专利名称：一种猪硫酸软骨素的提取工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪硫酸软骨素的提取工艺，尤其涉及一种利用复合蛋白酶从猪软 骨中提取硫酸软骨素的方法，属于生物工程领域。
背景技术：
硫酸软骨素(Chondroition Sulfate, CS)是来自于动物软骨组织的一类重要的酸 性黏多糖，属于糖胺聚糖类物质，主要分布于动物的软骨、喉骨、鼻骨、牛、马中膈和气管中， 其他如腿骨、韧带、皮肤、角膜等组织中也含有。硫酸软骨素主要由D-葡萄糖醛酸和N-乙 酰-D-氨基半乳糖以β _1，3糖苷键连接形成二糖，而二糖单位之间以β_1，4糖苷键连接 形成生物大分子。根据结构中硫酸基的位置不同，可将硫酸软骨素分为A、C、D、E、K、M、L等 多种异构体。硫酸软骨素用途广泛，可用做药物，主要用在治疗头疼、偏头痛的药物中，可防治 因链霉素引起的听觉障碍及肝炎的辅助治疗，因其具有降血脂、抗凝血活性，也用于高血脂 症、冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病的防治。随着对其理化性质及生理功能研究的深 入，发现CS还具有抗炎、抗癌、抗HIV等活性，对神经细胞、黏膜细胞、肾细胞等具有保护作 用，且CS无明显的毒副作用。同时，硫酸软骨素在食品、化妆品中的用途也很广。目前，CS 生产工艺简单，主要用碱提取，生产周期长，提取率低，颜色较深，质量不稳定，浓碱容易使 CS发生降解，影响其生物活性，并且废料容易对环境造成污染。而酶法提取，提取率较高，纯 度也较高，生产周期较短，提取条件温和，无须脱色，无碱提取带来的污染，是比较理想的制 备方法。我国是畜牧业发达的国家，随着人民生活水平的提高，对肉、蛋、奶等传统产品的 需求数量不断增加，养殖业前景十分广阔。但是动物屠宰后，占畜禽副产品比例很大的畜骨 没有得到很好的利用。除用作动物饲料外，在食品中的应用很少。况且，与传统的畜产品加 工业相比，如肉蛋奶的加工，相去甚远。从普通畜骨创造高价值的产品，是我国畜产副产品 加工的薄弱环节，软骨是动物骨骼中的一部分，其中的蛋白多糖具有广泛的生理功能。硫酸 软骨素是单瓣多糖的组成成分之一。近年来，CS大量出口美国或欧洲，已成为出口量最大的生化医药产品之一，年出口 量约2000吨，且相当部分外贸公司因得不到质量合格产品而发愁。因此，研究新的生产工 艺及其工艺条件，使质量稳定和产率提高，进一步提高硫酸软骨素的产率和纯度，开展硫酸 软骨素在国内的应用研究和开拓市场将是很有意义的。
发明内容
本发明的目的是针对目前猪硫酸软骨素的提取工艺主要为碱提取，生产周期长， 提取率低，颜色较深，质量不稳定，浓碱容易使硫酸软骨素发生降解，影响其生物活性，并且 废料容易对环境造成污染等问题，而提供一种猪硫酸软骨素的提供工艺，缩短生产周期，提 高硫酸软骨素的提取率和纯度，降低生产成本。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下一种猪硫酸软骨素的提取方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)预处理将新鲜的猪软骨去油脂、肉渣，剪成长度为1 3. 5cm的小碎块；(2)酶解将处理好的猪软骨碎块放入反应釜中，其中猪软骨的质量含水量为 75% 82%，按软骨湿重料液体积比1 3 1 6 (kg/L)的比例加入蒸馏水，加入中重量 占软骨碎块湿重0. 4% -1. 2%的碱性复合蛋白酶，用碱溶液调节pH值至8. 0 9. 