本发明涉及一种用于评价待测者食管癌遗传风险性的试剂盒。
背景技术：
食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2％。全世界每年约有20万人死于食管癌，我国是食管癌高发区，因食管癌死亡者仅次于胃癌居第二位，发病年龄多在40岁以上，男性多于女性，但近年来40岁以下发病者有增长趋势。食管癌的发生与亚硝胺慢性刺激、炎症与创伤，遗传因素以及饮水、粮食和蔬菜中的微量元素含量有关。
基因测序是一种新型基因检测技术，能够从血液或唾液中分析测定基因全序列，预测罹患多种疾病的可能性，从而实现提前预防和治疗。
中国专利申请200810039260.4提供了一种检测食管癌遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测细胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)、细胞色素P450 2E1基因(CYP2E1)、谷胱甘肽硫转移酶M1基因(GSTM1)、5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、还原型辅酶I醌类氧化还原酶基因(NQ01)、肿瘤蛋白53基因(P53)、X射线交错互补修复基因1(XRCC1)、着色性干皮病互补组A基因(XPA)上的单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件、PCR反应组件等。
上述技术方案的缺陷在于，相关基因的独立性差，存在连锁不平衡。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于评价待测者食管癌遗传风险性的试剂盒，以及其检测结果的评估方法。
为实现上述目的，一方面，本发明提供一种用于评价待测者食管癌遗传风险性的试剂盒，该试剂盒包括：
针对单核苷酸多态性位点rs2014300的引物，以及
针对单核苷酸多态性位点rs2074356的引物。
本发明的试剂盒通过检测与食管癌发生密切相关的单核苷酸多态性位点，来评估受试者食管癌患病风险级别，并最终根据每个受试者的基因检测结果，从基因层面指导受试者有针对性地预防和早期诊断食管癌，降低食管癌的发病率，进行早期治疗，提高生存率。
本发明所选取的单核苷酸多态性位点在亚洲人群中具有显著相关性，并且彼此独立，不存在连锁不平衡，因此本发明的位点选择具有代表性、独立性和风险值可积累性。
根据本发明另一具体实施方式，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位点rs1229984的引物。
根据本发明另一具体实施方式，针对单核苷酸多态性位点rs2014300的引物包括：
rs2014300上游引物：TCACCATGAAGACGGCAA(SEQ ID NO:25)；
rs2014300下游引物：CATTCATAACAGTCCCTGTCTG(SEQ ID NO:26)。
根据本发明另一具体实施方式，针对单核苷酸多态性位点rs2074356的引物包括：
rs2074356上游引物：TCAGGAGAGACTCATCTAATG(SEQ ID NO:27)；
rs2074356下游引物：ATCAGGGAACAGTGAGAGAC(SEQ ID NO:28)。
根据本发明另一具体实施方式，针对单核苷酸多态性位点rs1229984的引物包括：
rs1229984上游引物：GGAATAGTAGGGATTAGTAGC(SEQ ID NO:29)；
rs1229984下游引物：AAATCCTGGATGGTGAAC(SEQ ID NO:30)。
根据本发明另一具体实施方式，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物包括，例如， rs738722上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG(SEQ ID NO:1)；rs738722下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG(SEQ ID NO:2)。
根据本发明另一具体实施方式，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位点rs10058728的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs10058728的引物包括，例如，rs10058728上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT(SEQ ID NO:3)；rs10058728下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT(SEQ ID NO:4)。
根据本发明另一具体实施方式，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位点rs9288520的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs9288520的引物包括，例如，rs9288520上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC(SEQ ID NO:5)；rs9288520下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC(SEQ ID NO:6)。
