一种耐草甘膦转基因陆地棉BG2-7的检测方法及侧翼序列与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种耐草甘膦转基因陆地棉BG2-7的检测方法及侧翼序列。

背景技术：

我国是棉花生产大国，年种植棉花面积约470万公顷，年产皮棉500万吨，占世界产棉总量的25％左右。棉花生产的兴衰对我国经济的发展具有举足轻重的影响。然而，中国棉田生态型复杂，杂草危害较重，尤其是长江流域棉区，生长前期正值梅雨季节，杂草生长旺盛，加之阴雨连绵，不能及时除草，杂草危害极其严重，可造成14.0％-16.0％的损失，严重制约了棉花的优质、高效生产(马小艳,马艳,彭军等.我国棉田杂草研究现状与发展趋势.棉花学报,2010,22(4):372-380)。转基因抗除草剂棉花的培育对于稳定棉花生产有着举足轻重的作用。

草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，具有高效、广谱、低毒、低残留、不破坏土壤环境、对大多数植物具有灭生性等其它除草剂所不可比拟的优点，广泛用于果园、胶园、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后处理。草甘膦是植物体内5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshiki-mate-3-phosate，EPSP)的一种类似物，它的毒性机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)合成EPSP，从而抑制EPSP合酶的活性导致分枝酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，从而扰乱了生物体正常的氮代谢而使其死亡(McDowell LM,Klug CA,Beusen DD.Ligand geometry of the ternary complex of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from rotational-echo double-resonance NMR.Biochem,1996,35(17):5395-5403；Sammons RD,Gruys KJ,Anderson KS et al.Reevaluating glyphosate as a transition-state inhibitor of EPSP synthase:identification of an EPSP synthase.EPSP.glyphosate ternary complex.Biochem,1995,34(19):6433-6440)。

基于草甘膦的毒性机理，研究者们通过三种途径获得了抗除草剂的转基因植物。一是EPSPS基因发生突变，产生与草甘膦亲和性较低的EPSPS，突变后的EPSPS不能很好的甚至根本不能与草甘膦结合，从而使草甘膦丧失了对EPSPS的竞争性抑制作用。Comai等首先从鼠伤寒沙门氏菌中筛选出了抗草甘膦的突变菌株，随后分离突变基因-aroA基因，此突变aroA基因转入大肠杆菌获得了抗草甘膦表型(Comai L,Facciotti D,Hiattl WR et al.Expression in plants of a mutant aro A gene from Salmonella typhimurium Confers tolerance to glyphosate.Nature,1985,(317):741-744；Comai L,Sen LC,stalker DM.An altered aroA gene product confers resistance to the herbicide glyphosate.Sci,1983,(221):270-271)。其后，Duncan等克隆了抗草甘膦诱变的矮牵牛、土豆、拟南芥、大豆、油菜和大肠杆菌K-12的EPSP合酶基因(Duncan K,Coggins JR.The Serc aroA operon of Escherichia Coli.Biochem J,1986,(234):49-57；Duncan K,Lewendon A,Coggins JR.Mutant EPSP Synthase genes from tomato,Arabidopsis thaliana,Brassica napus,Glycine max E.Coli K12Confer folerance to glyphosate.FEBS lett,1984,(170):59-63)。二是过量表达产生具有较高酶活性的EPSP合酶：对百脉根属9个草甘膦耐药性水平不同的无性系植株(营养体无性系)草甘膦茎叶处理后药液的滞留、吸收、输导以及耐药性水平与EPSP合酶活性关系进行研究的结果表明，它们在药剂的滞留、吸收、输导等方面无明显差异，而EPSP合酶的活性与无性系对草甘膦的耐药性呈正相关(Boerboom CM,Wyse DL,Somers DA.Mechanism of glyphosate tolerance in birdsfoot trefoil(Lotus corniculatus L).Weed Sci,1990,38:463–467)。Shah等培育并筛选出了具有对草甘膦抗性的矮牵牛细胞系MP4-G，MP4-G细胞系中的EPSP合酶基因由于扩增了20倍，过量产生EPSP合酶的mRNA，从而能超量产生EPSP合酶(Shah DM,Horsch RB,Klee HJ.Engineering Herbicide Tolerance in Transgenic plants.Sci,1986,(233)：478-491)。1987年，Mollenhauer等用35S启动子驱动MP4-G细胞系中的EPSP合酶基因的表达，并用农杆菌介导法转化矮牵牛。结果发现转化过程中长出的愈伤组织能在含0.5M的草甘膦的培养基上生长，愈伤组织中EPSP合酶的活性提高了40倍，转化植株在温室中能抗0.18磅·公倾^-1的草甘膦(Mollenhauer C,Smart C,Amrhein N.Glyphosate toxicity in the shoot apical region of the tomato.Plant Pest Biochem Physiol,1987,(29):55-65)。三是表达天然来源的抗草甘膦EPSP合酶。美国孟山都公司在根癌农杆菌CP4中发现了抗草甘膦的EPSP合酶。这类EPSP合酶与以往克隆的酶氨基酸序列差异很大，同源性低于50％，表现出了对草甘膦的高抗性和对底物(PEP)的高亲和力(Padgette SR,Kolacz KH,Delannay X.Development,identification,and characterization of a glyphosatetolerant soybean line.Crop Sci,1995,35:1451-1461)，目前CP4-EPSPS已被广泛用于商业化种植的抗草甘膦转基因作物中。

