(7S)‑3,4‑二甲氧基双环并[4.2.0]辛‑1,3,5‑三烯‑7‑甲酸的酶合成方法以及在伊伐布雷定及其盐的合成中的应用与流程

(7S)-3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酸的酶合成方法以及在伊伐布雷定及其盐的合成中的应用技术领域本发明涉及制药领域。更具体而言，本发明涉及酶合成式(I)化合物的方法：还涉及该化合物在式(II)的伊伐布雷定或3-{3-[{[(7S)-3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基]甲基}(甲基)氨基]丙基}-7,8-二甲氧基-1,3,4,5-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮、其药学上可接受的酸的加成盐及其水合物的合成中的应用：

背景技术：
伊伐布雷定及其与药学上可接受的酸的加成盐(更特别的是其盐酸盐)具有非常有价值的药理学和治疗特性，特别是具有减慢心率的特性，这使得这些化合物可以用于治疗或预防各种心肌缺血疾病，例如心绞痛、心肌梗塞及相关心律失常疾病以及与心律失常有关的各种病理，特别是室上性心律失常疾病和心力衰竭。伊伐布雷定及其药学上可接受的酸的加成盐(特别是其盐酸盐)的制备和治疗用途已经公开于欧洲专利说明书EP0534859。该专利说明书描述了采用式(III)化合物(7S)-1-(3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基)N-甲基甲胺作为起始原料的伊伐布雷定盐酸盐的合成：式(III)化合物是在伊伐布雷定及其药学上可接受的盐的合成中的关键中间体。现有技术公开了获得式(III)化合物多种方法。专利说明书EP0534859描述了通过下列步骤合成式(III)化合物的方法：首先在四氢呋喃中通过BH3还原式(IV)的腈：随后加入盐酸，得到外消旋的式(V)胺的盐酸盐：将其与氯代甲酸乙酯反应，得到式(VI)的氨基甲酸酯：将其通过LiAlH4还原，获得外消旋的式(VII)的甲基化胺：将其采用樟脑磺酸拆分，获得式(III)化合物。该方法采用外消旋的式(IV)的腈制备式(III)化合物的缺点在于收率非常低，仅有2－3%。该非常低的收率是由于式(VII)的仲胺的拆分步骤的收率低(4－%)导致的。专利说明书EP2166004描述了通过下述方法获得式(III)化合物的方法：首先采用手性色谱对外消旋的式(IV)的腈进行光学拆分，获得光学纯的式(IX)的腈：将其采用NaBH4还原或者通过水解的氢还原，获得式(VIII)的伯胺。然后，该伯胺可以采用与上述相同的反应顺序进行甲基化(转化为氨基甲酸酯，然后还原)。因此，采用外消旋的式(IV)的腈作为起始原料，可以通过5步反应获得式(III)化合物，拆分步骤的收率达到45.6%。为了能够采用外消旋的式(IV)的腈作为起始原料直接获得光学纯的式(I)的酸并且从而减少采用外消旋的腈作为原料获得甲基化的式(III)的胺的步骤数目，采用水解的腈水解酶(在酶的国际分类中为EC3.5.5.1)似乎具有很好的前景。式(X)的腈已有报道可以作为获自Almac公司销售的NESK-1400筛选试剂盒的腈水解酶的底物：然而，采用这些相同的腈水解酶显示它们对式(IV)的腈(参考对比实施例A)具有较低的活性并且几乎没有选择性，在大多数情况下导致酰胺(腈水合酶活性)和酸的同时形成，这难以开发出为了获得式(III)化合物合成中所需要的中间体的合成方法。

技术实现要素：
因此，本发明的目的是发现能够采用外消旋的式(IV)的腈作为原料对映选择性合成光学纯的式(I)的酸同时尽可能减少酰胺形成的腈水解酶。本申请人在各种完整微生物中发现了能够优先形成构型为S的式(I)的酸的腈水解酶活性的证据。在测试的微生物中，只有玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodocrous)能够以良好对映选择性获得(S)酸并且不会形成酰胺(参考对比实施例B)。该活性可以通过腈水解酶的过度表达而提高。令人惊奇的是，采用过度表达的腈水解酶进行的酶的水解对于式(X)的底物没有对映选择性(参考对比实施例C)。