0，温度控 制在45 65°C之间，机械搅拌4 12小时，得酶解液；(3)吸附脱色将步骤O)中的酶解液过滤或离心除渣，得滤液或上清液，用酸溶 液将滤液或上清液调节PH值至3 7，加入吸附剂搅拌吸附1 2小时，温度控制在45 ^°C，趁热过滤得吸附滤液；(4)蛋白盐析将步骤(3)中的滤液，用酸溶液调节pH值至4 6，按该滤液体积 的1 5% (kg/L)加入等重的硫酸盐，继续升温并控制温度在75 90°C，搅拌20 40分 钟，使蛋白变性沉淀，停止加热，趁热过滤得滤液；(5)醇沉结晶将步骤(4)中的滤液用酸溶液调节pH值至3 7，向滤液中加入体 积百分含量为95% 100%的乙醇，使乙醇的最终体积分数达到液体总体积的70 85%， 静置沉淀8 12小时，得沉淀物；(6)真空干燥将步骤(5)中的沉淀物，用脱水剂洗涤3 5次，于55 65°C下真 空干燥6 12小时，粉碎即得所述硫酸软骨素成品。优选步骤(1)中所述的猪软骨为猪鼻骨、喉骨、软肋、气管或月牙骨中的一种或多 种。优选步骤O)中所述的碱液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液，所述的碱液浓度为 1. 0 4. Omol/L O优选步骤O)中所述的复合酶是胰蛋白酶与碱性内切蛋白酶的复合，其质量比为 1 1 1 5 ；或者是微生物碱性蛋白酶与碱性内切蛋白酶的复合，其质量比为1 1 1 4;或者是胰蛋白酶与微生物碱性蛋白酶的复合，其质量比为1 1 1 5。优选步骤(3)中所述的吸附剂为高岭土和活性炭，高岭土和活性炭所用质量分别 占滤液体积0. 5% 3% (kg/L)和 5% (kg/L)等重。优选步骤(3)、(4)和(5)中所述的酸为盐酸或硫酸，酸溶液的浓度为2.0 6.0mol/Lo优选步骤(4)中所用硫酸盐为硫酸钠、硫酸钾或硫酸铵。步骤(5)中所用脱水剂 为无水乙醇或丙酮。有益效果(1)利用碱性复合蛋白酶提取猪硫酸软骨素，提取条件温和，生产周期短，成本低， 减少碱的用量，同时减轻下游提纯的难度，减轻了对环境的污染，易于工业化生产。(2)采用单因子实验、析因实验、响应面分析实验相结合的静态优化方法，优化提 取工艺，发现温度、酶加量和PH值对硫酸软骨素的提取率影响最为显著。(3)并以上述三因素为自变量，以硫酸软骨素的提取率为响应值，进行响应面法 分析，建立了提取条件与提取率之间的数学模型，通过响应面交互作用分析与优化，确定了 适宜的硫酸软骨素提取条件为酶解温度为45 65°C，碱性复合蛋白酶的用量为0. 4% 1. 2%，pH 值为 8. 0 9. 0。(4)在较高温度下，利用硫酸钠、硫酸钾或硫酸铵进行盐析，引起蛋白质变性，能够 使酶解液中的蛋白质沉淀比较完全，提高了硫酸软骨素的纯度。
具体实施例方式以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1(1)预处理将新鲜的猪鼻骨去油脂、肉渣，剪成长度为2. Ocm的小碎块；(2)酶解将处理好的含水率为82%的猪鼻骨5. Okg放入反应釜中，并加入20. OL 蒸馏水，加入0.04kg的胰蛋白酶与碱性内切蛋白酶按质量比为1 1复合的复合蛋白酶， 用3. Omol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8. 5，温度控制在55°C，机械搅拌6小时，得到酶 解液；(3)吸附脱色将步骤(3)中的酶解液过滤，得滤液22. 6L，并用4. Omol/L盐酸调 节pH值至6.0，加入0. Ilkg高岭土和0. 68kg活性炭搅拌吸附1小时，温度控制在50°C，趁 热过滤得吸附滤液22. 0L；(4)蛋白盐析将步骤(3)中的22. OL吸附滤液，用4. Omol/L盐酸调节pH值至 4. 0，加入0. 44kg的硫酸钠，继续升温并控制温度在80°C，搅拌30分钟，使蛋白变性沉淀，停 止加热，趁热过滤得滤液21. 6L ；(5)醇沉结晶将步骤⑷中的21. 6L滤液用4. 0mol/L盐酸调节pH值至6. 0，加 入64. 8L无水乙醇至体积分数为75%，静置沉淀8小时；(6)真空干燥将步骤(5)中的沉淀物，用无水乙醇洗涤3次，58°C下真空干燥8小 时，粉碎即得2. 05kg硫酸软骨素成品。