专利名称：牦牛骨制取硫酸软骨素的一种方法
技术领域：
本发明涉及牦牛骨制取硫酸软骨素的一种生产工艺。具体的说，本发明涉及以青藏高原特色物种牦牛屠宰后废弃的鼻骨、喉骨、软肋、气管、月牙骨等软骨为原料，采用双酶解、过滤、乙醇沉淀、真空干燥等系列工艺制备硫酸软骨素，属于生化制药技术领域。
背景技术：
硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate, ChS)是典型的多糖药物品种之一，临床应用历史悠久，且应用范围不断扩大，除了对防治骨性关节炎有明显效果外，硫酸软骨素的复合制剂在神经痛、老年性肩痛、皮肤病等的治疗中也有广泛应用。随着科技的进步，硫酸软 骨素越来越多新的保健功能被发现硫酸软骨素可增加脂肪酶的活性，使乳糜微粒中的甘油三酯分解，血液中乳糜微粒减少而澄清；具有抗凝和抗血栓作用，可用于冠状动脉硬化、血脂和胆固醇增高、心绞痛、心肌缺血和心肌梗死等症的治疗；同时还可用于某些神经性头痛，神经痛，关节痛，偏头痛的治疗以及链霉素引起的听觉障碍及肝炎等的辅助治疗；此外，硫酸软骨素还被发现具有良好的抗衰老功能。硫酸软骨素主要存在于动物的软骨中，至今尚无法采用化学合成或生物合成方法制备，只能从动物的软骨中提取。软骨素为酸性粘多糖，在软骨组织中与蛋白质结合成蛋白多糖，并被胶原蛋白分子包裹，所以在提取软骨素时，首先要把蛋白质的链条切开，释放出硫酸软骨素。目前国内企业普遍采用强碱或稀碱破坏蛋白，然后加入酸水解、高盐沉淀除去蛋白，大量的蛋白、酸碱以及高盐随生产废水排放，造成严重的环境污染。据测算，每生产I吨硫酸软骨素，就要排放5-10吨的蛋白、5-9吨的酸碱盐等废弃物，使硫酸软骨素的生产带来较大经济效益的同时，也造成了极严重的环境污染，而凭借现有的污水处理技术，即使投入巨资，也难以处理如此高浓度的废水，所以硫酸软骨素的生产在发达国家基本全部停产。随着我国对环保问题的重视，硫酸软骨素的众多生产企业也濒临关闭，迫切需要减少废弃物产生、排放清洁生产技术的支撑。本发明硫酸软骨素的制备创新采用牦牛软骨作原料，自然条件下生产的牦牛软骨保证了产品的绿色无污染性，与普通来源的硫酸软骨素相比具有明显的产品优势。
发明内容
本发明提供了一种牦牛骨制取硫酸软骨素的生产工艺，采用了一条新型、简单、环保的技术路线，有效提高了产品质量，整个反应条件温和，操作简单，减少了牦牛废弃物对环境的污染，满足工业化生产的要求。本发明的方法包括下列步骤I.材料的预处理将鲜牦牛软骨洗净，放入80 1恒温蒸煮锅中，加水淹没，煮3 4h后捞出，剔除软骨上的肉、脂肪、软骨包裹膜和纤维化硬骨组织等杂质，得到纯净软骨，放入冷库-18°C _20°C速冻，使骨质疏松，使用前取出，在60°C 80°C烘干3 4h，用粉碎机对牦牛软骨破碎后备用。2.双酶解采用碱性胰蛋白酶和酸性胃蛋白酶对预处理后的牦牛软骨进行充分酶解。滤液用2mol/L HCI调节pH值至8. O 9.0，按1000 0.5(V滤液V胰酶)的比例加入胰酶，于40 50°C水解lh，再按1000 O. 5的比例加胃蛋白酶，40 50°C水解I. 5h。3.过滤酶解液冷却后，用500目滤布过滤，再用MNWC-5000中空纤维超滤器浓缩体积的一半左右，得到浓缩过滤酶解液。