更具体地讲，本发明涉及合成光学纯的式(I)化合物的方法：该方法采用在另一种具有活性的生物学系统的微生物(例如细菌、酵母菌或真菌)中过度表达的玫瑰色红球菌NCIMB11216的腈水解酶通过外消旋的或非光学纯的式(IV)的腈的对映选择性酶水解进行：该反应在有机溶剂和pH为5－10的水溶液(优选pH5－10的缓冲液)的混合物中进行，每升溶剂混合物中式(IV)的腈的浓度为1－500g/L，优选2－100g/L，E/S的比例为1/1－1/100，反应温度为25℃－40℃。根据本发明的一个方面，所述腈水解酶在包含重排质粒的细菌中过度表达，例如大肠杆菌(Escherichiacoli)，优选E.coliBL21(DE3)、E.coliBL21(DE3)pLysS、E.coliBL21star(DE3)或E.coliJM9(DE3)。根据本发明的一个方面，所述有机溶剂为与水完全混溶或部分混溶的溶剂，例如二甲基亚砜、DMF、丙酮、乙腈、醇(例如乙醇或异丙醇)或醚(例如THF或MTBE)。根据本发明的另一个方面，所述有机溶剂不与水混溶，例如烃类，如庚烷或辛烷。水溶液优选为pH约为7的缓冲液。根据本发明的一个方面，所述过度表达腈水解酶的细菌可以直接在工艺过程中使用，以细菌浆液或冻干物的形式使用。在细菌浆液的情况下，所述E/S比例优选自1/1至1/10，在冻干物的情况下，该比例优选为1/10－1/20。根据本发明的另一个方面，所述腈水解酶以纯化酶的形式使用。本发明的酶水解模式如下：方便的话，构型为(R)的腈(副反应产物)可以通过有机碱(例如DBU)或无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾或碳酸钠)的作用从而再循环到酶水解过程中。当外消旋步骤在位进行时，本发明的方法为动态动力学拆分(DKR)方法，它使得获得的式(I)的S酸的ee大于98%成为可能。优选在一或多个酶水解循环后，将式(I)酸从反应介质中分离。定义光学纯的化合物应当是指对映体过量百分数大于或等于90%的化合物。非光学纯的腈应当是指对映体过量百分数小于90%的腈。外消旋的腈应当是指比例为55:45－45:55的两种对映体的混合物形式的腈。外消旋的或非光学纯的腈的对映选择性水解应当是指所述对映体混合物中的一种优先水解。活性生物学系统应当是指其基因物质通过基因重组修饰后使其能够产生目标重组蛋白的生物学种属(宿主细胞)。为此目的而构建的表达载体(质粒)可以使得该目标基因的DNA编码可以转移到宿主细胞中，从而可以有效地(过度)表达功能蛋白。本发明的另一方面涉及以仅有两个步骤的方法合成式(III)化合物的方法，该方法采用光学纯的式(I)的酸作为原料，将其转化为光学纯的式(XI)的酰胺：将其优选通过BH3、NaBH4或LiAlH4还原，获得式(III)化合物，随后将式(III)化合物与式(XII)化合物进行偶合：其中X代表卤素原子，优选碘原子，或者，在还原剂存在下，将其与式(XIII)化合物进行还原胺化反应：其中R2代表选自CHO和CHR3R4的基团，其中R3和R4每一个均代表直链或支链(C1-C6)烷氧基，或者与携带它们的碳一起形成1,3-二氧六环、1,3-二氧戊环或1,3-二氧庚环，获得伊伐布雷定，然后将其转化为药学上可接受的酸的加成盐，所述盐为无水或水合物形式。在还原胺化反应中，式(III)化合物也可以以其药学上可接受的酸的加成盐形式使用，优选其盐酸盐。在此情况下，伊伐布雷定可以直接以盐酸盐的形式获得。在药学上可接受的酸中，可以不加限定提及的是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、抗坏血酸、草酸、甲磺酸、苯磺酸和樟脑酸。在式(III)化合物与式(XIII)化合物的还原胺化反应中使用的还原剂中，可以不加限定提及的是氢化物供体化合物(例如三乙酰基氧硼氢化钠或氰基硼氢化钠)和在催化剂存在下的氢，所述催化剂例如钯、铂、镍、钌、铑或其化合物，特别是它们负载在载体上或者氧化物形式。优选的用于式(III)化合物与式(XIII)化合物的还原胺化反应中的还原剂为钯炭催化的氢。附图说明附图1说明采用过度表达的玫瑰色红球菌的腈水解酶进行的腈的酶水解6小时后的手性-相HPLC色谱附图2说明采用NIT115进行的腈的酶水解5小时后的HPLC色谱具体的实施方式下面的实施例用于举例说明本发明。