样品检测结果分析见表1。实施例2(1)预处理将新鲜的猪喉骨与气管去油脂、肉渣，剪成长度为3. Ocm的小碎块；(2)酶解将处理好的含水率为79%的猪喉骨与气管碎块8. Okg放入反应釜中，并 加入40. OL蒸馏水，加入0.08kg的微生物碱性蛋白酶与碱性内切蛋白酶按质量比为1 3 复合的复合蛋白酶，用1. 0mol/L的氢氧化钾溶液调节pH值至8. 0，温度控制在58°C，机械 搅拌8小时，得到酶解液；(3)吸附脱色将步骤O)中的酶解液离心除渣，得上清液45. 0L，并用6. Omol/L 盐酸调节PH值至4. 0，加入0. 68kg高岭土和0. 90kg活性炭搅拌吸附1. 5小时，温度控制在 47°C，趁热过滤得吸附滤液44. 5L ；(4)蛋白盐析将步骤(3)中的吸附滤液44. 5L，用6. Omol/L盐酸调节pH值至 6. 0，加入1. 78kg硫酸铵，继续升温并控制温度在90°C，搅拌20分钟，使蛋白变性沉淀，停止 加热，趁热过滤得滤液43. 8L；(5)醇沉结晶将步骤⑷中的43. 8L滤液，用6. Omol/L盐酸调节pH值至7. 0，加 入184. 4L95%的乙醇至体积分数为80%，静置沉淀9小时；(6)真空干燥将步骤(5)中的沉淀物，用丙酮洗涤5次，60°C下真空干燥10小时， 粉碎即得3. 36kg硫酸软骨素成品。样品检测结果分析见表2。
实施例3(1)预处理将新鲜的猪软肋与月牙骨去油脂、肉渣，剪成长度为1.5cm小碎块；(2)酶解将处理好的含水率为75%的猪软肋与月牙骨10. Okg放入反应釜中，并 加入30. OL蒸馏水，加入0.09kg的胰蛋白酶与微生物碱性蛋白酶按质量比1 3复合的复 合蛋白酶，用2. Omol/L的氢氧化钾溶液调节pH值至8. 7，温度控制在60°C，机械搅拌12小 时，得到酶解液；(3)吸附脱色将步骤O)中的酶解液过滤，得滤液35. 8L，用2. Omol/L硫酸调节 pH值至5. 0，加入0. 72kg高岭土和0. 54kg活性炭搅拌吸附2小时，温度控制在45°C，趁热 过滤得吸附滤液35. 2L ；(4)蛋白盐析将步骤(3)中的35. 2L滤液，用2. Omol/L硫酸调节pH值至5. 0，加 入1. 06kg硫酸钾，继续升温并控制温度在75°C，搅拌40分钟，使蛋白变性沉淀，停止加热， 趁热过滤得滤液34. 4L ；(5)醇沉结晶将步骤(4)中的34. 4L滤液，用2. 0mol/L硫酸调节pH值至4. 5，加 入194. 9L无水乙醇至体积分数为85%，静置沉淀12小时；(6)真空干燥将步骤(5)中的沉淀，用无水乙醇洗涤4次，65°C下真空干燥9小 时，粉碎即得4. 05kg硫酸软骨素成品。样品检测结果分析见表3。实施例4(1)预处理将新鲜的猪喉骨去油脂、肉渣，剪成长度为2. 5cm的小碎块；(2)酶解将处理好的含水率为80 %的猪喉骨碎块15. Okg放入反应釜中，并加入 90. OL蒸馏水，加入0.18kg的微生物碱性蛋白酶与碱性内切蛋白酶按质量比为1 1复合 的复合蛋白酶，用4. 0mol/L的氢氧化钠调节pH值至9. 0，温度控制在50°C之间，机械搅拌 10小时，得酶解液；(3)吸附脱色将步骤⑵中酶解液离心除渣，得上清液120. 0L，用3. Omol/L硫酸 调节PH值至4. 5，加入0. 30kg高岭土和0. 12kg活性炭搅拌吸附1小时，温度控制在55°C， 趁热过滤得吸附滤液119. 0L；(4)蛋白盐析将步骤(3)中的119. OL滤液，用3. 0mol/L硫酸调节pH值至5. 5， 加入0. 36kg硫酸钠，继续升温并控制温度在85°C，搅拌25分钟，使蛋白变性沉淀，停止加 热，趁热过滤得滤液118. 0L；(5)醇沉结晶将步骤⑷中的118. OL滤液，用3. 0mol/L硫酸调节pH值至3. 5， 加入观9. 8L95%的乙醇至体积分数为70%，静置沉淀10小时；(6)真空干燥将步骤(5)中的沉淀，用丙酮洗涤4次，55°C下真空干燥12小时， 粉碎即得6. 12kg硫酸软骨素成品。样品检测结果分析见表4。将上述提取工艺制得的硫酸软骨素进行分析，结果如下表1实施例1样品检测结果分析