近年来，我国对草甘膦抗性菌株和基因资源方面的研究取得了较大的进步，克隆了一系列抗草甘膦的基因。G2-aroA为中国农业科学院生物技术研究所林敏实验室从草甘膦污染的极端环境中分离的新型高抗草甘膦EPSP合酶编码基因(刘柱,陈明,徐玉泉等.一株草甘膦极端抗性菌株的分离和分子鉴定.高技术通讯,2002,12:25–28；朱玉,于中连,林敏.草甘膦生物抗性和生物降解及其转基因研究.分子植物育种,2003,1(4):435-441)，具有我国自主的知识产权，与国外专利的EPSPS基因相比，氨基酸序列同源性很低(23％)，核苷酸序列同源性更低，但抗草甘膦的能力很强，目前已在烟 草、水稻和油菜上对其高抗草甘膦的能力进行了验证，因而具有明显的应用前景。

抗草甘膦转基因棉花在1996年就开始商业化种植，获得了巨大的经济利益。然而,我国目前尚未有转基因抗草甘膦棉花商业化应用的相关报道，因此，将G2-aroA基因导入棉花，培育抗草甘膦转基因棉花具有重要的经济和社会意义。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种用于检测或辅助检测待测棉花是否为耐草甘膦转基因陆地棉BG2-7CGMCC No.10412的引物对。

在本发明中，所述陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412具体为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCC No.10412的棉花种质。

本发明所提供的用于检测或辅助检测待测棉花是否为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成。

其中，所述序列1由18个核苷酸组成；序列2由27个核苷酸组成。

所述引物对在制备用于检测或辅助检测待测棉花是否为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的再一个目的是提供一种用于检测或辅助检测待测棉花是否为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的试剂盒。

本发明所提供的用于检测或辅助检测待测棉花是否为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的试剂盒，包含所述引物对。

所述试剂盒中还可含有PCR反应所需的常规试剂，如DNA聚合酶、dNTP等。

所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。

所述试剂盒的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装。

所述引物对或所述试剂盒在检测或辅助检测待测棉花是否为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测待测棉花是否为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的方法。

本发明所提供的检测或辅助检测待测棉花是否为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的方法，可包括如下步骤：

(b1)以所述待测棉花的基因组DNA为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增，获得PCR产物；

(b2)根据所述PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测棉花是否为陆地棉 (Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412：若所述PCR产物中含有644bp的DNA片段，则所述待测棉花为或候选为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412；若所述PCR产物中不含有644bp的DNA片段，则所述待测棉花不为或候选不为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412。

进一步，所述644bp的DNA片段具体为序列表中序列5中第495-1138位序列所示DNA片段。

在所述方法中，以所述引物对进行PCR扩增的退火温度为55℃。

更加具体的，在所述方法中，以所述引物对进行PCR扩增的反应条件为：95℃4min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，34个循环；72℃10min。

另外，在所述方法中，以所述引物对进行PCR扩增时，所述引物对中上下游引物为等摩尔使用(如上下游引物用量均为10pmol)。

更加具体的，在所述方法中，以所述引物对进行PCR扩增的反应体系为：2.5U Taq Polymerase、5.0μl 10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)、12.5nmol dNTP、上下游引物各10pmol、模板DNA 1μl，用灭菌ddH₂O补足体积至50μl。