根据本发明另一具体实施方式，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位点rs17761864的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs17761864的引物包括，例如，rs17761864上游引物：AGGCATGTGCTACTGTGT(SEQ ID NO:7)；rs17761864下游引物：CACCCAATATTTTCTTTAGACT(SEQ ID NO:8)。
根据本发明另一具体实施方式，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位点rs2847281的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs2847281的引物包括，例如，rs2847281上游引物：TGGTCCTTGCCTCCTTGT(SEQ ID NO:9)；rs2847281下游引物：TCATTGGGTATTTCCTCTACAC(SEQ ID NO:10)。
根据本发明另一具体实施方式，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位点rs6503659的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs8030672的引物包括，例如，rs8030672上游引物：CGTCAAAGTGCAGAAATCAG(SEQ ID NO:11)；rs8030672下游引物：CAGCTCAGAACTCAGAGACTC(SEQ ID NO:12)。
根据本发明另一具体实施方式，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位点rs10484761的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs10484761的引物包括，例如，rs10484761上游引物：TGCAACGCTGTTAGAAGT(SEQ ID NO:13)；rs10484761下游引物：TCTTGTCTCTATTCACTATTCC(SEQ ID NO:14)。
根据本发明另一具体实施方式，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs2239612的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs2239612的引物包括，例如，rs2239612上游引物：TGGTCACACAGCGTCATCAT(SEQ ID NO:15)；rs2239612下游引物：CATTGGCTGATTGATGGAGT(SEQ ID NO:16)。
根据本发明另一具体实施方式，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位点rs6503659的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs6503659的引物包括，例如，rs6503659上游引物：GCTCACTGGGTTTGCTTC(SEQ ID NO:17)；rs6503659下游引物：CAAGGCAGGCTCAGATACTA(SEQ ID NO:18)。
根据本发明另一具体实施方式，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位点rs10052657的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs10052657的引物包括，例如，rs10052657上游引物：AAGGCTCTTAATGGGAAACC(SEQ ID NO:19)；rs10052657下游引物：ATGCATCGCACATTAATACC(SEQ ID NO:20)。
根据本发明另一具体实施方式，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位点rs2274223的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs2274223的引物包括，例如，rs2274223上游引物：GGTGACTTTGATCCCTTTTG(SEQ ID NO:21)；rs2274223下游引物：CATCCATCACCTAGCTACAAC(SEQ ID NO:22)。
根据本发明另一具体实施方式，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位点rs4785204的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs4785204的引物包括，例如，rs4785204上游引物：TTCAGTAGTACCTGGATTGA(SEQ ID NO:23)；rs4785204下游引物：GATGAAATAAGAGCTTCTACC(SEQ ID NO:24)。
根据本发明另一具体实施方式，试剂盒的组分和含量包括：PCR反应体系、PCR产物纯化体系、测序反应体系。其中，前述引物属于PCR反应体系；PCR产物纯化体系用于PCR扩增产物纯化；测序反应体系用于DNA测序，进而确定单核苷酸多态性位点的基因型。例如，PCR反应体系包括10×PCR反应缓冲液2.5ul；25mM dNTP混合液0.2ul；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul；20uM引物对，每条引物0.25ul；ddH2O 19.175ul。例如，PCR产物纯化体系包括：1U/ul SAP酶0.75ul；10U/ul ExoI酶0.375ul；ddH2O 3.875ul。例如，测序反应体系包括：25％BigDye mix lul；3.2uM DNA测序引物1ul；125mM EDTA溶液1ul；100％ 乙醇溶液15ul；70％乙醇溶液30ul；HIDI溶液8ul；ddH202ul。值得注意的是，这里的DNA测序引物可为现有技术已公开或披露的多种引物，在此不再赘述。