权利要求
1.一种猪硫酸软骨素的提取工艺，其具体步骤如下(1)预处理将新鲜的猪软骨去油脂、肉渣，剪成长度为1 3.5cm的小碎块；(2)酶解将处理好的猪软骨碎块放入反应釜中，其中猪软骨的质量含水率为75% 82%，按软骨湿重料液体积比1 3 1 6kg/L的比例加入蒸馏水，加入占软骨碎块湿重 0. 4% -1. 2%的碱性复合蛋白酶，用碱溶液调节pH值至8. 0 9. 0，温度控制在45 65°C 之间，机械搅拌4 12小时，得酶解液；(3)吸附脱色将步骤O)中的酶解液过滤或离心除渣，得滤液或上清液，用酸溶液将 滤液或上清液调节PH值至3 7，加入吸附剂搅拌吸附1 2小时，温度控制在45 55°C， 趁热过滤得吸附滤液；(4)蛋白盐析将步骤(3)中的滤液，用酸溶液调节pH值至4 6，按该滤液体积的1 5% (kg/L)加入等重的硫酸盐，继续升温并控制温度在75 90°C，搅拌20 40分钟，使蛋 白变性沉淀，停止加热，趁热过滤得滤液；(5)醇沉结晶将步骤(4)中的滤液用酸溶液调节pH值至3 7，向滤液中加入体积质 量百分浓度为95% 100%的乙醇，使乙醇的最终体积分数达到液体总体积的70 85%， 静置沉淀8 12小时，得沉淀物；(6)真空干燥将步骤(5)中的沉淀物，用脱水剂洗涤3 5次，于55 65°C下真空干 燥6 12小时，粉碎即得所述硫酸软骨素成品。
2.根据权利要求1所述的一种猪硫酸软骨素的提取工艺，其特征在于在步骤(1)中 所述的猪软骨为猪鼻骨、喉骨、软肋、气管或月牙骨中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种猪硫酸软骨素的提取工艺，其特征在于在步骤O)中 所述的碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液；碱溶液的浓度为1. 0 4. 0mol/Lo
4.根据权利要求1所述的一种猪硫酸软骨素的提取工艺，其特征在于在步骤O)中 所述的复合酶是胰蛋白酶与碱性内切蛋白酶的复合，其质量比为1 1 1 5;或者是微 生物碱性蛋白酶与碱性内切蛋白酶的复合，其质量比为1 1 1 4;或者是胰蛋白酶与 微生物碱性蛋白酶的复合，其质量比为1 1 1 5。
5.根据权利要求1所述的一种猪硫酸软骨素的提取工艺，其特征在于在步骤(3)中 所述的吸附剂为高岭土和活性炭；高岭土和活性炭所用质量分别占滤液体积的0.5% 3% kg/L 和 5% kg/L。
6.根据权利要求1所述的一种猪硫酸软骨素的提取工艺，其特征在于在步骤( 、(4) 和(5)中所述的酸溶液为盐酸或硫酸溶液，酸溶液的浓度为2. 0 6. 0mol/Lo
7.根据权利要求1所述的一种猪硫酸软骨素的提取工艺，其特征在于在步骤中 所用硫酸盐为硫酸钠、硫酸钾或硫酸铵。
8.根据权利要求1所述的一种猪硫酸软骨素的提取工艺，其特征在于在步骤(6)中 所用脱水剂为无水乙醇或丙酮。
全文摘要
本发明公开了一种猪硫酸软骨素的提取工艺。该提取工艺包括原料的预处理、酶解、吸附脱色、蛋白盐析、醇沉结晶、真空干燥等。本发明的方法以硫酸软骨素的提取率为指标，采用单因子实验、析因实验、响应面分析实验相结合的静态优化方法，优化了提取工艺，工艺条件合理，具有良好的功效稳定性。该法优点是，只需要一步酶解反应即可把硫酸软骨素从猪软骨中提取出来，提取条件温和、生产周期短、产品色泽洁白、提取率高、纯度高、无碱提取带来的污染，有利于环保，易于工业化生产。
文档编号C08B37/08GK102134288SQ20111009839
公开日2011年7月27日 申请日期2011年4月19日 优先权日2011年4月19日
发明者杨文革, 胡永红, 陈召国 申请人:南京工业大学