缩写TFA三氟乙酸TLC薄层色谱DBU二氮杂双环十一碳烯DKR动态动力学拆分DMF二甲基甲酰胺DMSO二甲基亚砜OD光密度E对映选择性系数ee对映体过量百分数eq摩尔当量HPLC高效液相色谱IPTG异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖酐LB溶源性肉汤培养基MeOH甲醇MTBE甲基叔-丁基醚op光学或对映体纯E/S比例酶/底物的比例，表示为g/gNMR核磁共振(光谱)MS质谱THF四氢呋喃TMS四甲基硅烷实施例1：(7S)-3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酸腈水解酶的过度表达：玫瑰色红球菌NCIMB11216的腈水解酶蛋白描述于蛋白和基因组数据库。寻找基因(soughtgene)序列列示于EMBL-数据库的ENA(欧洲核苷酸档案)中的标识(identifier)SVA(序列版本档案)“EF467367”项下。该序列与UniProtKB/TrEMBL数据库中对照“A4LA85”一致。采用生产菌株E.coliBL21(DE3)，通过表达载体pET28a-Nit1转化。腈水解酶过度表达方案描述于AppliedBiochemistryandBiotechnology2010(应用生物化学和生物技术2010),Vol160(2),第393－400页。由此转化的细胞可以直接以细菌浆液的形式使用，或者在使用前为冻干形式。采用过度表达的腈水解酶进行的酶水解将根据上述方案转化的细胞以5.6×109个细胞/mL(OD=1(600nm)的1mL培养基，相当于1×109个细菌和约10mg的细菌浆液或1.5mg的冻干物)的浓度搅拌。向250mL的磷酸盐缓冲液KH2PO4/Na2HPO41/15M(pH7)中加入1g的E.coli冻干物和500mg(c=2g/L,10mM)的3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈的2%的DMSO(5mL)溶液。将反应混合物保持在30℃，以220rpm的速度旋转搅拌6小时。在使得待测定的酸和腈对映体过量条件下，通过手性-相HPLC监测反应：ChiralpakIB柱90%正-己烷10%2-PrOH+0.1%TFA1mL/min，30℃，288nm%腈ee(腈)%酸ee(酸)转化率E6小时49.99450.1970.49>100*对映选择性系数E=ln[1-c(1+ee(酸))]/ln[1-c(1-ee(酸))]6小时后手性-相HPLC色谱如图1所示。反应6小时后，反应混合物采用1MHCl进行酸化从而获得高酸性pH(pH2)，然后采用2×100mL二氯甲烷萃取。吸出有机相。采用甲苯(2×100mL)二次萃取，使得能够回收水相中保留的所有产物。有机相采用饱和的NaCl溶液洗涤，然后经无水硫酸镁干燥。蒸发溶剂后，获得粗品产物，将其经快速色谱在硅胶柱上于下列条件下纯化：柱型：80gSiOHMacherey-Nagel材料和方法：洗脱液：等度洗脱(环己烷+1%乙酸/乙酸乙酯+1%乙酸75/25)检测：UV288nm流速：60ml/min结果：腈(R):收率36%(179mg)，ee(R)：96%酸(S):收率39%(246mg)，ee(S)：96%实施例2：通过(R)腈的外消旋化反应制备3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈将100mg的(R)-(3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基)腈(0.53mmol)、5mL异丙醇和121mg的DBU(1.5eq.)转移至配备冷凝器和磁力搅拌器的烧瓶中。于65℃加热2小时，然后使其冷却至室温。过滤后获得目标化合物。实施例3：(7S)-3,4-二甲氧基-N-甲基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酰胺于室温下，将实施例1中获得的(7S)-3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酸(300mg)悬浮于THF(3ml)，然后加入三乙胺(200μl)。向该混合物中缓慢加入氯代甲酸乙酯(150μl)。反应混合物沉淀(混合物I)。在另一个烧瓶中，将甲基胺的2MTHF溶液(2.25ml)与水(1ml)和三乙胺(300μl)一起搅拌。