另一方面，本发明提供了上述试剂盒的检测结果的评估方法，其包括如下步骤：
A、将单核苷酸多态性位点rs2014300、rs2074356、rs1229984的不同基因型进行风险度赋值；
B、提取受检者的DNA；
C、使用以下引物对进行PCR扩增反应：
(1)rs2014300上游引物：TCACCATGAAGACGGCAA；
rs2014300下游引物：CATTCATAACAGTCCCTGTCTG；
(2)rs2074356上游引物：TCAGGAGAGACTCATCTAATG；
rs2074356下游引物：ATCAGGGAACAGTGAGAGAC；
(3)rs1229984上游引物：GGAATAGTAGGGATTAGTAGC；
rs1229984下游引物：AAATCCTGGATGGTGAAC；
D、PCR扩增产物纯化；
E、DNA测序，确定单核苷酸多态性位点rs2014300、rs2074356、rs1229984的基因型；
F、根据步骤A，确定步骤E所测得的单核苷酸多态性位点rs2014300、rs2074356、rs1229984的基因型的风险值Risk(rs2014300)、Risk(rs2074356)、Risk(rs1229984)；
G、根据步骤F得到的三个风险值Risk(rs2014300)、Risk(rs2074356)、Risk(rs1229984)判断受检者的风险级别。
进一步地，步骤G具体包括如下步骤：
G1、计算三个单核苷酸多态性位点的总风险值R，计算公式为
总风险值R＝Risk(rs2014300)×Risk(rs2074356)×Risk(rs1229984)；
G2、根据如下标准判断风险级别：
总风险值R<0.74 风险较低
0.74≤总风险值R≤1.67 风险一般
总风险值R>1.67 风险较高。
本发明所采用的方法是口腔粘膜细胞采样，无痛、无创、避免交叉感染。检测方法简单，检测结果准确、可靠，方法易普及、推广。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明所选取的单核苷酸多态性位点在亚洲人群中具有显著相关性，并且彼此独立、不存在连锁不平衡，因此本发明的位点选择具有代表性、独立性和风险值可积累性。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种用于评价待测者食管癌遗传风险性的试剂盒，该试剂盒包括：PCR反应体系、PCR产物纯化体系、测序反应体系。
其中，PCR反应体系包括如下引物：
(1)针对单核苷酸多态性位点rs2014300的引物：
rs2014300上游引物：TCACCATGAAGACGGCAA(SEQ ID NO:25)；
rs2014300下游引物：CATTCATAACAGTCCCTGTCTG(SEQ ID NO:26)；
(2)针对单核苷酸多态性位点rs2074356的引物：
rs2074356上游引物：TCAGGAGAGACTCATCTAATG(SEQ ID NO:27)；
rs2074356下游引物：ATCAGGGAACAGTGAGAGAC(SEQ ID NO:28)；
(3)针对单核苷酸多态性位点rs1229984的引物：
rs1229984上游引物：GGAATAGTAGGGATTAGTAGC(SEQ ID NO:29)；
rs1229984下游引物：AAATCCTGGATGGTGAAC(SEQ ID NO:30)。
PCR反应体系进一步包括10×PCR反应缓冲液2.5ul；25mM dNTP混合液0.2ul；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul；20uM引物对，每条引物0.25ul；ddH2O19.175ul。
PCR产物纯化体系用于PCR扩增产物纯化，其包括：1U/ul SAP酶0.75ul； 10U/ul ExoI酶0.375ul；ddH2O 3.875ul。
测序反应体系用于DNA测序，进而确定单核苷酸多态性位点的基因型，其包括：25％BigDye mix lul；3.2uM DNA测序引物1ul；125mM EDTA溶液1ul；100％乙醇溶液15ul；70％乙醇溶液30ul；HIDI溶液8ul；ddH202ul。
本实施例试剂盒的检测结果的评估方法包括如下步骤：
A、将单核苷酸多态性位点rs2014300、rs2074356、rs1229984的不同基因型进行风险度赋值；具体风险值如表1所示，
表1
B、提取受检者的DNA；
C、使用以下引物对进行PCR扩增反应：
(1)rs2014300上游引物：TCACCATGAAGACGGCAA；
rs2014300下游引物：CATTCATAACAGTCCCTGTCTG；
(2)rs2074356上游引物：TCAGGAGAGACTCATCTAATG；
rs2074356下游引物：ATCAGGGAACAGTGAGAGAC；
(3)rs1229984上游引物：GGAATAGTAGGGATTAGTAGC；
rs1229984下游引物：AAATCCTGGATGGTGAAC；
D、PCR扩增产物纯化；
E、DNA测序，确定单核苷酸多态性位点rs2014300、rs2074356、rs1229984的基因型；
F、根据步骤A，确定步骤E所测得的单核苷酸多态性位点rs2014300、rs2074356、rs1229984的基因型的风险值Risk(rs2014300)、Risk(rs2074356)、Risk(rs1229984)；
G、根据步骤F得到的三个风险值Risk(rs2014300)、Risk(rs2074356)、 Risk(rs1229984)判断受检者的风险级别。
步骤G具体包括如下步骤：
G1、计算三个单核苷酸多态性位点的总风险值R，计算公式为
