AGSE缺陷菌株的制作方法

文档序号:17063203发布日期:2019-03-08 18:32阅读:来源:国知局

技术特征:

1. 一种突变微生物宿主细胞,其中所述突变微生物宿主细胞是选自黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和米曲霉(Aspergillus oryzae)物种的曲霉菌(Aspergillus),其已在其基因组中被修饰,以导致与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量时,在选自以下的多肽的生成上缺陷:

a. 根据SEQ ID NO: 3的多肽或与其至少85%相同并且具有根据SEQ ID NO: 3的多肽的至少一种活性的多肽;

b. SEQ ID NO: 3中包含的成熟多肽或与其至少85%相同并且具有SEQ ID NO: 3中包含的成熟多肽的至少一种活性的多肽;

c. 根据SEQ ID NO: 1或2的多核苷酸编码的或与SEQ ID NO: 1或2至少85%相同的多核苷酸编码的多肽,其中根据SEQ ID NO: 1或2的多核苷酸编码的所述多肽具有根据SEQ ID NO: 1或2的多核苷酸编码的多肽的至少一种活性;

其中根据a.- c.所述的多肽具有a-1,3-葡聚糖合酶[EC 2.4.1.183]酶活性, 其中所述突变微生物宿主细胞包含编码目标化合物的至少一种多核苷酸或编码在目标化合物的生成中所涉及的化合物的至少一种多核苷酸,其中编码目标化合物的所述至少一种多核苷酸或编码在目标化合物的生成中所涉及的化合物的所述至少一种多核苷酸与启动子可操作地连接,其中所述目标化合物是酶,

其中其基因组中的所述修饰选自:

i)完全或部分缺失c.中定义的多核苷酸;

ii)用不编码a.-c.中定义的多肽或编码a. 至c.中所定义多肽的部分或完全失活形式的多核苷酸序列完全或部分置换c.中定义的多核苷酸;

iii)通过在多核苷酸序列中插入一个或更多个核苷酸来破坏c.中所定义的多核苷酸,从而部分或完全失活a.至c.中所定义的多肽。

2. 根据权利要求1所述的突变微生物宿主细胞,其中SEQ ID NO: 3中包含的所述成熟多肽为根据SEQ ID NO: 4的成熟多肽。

3. 根据前述权利要求中任一项所述的突变微生物宿主细胞,其中所述修饰包括:

a)与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比,在相同条件下分析时,导致权利要求1a.-1c.中定义的多肽生成减少或不生成的修饰,和/或

b)与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比,在相同条件下分析时,生成活性降低或没有活性的源自权利要求1a.-1c.所定义多肽的修饰。

4.根据权利要求1或2所述的突变微生物宿主细胞,其中编码目标化合物的所述至少一种多核苷酸或编码在目标化合物的生成中所涉及的化合物的所述至少一种多核苷酸与诱导型启动子可操作地连接。

5.根据权利要求1或2所述的突变微生物宿主细胞,其中所述启动子为碳水化合物诱导型启动子。

6.根据权利要求5所述的突变微生物宿主细胞,其中所述碳水化合物诱导型启动子选自淀粉诱导型启动子的启动子,葡糖淀粉酶启动子、酸稳定性淀粉酶启动子、α-淀粉酶启动子和TAKA淀粉酶启动子。

7. 一种生成根据前述权利要求中任一项的突变微生物宿主细胞的方法,其中所述突变微生物宿主细胞是选自黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和米曲霉(Aspergillus oryzae)物种的曲霉菌(Aspergillus),其包括以下步骤:

a. 提供亲本微生物宿主细胞,其为曲霉菌宿主细胞;

b.修饰所述亲本微生物宿主细胞的基因组,以产生与亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量时,在选自以下的多肽的生成上缺陷的突变微生物宿主细胞:

(i) 根据SEQ ID NO: 3的多肽或与其至少85%相同的具有根据SEQ ID NO: 3的多肽的至少一种活性的多肽;

(ii) SEQ ID NO: 3中包含的成熟多肽或与其至少85%相同并且具有SEQ ID NO: 3中包含的成熟多肽的至少一种活性的多肽;

(iii) 根据SEQ ID NO: 1或2的多核苷酸编码的或与SEQ ID NO: 1或2至少85%相同的多核苷酸编码的多肽,其中根据SEQ ID NO: 1或1的多核苷酸编码的所述多肽具有根据SEQ ID NO: 1或2的多核苷酸编码的多肽的至少一种活性;

其中(i)-(iii)所述的多肽具有a-1,3-葡聚糖合酶[EC 2.4.1.183]酶活性, 其中所述突变微生物宿主细胞包含编码目标化合物的至少一种多核苷酸或编码在目标化合物的生成中所涉及的化合物的至少一种多核苷酸,其中编码目标化合物的所述至少一种多核苷酸或编码在目标化合物的生成中所涉及的化合物的所述至少一种多核苷酸与启动子可操作地连接,其中所述目标化合物是酶,

其中其基因组中的所述修饰选自:

a)完全或部分缺失(iii)中定义的多核苷酸;

b)用不编码(i)至(iii)中定义的多肽或编码(i)至(iii)中所定义多肽的部分或完全失活形式的多核苷酸序列完全或部分置换(iii)中定义的多核苷酸;

c)通过在多核苷酸序列中插入一个或更多个核苷酸来破坏(iii)中所定义的多核苷酸,从而部分或完全失活(i)至(iii)中所定义的多肽。

8.根据权利要求7所述的方法,其中所述突变微生物宿主细胞为根据权利要求1-6中任一项所述的突变微生物宿主细胞。

9.一种通过微生物发酵生成目标化合物的方法,其中所述目标化合物是酶,其包括:

a. 提供能够表达所述目标化合物的根据权利要求1-6中任一项所述的或通过根据权利要求7或8的方法生成的突变微生物宿主细胞,

b. 在有益于表达所述目标化合物的条件下培养所述突变微生物宿主细胞,

c.从培养基中分离所述目标化合物。

10.根据权利要求9所述的方法,其中所述目标化合物为葡萄糖氧化酶。

11.根据权利要求9-10中任一项所述的方法,其中与使用未被修饰的亲本微生物宿主细胞来生成目标化合物的方法的产率相比,在相同条件下测量时,所述目标化合物的产率增加。

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