粒。实施例七冻干粉针剂的制备取降香油1.5g,加入到13ml饱和的羟丙基p-环糊精中，搅拌溶解，滤过，滤液低温干燥得降香油和羟丙基(3-环糊精的包合物粉末。除上述降香油合羟丙基(3-环糊精的包合物粉末外，再取金钗石斛多糖提取物0.5g、甘露醇5.5g、依地酸钙钠0.9g和蒸馏水2ml，上述组分混匀后，冷冻干燥，分装350支，即得。实施例八片剂的制备取金钗石斛多糖提取物适量与微晶纤维素混合均匀，加3%聚维酮乙醇溶液制软材，过18目筛制颗粒，6(TC干燥1小时，整粒，加入滑石粉适量，混匀，压片，即得。实施例九胶囊剂的制备取金钗石斛多糖提取物与花生油按2:18的比例水溶于不锈钢搅拌灌中，同时加入适量明胶和甘油混合，放出再用胶体磨磨浆，磨出的混合液搅拌，制成药液；将甘油与蒸馏水在40-5(TC温度下搅拌混溶，再将甘油液温至80-9(TC，取明胶加入其中混合搅拌，直至全部溶化成胶液，然后在6(TC温度下使胶液静置4小时，用制板机制成胶板供制丸工序使用；将上述制成的药液和胶板送入压丸机制丸，然后在22-25'C温度下吹风4小时作滚筒定型，又在25-3(TC温度下吹风干燥16-20小时，检选合格胶丸，用95%乙醇清洗，在25-30。C下吹风干燥4小时，即得。实施例十注射剂的制备取金钗石斛多糖提取物适量用4(TC注射用水溶解，加入适量药用载体等渗剂，调节溶液的pH值为7.0-8.0，加注射用水至全量，用超滤器超滤除热源，测定pH值后，用膜过滤，分装后，高压灭菌，检验、包装，即得。权利要求1.一种金钗石斛多糖提取物的制备方法，所述的金钗石斛多糖提取物中主要含有多糖，其中，以重量百分比计，多糖的含量为93％-98％，通过以下步骤实现(1)脱脂取金钗石斛饮片，用8-15倍量有机溶剂浸泡后回流1-3次，过滤，挥干有机溶剂得药渣；(2)提取上述药渣加水浸泡后，水浴提取1-3次，每次1-3小时，过滤，浓缩滤液至每毫升相当于含生药0.5-2.0g；(3)醇沉向上述浓缩液中加入乙醇，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品I；(4)除蛋白取上述多糖提取物粗品I溶于水中，加入体积比为5∶1的氯仿∶正丁醇，搅拌后分层，上层重复操作4-8次后，加入乙醇，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得多糖提取物粗品II；(5)除单糖及寡糖取上述多糖提取物粗品II溶于水中，用截止分子量8000-14000的透析膜透析2天后，取出透析袋内液体加入乙醇，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥后得多糖提取物粗品III；(6)凝胶柱纯化将上述多糖提取物粗品III用凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入乙醇，冰浴放置，过滤，沉淀冷冻干燥，得白色金钗石斛多糖提取物。2.根据权利要求1所述的一种金钗石斛多糖提取物的制备方法，其特征是步骤(1)所用的有机溶剂选用石油醚、乙酸乙酯、乙醇或高浓度乙醇水溶液中的一种。3.根据权利要求1所述的一种金钗石斛多糖提取物的制备方法，其特征是步骤(2)所述的药渣加水浸泡，其中加水量为药渣的4-10倍量，提取温度为30-80°04.根据权利要求1所述的一种金钗石斛多糖提取物的制备方法，其特征是步骤(2)所述的药渣加水浸泡，其中加水量为药渣的8-10倍量，提取温度为40-60。C。5.根据权利要求1所述的一种金钗石斛多糖提取物的制备方法，其特征是步骤(3)-(6)中所述的加入乙醇，其中乙醇的体积百分含量为50%-80%。6.根据权利要求1所述的一种金钗石斛多糖提取物的制备方法，其特征是步骤(3)-(6)中所述的加入乙醇，其中乙醇的体积百分含量为70%-80%。7.根据权利要求1所述的一种金钗石斛多糖提取物的制备方法，其特征是步骤(3)-(6)中所述的冰浴放置时间为12小时以上。8.根据权利要求1所述的一种金钗石斛多糖提取物的制备方法获得的金钗石斛多糖提取物在制备治疗和预防心血管疾病药物中的应用。9.根据权利要求8所述的一种金钗石斛多糖提取物的应用，其特征是所制备的药物还含有制剂允许的药物赋形剂或载体。全文摘要本发明提供一种金钗石斛多糖提取物的制备方法，所述金钗石斛多糖提取物经脱脂、提取、醇沉、除蛋白、除单糖和寡糖、凝胶柱纯化等步骤实现。该多糖提取物中多糖含量在90％以上。该多糖提取物具有显著的抗氧化活性，与制剂允许的药物赋形剂或载体组合，可在制备治疗和预防心血管疾病的药物或药物组合物中应用。本发明提取物的制备方法设计合理，操作简便。文档编号C08B37/00GK101407558SQ20081016249公开日2009年4月15日申请日期2008年11月14日优先权日2008年11月14日发明者斌吴,宏姚,程翼宇申请人:浙江大学