总风险值R＝Risk(rs2014300)×Risk(rs2074356)×Risk(rs1229984)；
G2、根据如下标准判断风险级别：
总风险值R<0.74 风险较低
0.74≤总风险值R≤1.67 风险一般
总风险值R>1.67 风险较高。
按照上述方法采集五个样本，每个样本各个位点的基因型及风险值、总风险值、风险级别如表2所示，
表2
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，PCR反应体系包括如下引物，
(1)针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物：
rs738722上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG(SEQ ID NO:1)；
rs738722下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG(SEQ ID NO:2)；
(2)针对单核苷酸多态性位点rs10058728的引物：
rs10058728上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT(SEQ ID NO:3)；
rs10058728下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT(SEQ ID NO:4)；
(3)针对单核苷酸多态性位点rs9288520的引物：
rs9288520上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC(SEQ ID NO:5)；
rs9288520下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC(SEQ ID NO:6)；
(4)针对单核苷酸多态性位点rs17761864的引物：
rs17761864上游引物：AGGCATGTGCTACTGTGT(SEQ ID NO:7)；
rs17761864下游引物：CACCCAATATTTTCTTTAGACT(SEQ ID NO:8)；
(5)针对单核苷酸多态性位点rs2847281的引物：
rs2847281上游引物：TGGTCCTTGCCTCCTTGT(SEQ ID NO:9)；
rs2847281下游引物：TCATTGGGTATTTCCTCTACAC(SEQ ID NO:10)；
(6)针对单核苷酸多态性位点rs8030672的引物：
rs8030672上游引物：CGTCAAAGTGCAGAAATCAG(SEQ ID NO:11)；
rs8030672下游引物：CAGCTCAGAACTCAGAGACTC(SEQ ID NO:12)；
(7)针对单核苷酸多态性位点rs10484761的引物：
rs10484761上游引物：TGCAACGCTGTTAGAAGT(SEQ ID NO:13)；
rs10484761下游引物：TCTTGTCTCTATTCACTATTCC(SEQ ID NO:14)；
(8)针对单核苷酸多态性位点rs2239612的引物：
rs2239612上游引物：TGGTCACACAGCGTCATCAT(SEQ ID NO:15)；
rs2239612下游引物：CATTGGCTGATTGATGGAGT(SEQ ID NO:16)；
(9)针对单核苷酸多态性位点rs6503659的引物：
rs6503659上游引物：GCTCACTGGGTTTGCTTC(SEQ ID NO:17)；
rs6503659下游引物：CAAGGCAGGCTCAGATACTA(SEQ ID NO:18)；
(10)针对单核苷酸多态性位点rs10052657的引物：
rs10052657上游引物：AAGGCTCTTAATGGGAAACC(SEQ ID NO:19)；
rs10052657下游引物：ATGCATCGCACATTAATACC(SEQ ID NO:20)；
(11)针对单核苷酸多态性位点rs2274223的引物：
rs2274223上游引物：GGTGACTTTGATCCCTTTTG(SEQ ID NO:21)；
rs2274223下游引物：CATCCATCACCTAGCTACAAC(SEQ ID NO:22)；
(12)针对单核苷酸多态性位点rs4785204的引物：
rs4785204上游引物：TTCAGTAGTACCTGGATTGA(SEQ ID NO:23)；
rs4785204下游引物：GATGAAATAAGAGCTTCTACC(SEQ ID NO:24)；
(13)针对单核苷酸多态性位点rs2014300的引物：
rs2014300上游引物：TCACCATGAAGACGGCAA(SEQ ID NO:25)；
rs2014300下游引物：CATTCATAACAGTCCCTGTCTG(SEQ ID NO:26)；
(14)针对单核苷酸多态性位点rs2074356的引物：
rs2074356上游引物：TCAGGAGAGACTCATCTAATG(SEQ ID NO:27)；
rs2074356下游引物：ATCAGGGAACAGTGAGAGAC(SEQ ID NO:28)；
(15)针对单核苷酸多态性位点rs1229984的引物：
rs1229984上游引物：GGAATAGTAGGGATTAGTAGC(SEQ ID NO:29)；
rs1229984下游引物：AAATCCTGGATGGTGAAC(SEQ ID NO:30)。
本实施例试剂盒的检测结果的评估方法包括如下步骤：
A、将每个单核苷酸多态性位点的不同基因型进行风险度赋值，具体风险值如表3所示；
表3
B、提取受检者的DNA；
C、使用以下引物对进行PCR扩增反应：
(1)rs738722上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG(SEQ ID NO:1)；