4.醇沉所得滤液在搅拌条件下加入95%酒精(食品级)，使溶液的酒精浓度达到65%，醇沉6-8h，虹吸上清液回收乙醇，压滤，所得沉淀为硫酸软骨素粗品。5.乙醇精制加入95%乙醇使溶液终浓度达75%，30分钟搅拌一次，使细粒聚集成大颗粒沉淀，静置8小时以上，吸去上清液，沉淀用无水乙醇脱水洗涤I 2次。6.真空干燥将所得沉淀抽干，于60°C 65°C真空干燥，即得到成品硫酸软骨素。
具体实施例方式以下将参照实例对本发明作进一步的详细描述，但本发明不限于此具体实例。实施例I.取新鲜牦牛喉骨10kg，洗净，放入80°C恒温蒸煮锅中，加水淹没，煮3h后捞出，剔除喉骨上的包裹膜和纤维化硬骨组织等杂质，得到纯净喉骨，放入冷库-20°C速冻。待使用时，在70°C烘干3h，用粉碎机对牦牛软骨破碎后备用；将洁白干净的牦牛喉骨块放入反应釜内，加入适量水，采用碱性胰蛋白酶和酸性胃蛋白酶对上述牦牛软骨进行充分水解用2mol/L HCI调节pH值到8·5，按1000 O. 5 (Visa V胰酶)的比例加入胰酶，于45°C水解lh。再按1000 O. 5的比例加胃蛋白酶，45°C水解I. 5h;酶解液冷却后，用500目滤布过滤，再用MNWC-5000中空纤维超滤器浓缩体积的一半左右，得到浓缩过滤酶解液。所得滤液在搅拌下加入95%酒精(食品级)，使溶液的酒精浓度达到65%，醇沉7h，虹吸上清液回收乙醇，压滤，所得沉淀为硫酸软骨素粗品；再加入95%乙醇浓度达75%，30分钟搅拌一次，使细粒聚集成大颗粒沉淀，静置9小时，吸去上清液，沉淀用无水乙醇脱水洗涤2次；将其抽干，于65°C真空干燥，即得成品硫酸软骨素。对产品含量进行测定，硫酸软骨素含量达到92. 45%，收率为 24. 39%。实施例2.取新鲜牦牛软肋200kg，洗净，放入80°C恒温蒸煮锅中，加水淹没，煮4h后捞出，剔除喉骨上的包裹膜和纤维化硬骨组织等杂质，得到纯净软肋，放入冷库-20°C速冻；使用时80°C烘干4h，用粉碎机对牦牛软骨粉碎后备用；将洁白干净的牦牛喉骨块放入反应釜内，加入适量水，采用碱性胰蛋白酶和酸性胃蛋白酶对上述牦牛软骨进行充分酶解用2mol/L HCI调节pH值到8. 6，按1000 O. 5 (Visa V胰酶)的比例加入胰酶，50°C水解Ih ;再按1000 O. 5的比例加胃蛋白酶，50°C水解I. 5h;酶解液冷却后，用500目滤布过滤，再用MNWC-5000中空纤维超滤器浓缩一半体积，得到浓缩过滤酶解液；所得滤液搅拌条件下加入95%酒精(食品级)，使溶液中酒精浓度达到65%，醇沉7. 5h，虹吸上清液回收乙醇，压滤，所得沉淀为硫酸软骨素粗品；再加入95%乙醇使终浓度达75%，30分钟搅拌一次，使细粒聚集成大颗粒沉淀，静置9. 5小时，吸去上清液，沉淀用无水乙醇脱水洗涤2次；将其抽干，于60°C真空干燥，即得成品硫酸软骨素。对产品含量进行测定，硫酸软骨素含量达到92. 31%，收率为 21. 89%。采用实施例2方法所得硫酸软骨素产品检测结果为
含量(干品计)92.31% 外观白色粉末 水分6.6% 含氮量(干品计)3.1%
氯化物彡0.1%重金属(以Pb计)<20ppm细菌数量<100cfb/g实施例3.取新鲜牦牛软肋200Kg，洗净，放入80°C恒温蒸煮锅中，加水淹没，煮4h后捞出，剔除喉骨上的包裹膜和纤维化硬骨组织等杂质，得到纯净软肋，放入冷库-20°C速冻。待使用时，在80°C烘干4h，用粉碎机对牦牛软骨破碎后备用。将洁白干净的牦牛喉骨块放入反应釜内，加入适量水，采用碱性蛋白酶胰蛋白酶和酸性蛋白酶胃蛋白酶对上述牦牛软骨进行充分水解用2mol/L HCI调节pH值到8. 