搅拌持续20分钟，然后将获得的混合物加至混合物I中，于室温下搅拌过夜。然后蒸发反应混合物，经制备性HPLC纯化。获得(7S)-3,4-二甲氧基-N-甲基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酰胺，收率为60%。1HNMR(DMSO-d6,ppm/TMS)=2.61(m;3H);3.16(m;2H);3.71(s;6H);4.05(m;1H);6.78(s;1H);6.81(s;1H);7.78(brs;1H)。实施例4：(7S)-3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基]N-甲基甲胺将实施例3中获得的(7S)-3,4-二甲氧基-N-甲基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酰胺(450mg)悬浮于四氢呋喃(20mL)，然后于室温下向该反应混合物中缓慢加入1.6mL的2MLiAlH4的四氢呋喃溶液。观察到明显的气体溢出，反应混合物变得澄清。将反应混合物于回流下加热30分钟。冷却至室温后，水解并用乙酸乙酯萃取。经硫酸镁干燥，然后蒸发。获得的残留物经制备性HPLC纯化(洗脱液：水/乙腈/三氟乙酸，98/2/0.2－20/80/0.2)30分钟，得到目标产物，收率为46%。1HNMR(DMSO-d6,ppm/TMS)=2.60(m;3H);2.85(m;1H);3.15(m;1H);3.25(dd;1H);3.30(m;1H);3.62(m;1H);3.70(s;6H);6.82(s;1H);6.89(s;1H);8.48(brs;1H)。实施例5：(7S)-3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基]N-甲基甲胺盐酸盐于室温下，向实施例3中获得的2.2g(10mmol)(7S)-3,4-二甲氧基-N-甲基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酰胺的45mL四氢呋喃溶液混合物中加入20mL的BH3的四氢呋喃摩尔溶液。搅拌1小时后，加入10mL的BH3的四氢呋喃溶液。于室温下搅拌过夜后，滴加20mL乙醇，搅拌混合物直到没有气体溢出(约1小时)。然后滴加20mL盐酸的乙醇溶液。搅拌4小时后，过滤获得的沉淀物(1.2g目标产物)。浓缩滤液，将其置于乙酸乙酯/乙醇的80/20混合物中固化，获得0.65g目标产物。合并两个沉淀物，获得1.85g目标产物(收率：77%)。实施例6：伊伐布雷定盐酸盐将5.5kg的3-[2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基]-7,8-二甲氧基-1,3-二氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮、27.5升乙醇和550g钯炭置于高压釜中。充入氮气，然后充入氢气，于55℃加热，然后于此温度下、在5bars压力下氢化直到理论量的氢被吸收。然后将其冷却至室温并对高压釜减压。再加入4kg的(7S)-3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基]N-甲基甲胺盐酸盐、11升乙醇、5.5升水和1kg钯炭。充入氮气，然后充入氢气，加热至85℃，然后于此温度下、在30bars压力下氢化直到理论量的氢被吸收。然后再次冷却至室温，清空高压釜，随后过滤反应混合物；滤除溶剂，然后通过通过在甲苯/1-甲基-2-吡咯烷酮混合物中结晶分离伊伐布雷定盐酸盐。由此获得伊伐布雷定盐酸盐，收率为85%，化学纯度大于99%。比较实施例A：筛选商业用腈水解酶，用于3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈的酶水解称重待研究的腈水解酶(15mg)，为冻干物形式，将其置于试管中，然后加入4mL的0.1MKH2PO4缓冲液(pH=7)和溶于100μlDMSO中的3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈(20mg)。置于28℃和220rpm的培养箱中。24小时和72小时后通过HPLC测定转化率。