rs738722下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG(SEQ ID NO:2)；
(2)rs10058728上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT(SEQ ID NO:3)；
rs10058728下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT(SEQ ID NO:4)；
(3)rs9288520上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC(SEQ ID NO:5)；
rs9288520下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC(SEQ ID NO:6)；
(4)rs17761864上游引物：AGGCATGTGCTACTGTGT(SEQ ID NO:7)；
rs17761864下游引物：CACCCAATATTTTCTTTAGACT(SEQ ID NO:8)；
(5)rs2847281上游引物：TGGTCCTTGCCTCCTTGT(SEQ ID NO:9)；
rs2847281下游引物：TCATTGGGTATTTCCTCTACAC(SEQ ID NO:10)；
(6)rs8030672上游引物：CGTCAAAGTGCAGAAATCAG(SEQ ID NO:11)；
rs8030672下游引物：CAGCTCAGAACTCAGAGACTC(SEQ ID NO:12)；
(7)rs10484761上游引物：TGCAACGCTGTTAGAAGT(SEQ ID NO:13)；
rs10484761下游引物：TCTTGTCTCTATTCACTATTCC(SEQ ID NO:14)；
(8)rs2239612上游引物：TGGTCACACAGCGTCATCAT(SEQ ID NO:15)；
rs2239612下游引物：CATTGGCTGATTGATGGAGT(SEQ ID NO:16)；
(9)rs6503659上游引物：GCTCACTGGGTTTGCTTC(SEQ ID NO:17)；
rs6503659下游引物：CAAGGCAGGCTCAGATACTA(SEQ ID NO:18)；
(10)rs10052657上游引物：AAGGCTCTTAATGGGAAACC(SEQ ID NO:19)；
rs10052657下游引物：ATGCATCGCACATTAATACC(SEQ ID NO:20)；
(11)rs2274223上游引物：GGTGACTTTGATCCCTTTTG(SEQ ID NO:21)；
rs2274223下游引物：CATCCATCACCTAGCTACAAC(SEQ ID NO:22)；
(12)rs4785204上游引物：TTCAGTAGTACCTGGATTGA(SEQ ID NO:23)；
rs4785204下游引物：GATGAAATAAGAGCTTCTACC(SEQ ID NO:24)；
(13)rs2014300上游引物：TCACCATGAAGACGGCAA(SEQ ID NO:25)；
rs2014300下游引物：CATTCATAACAGTCCCTGTCTG(SEQ ID NO:26)；
(14)rs2074356上游引物：TCAGGAGAGACTCATCTAATG(SEQ ID NO:27)；
rs2074356下游引物：ATCAGGGAACAGTGAGAGAC(SEQ ID NO:28)；
(15)rs1229984上游引物：GGAATAGTAGGGATTAGTAGC(SEQ ID NO:29)；
rs1229984下游引物：AAATCCTGGATGGTGAAC(SEQ ID NO:30)。
D、PCR扩增产物纯化；
E、DNA测序，确定十五个单核苷酸多态性位点的基因型；
F、根据步骤A，确定步骤E所测得的十五个单核苷酸多态性位点的基因型的风险值Risk(rs738722)、Risk(rs10058728)、Risk(rs9288520)、Risk(rs17761864)、Risk(rs2847281)、Risk(rs8030672)、Risk(rs10484761)、Risk(rs2239612)、Risk(rs6503659)、Risk(rs10052657)、Risk(rs2274223)、Risk(rs4785204)、Risk(rs2014300)、Risk(rs2074356)、Risk(rs1229984)；
G、根据步骤F得到的十五个风险值判断受检者的风险级别，其具体包括如下步骤：
G1、计算十五个单核苷酸多态性位点的总风险值R，计算公式为
总风险值R＝Risk(rs738722)×Risk(rs10058728)×Risk(rs9288520)×Risk(rs17761864)×Risk(rs2847281)×Risk(rs8030672)×Risk(rs10484761)×Risk(rs2239612)×Risk(rs6503659)×Risk(rs10052657)×Risk(rs2274223)×Risk(rs4785204)×Risk(rs2014300)×Risk(rs2074356)×Risk(rs1229984)；
G2、根据如下标准判断风险级别：
总风险值R<0.57 风险较低
0.57≤总风险值R≤1.74 风险一般
总风险值R>1.74 风险较高。
按照上述方法采集五个样本，每个样本各个位点的基因型及风险值、总风险值、风险级别如表4所示，
表4
虽然本发明以较佳实施例揭露如上，但并非用以限定本发明实施的范围。任何本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的发明范围内，当可作些许的改进，即凡是依照本发明所做的同等改进，应为本发明的范围所涵盖。