6，按滤液与胰酶1000 O. 5的比例加入胰酶，于50°C水解lh。再按1000 O. 5的比例加胃蛋白酶，50°C水解I. 5h。酶解液冷却后，用500目滤布过滤，再用MNWC-5000中空纤维超滤器浓缩到体积的一半左右，得到浓缩过滤酶解液。所得滤液在搅拌下加入95%酒精(食品级)，使溶液的酒精浓度达到65%，醇沉7.5h，虹吸上清液回收乙醇，压滤，所得沉淀为硫酸软骨素粗品。再加入95%乙醇浓度达75%，每30分钟搅拌一次，使细粒聚集成大颗粒沉淀，静置9. 5小时，吸去上清液，沉淀用无水乙醇脱水洗涤2次。将其抽干，于60°C真空干燥，即得成品硫酸软骨素。对产品含量进行测定，硫酸软骨素含量达到92. 31%，收率为21. 89%。采用实施例1、2、3方法所得硫酸软骨素产品检测结果如表I所示。表I.硫酸软骨素产品检测结果
项目实例I实例2实例3 -
含量(干品计) 92.45% 91.89 92. 31
I观—白色粉末白色粉末白色粉末
—水分I 7.0%6. 5%6.6%
权利要求
1.牦牛骨制取硫酸软骨素的方法关键技术如下 (1)双酶酶解法 采用碱性胰蛋白酶和酸性胃蛋白酶对预处理后的牦牛软骨进行水解，滤液用2mol/LHCI调节pH值到8 O 9. O，按1000 0.5(V滤液V胰酶)的比例加入胰酶，40 50°C水解lh，再按1000 0. 5的比例加胃蛋白酶，40 50°C水解I. 5h。
(2)升温盐解 采用2%的NaCl进行盐解，55°C恒温0. 5小时后，80°C恒温3 8min ； (3)醇沉 所得滤液搅拌下加入95%酒精(食品级)，溶液酒精浓度达到65%，醇沉6h 8h，虹吸上清液回收こ醇，压滤，所得沉淀为硫酸软骨素粗品。
(4)こ醇精制 加入95%こ醇浓度至终浓度达到75%，30min搅拌一次，使细粒聚集成大颗粒沉淀，静置8小时以上，吸去上清液，沉淀用无水こ醇脱水洗涤I 2次。
2.根据权利要求I牦牛骨制取硫酸软骨素方法，其特征在于加入胰蛋白酶后，最佳酶解条件为温度50°C，pH值为8. 0 9. 0，胰酶加入量为0. 02g dF1 0. 04g dl'
3.根据权利要求I的牦牛骨制取硫酸软骨素方法，其特征在于加入95%酒精(食品级)，溶液的酒精浓度达到65%，醇沉6. 5h 7. 5h为宜。
4.根据权利要求I牦牛骨制取硫酸软骨素方法，其特征在于加入95%こ醇浓度达75%，每30min搅拌一次，静置9h Ilh为宜。
5.根据权利要求I牦牛骨制取硫酸软骨素方法，其特征在于获得硫酸软骨素产品，含量大于90%,收率大于18%。
全文摘要
牦牛骨制取硫酸软骨素的一种生产工艺。本发明涉及利用青藏高原特色物种牦牛屠宰后废弃的鼻骨、喉骨、软肋、气管、月牙骨等软骨为原料，通过双酶酶解法、沉淀分离、过滤、乙醇沉淀、真空干燥等系列工艺制备硫酸软骨素。解决了目前本类产品生产工艺流程复杂、污染严重、碱酸或盐用量较大、提取周期较长以及收率较低等问题。本法制取的硫酸软骨素含量达到90％以上，收率达到18％以上；同时对牦牛废弃原料的充分利用，减轻了对环境的污染，有效提高了资源利用率，且易于工业化生产。
文档编号C08B37/08GK102850466SQ20111017637
公开日2013年1月2日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者高聚霞 申请人:西藏金稞集团有限责任公司