24小时后腈水解酶NIT101、NIT102、NIT103、NIT104、NIT105、NIT106、NIT108、NIT109、NIT111、NIT112和NIT113(Almac)没有水解该腈(没有形成酸或酰胺)。采用腈水解酶NIT107、NIT110、NIT114和NIT115(Almac)获得的结果如下表所示：分析条件：PhenomenexLUNAHST50*3柱C18(2)2.5μm0%－100%B洗脱8分钟，流速0.8ml/min，40℃A(1000水+25ACN+1TFA)B(1000ACN+25水+1TFA)然后在另一个研究中采用腈水解酶NIT115以测定腈的水解是否为对映选择性的。腈水解酶NIT115(12mg;Almac)在6mL[2mg/mL]缓冲液中使用。加入3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈使得其终浓度达到4mg/mL。采用下列分析条件通过HPLC测定对映选择性：ChiralpakIC250*4.6柱30%无水乙醇+0.1%TFA+70%庚烷+0.1%TFA1ml/min，30℃，288nm注意：在这些条件下分离酸的对映体而非腈的对映体。反应5小时后获得的色谱如图2所示。结论：没有观察到对映选择性。比较实施例B：筛选用于3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈的酶水解的细菌菌株和真菌菌株的腈水解酶采用多种细菌诱导物(丙腈、苄腈、4-溴苄腈)进行的研究显示，丙腈对于腈水解酶对3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈的活性提供了最好的诱导。采用72mM的丙腈对细菌菌株诱导72小时，将细胞置于50mL(两次浓缩，浓度为每毫升10mg的细胞)的0.1M磷酸盐缓冲液KH2PO4/K2HPO4(pH=7.3)中，加入溶于2%的DMSOv/v最终的浓度为10mM的3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈。真菌菌株采用戊腈诱导。在细菌情况下，所有反应混合物均于30℃以220rpm的转速搅拌，在真菌情况下，于27℃搅拌，根据下述方法通过反相HPLC和手性-相HPLC监测96小时：反相分析：PhenomenexLUNAHST50*3柱，C18(2)2.5μm0%B－100%B洗脱8mins，0.8ml/min，40℃A(1000水+25ACN+1TFA)B(1000ACN+25水+1TFA)手性-相分析：ChiralpakIC250*4.6柱30%无水乙醇+0.1%TFA+70%庚烷+0.1%TFA1ml/min，30℃，288nm获得的结果列示于下表：比较实施例C：采用过度表达的玫瑰色红球菌NCIMB11216的腈水解酶的双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈的酶水解在LB+琼脂+卡那霉素上涂板，于37℃静态温育24小时(重组E.coli的腈水解酶的株11216)。在5ml的LB+卡那霉素(50mg/l)中预培养，于37℃以180rpm培养过夜。培养：将50ml的LB和500μl的预培养物转移至无挡板的250ml锥形瓶中，于28℃、160rpm培养直到OD等于0.6(即约4小时)。采用IPTG(0.5mM)诱导，于17℃、160rpm培养过夜(17小时)。活性试验：将培养物于4℃、6000rpm离心20分钟，将浆液再悬浮于10ml的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7)中。加入双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲腈(10mM)+2%乙醇。以220rpm于30℃培养。注意：如果离心时培养物多于50mL，则采用50mL培养物的浆液进行活性试验。通过手性色谱于45分钟和2小时监测水解。柱：LUNAHST50*3C18(2)2.5μm洗脱液：A+B(0%－100%B，8mins)A：1000水+25ACN+1TFAB：1000ACN+25水+1TFA0.8ml/min-40℃-UV210nm结果：时间腈羧酸45分钟50%50%2小时0%100%通过手性色谱监测显示该反应不是对映选择性的。