本发明的还一个目的是提供陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412外源插入片段的侧翼序列。

本发明所提供的陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412外源插入片段的侧翼序列，为5’侧翼序列；

所述5’侧翼序列的核苷酸序列为序列表中序列5。

在本发明中，所述引物对是根据所述侧翼序列设计的，因此，依据所述侧翼序列设计获得的引物序列应该都属于本发明的保护范围。

本发明根据陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的5’侧翼序列设计得到由序列表中序列1和序列2所示的引物对。实验证明，利用该引物对通过PCR的方法可检测待测棉花是否为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412，且该方法准确率高、特异性强、灵敏度高。

保藏说明

分类命名：陆地棉

拉丁名：(Gossypium hirsutum)

参椐的生物材料：BG2-7

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2015年3月19日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10412

附图说明

图1为植物表达载体pG2的基因表达盒示意图。Rbs P：菊花Rubisco小亚基基因的启动子；CTS：菊花Rubisco小亚基的叶绿体信号肽；Rbs T：菊花Rubisco小亚基基因的终止子。

图2为农杆菌介导法转化棉花的遗传转化体系。A：愈伤组织；B：Kan抗性愈伤组织；C：胚性愈伤组织；D：植株再生；E：生根培养；F：移栽。

图3为转G2-aroA基因棉花的PCR检测。M：Marker 100bp；P：质粒；CK1：空白对照(以等量水替代模板)；CK2：K312；1-8：转基因棉花(BG2-1、BG2-2、BG2-3、BG2-7、BG2-12、BG2-14、BG2-17、BG2-20)。

图4为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的草甘膦抗性鉴定。A：受体K312，未喷施2000ppm草甘膦(将2ml有效成分为41％的草甘膦异丙胺盐水剂(商品名为农达)加入到408ml水中即得到2000ppm的草甘膦溶液)；B：受体K312，喷施2000ppm草甘膦；C：BG2-7，喷施2000ppm草甘膦；D：BG2-7，未喷施2000ppm草甘膦。

图5为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412中外源基因拷贝数分析。M：marker；1：K312DNA/EcoR I；2：K312DNA/Hind III；3：BG2-7/EcoR I；4：BG2-7/Hind III；5：植物表达载体pG2质粒DNA。

图6为获得的5’端侧翼序列Phytozome分析。

图7为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412插入位点5’端特异性检测。M：Trans2K DNA marker；1：水；2：海岛棉7124；:3：陆地棉K312；4：BG2-7。

图8为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412插入位点3’端特异性检测。M：Trans2K DNA marker；1：水；2：海岛棉7124；:3：陆地棉K312；4：BG2-7。

图9为检测陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的侧翼序列的灵敏度检测结果。A为5’端侧翼序列检测结果；B为3’端侧翼序列检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中未详细说明的操作步骤参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。

植物表达载体pG2：记载于“孔宁.基因拆分限控转基因漂流的研究.中国农业科 学院,硕士论文,2008”一文，公众可以从申请人处获得。

珂312：记载于“赵常燕.农杆菌介导棉花遗传转化及转phyA植株的获得.河北农业大学,硕士论文,2008”一文，公众可以从申请人处获得。

海岛棉7124：记载于“王旭静，窦道龙，王志兴，贾士荣.海岛棉GbNPR1基因全长cDNA的克隆及其在烟草中的表达.中国农业科学，2006，39(5)：886-894”一文，公众可以从申请人处获得。

41％草甘膦异丙胺盐(商品名：农达)：美国孟山都公司产品，中化国际(控股)股份有限公司代理，农药登记号：PD73-88。

pMD-18T克隆载体：购自六合通经贸有限公司，产品目录号：D102A。

DNA提取试剂盒：北京博迈德科技发展有限公司，产品目录号：DN1501。

2×EasyTaq PCR SuperMix：北京全式金生物技术有限公司，产品目录号：AS111-01。

琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒：北京博迈德科技发展有限公司，产品目录号：DR0101。

大肠杆菌感受态细胞：北京全式金生物技术有限公司，产品目录号：CD201-01。

核酸外切酶I ExoI：购自NEB公司，产品目录号：M0293V。

所用培养基配方如下表：

实施例1、耐草甘膦转基因陆地棉BG2-7的获得及性状鉴定

一、农杆菌介导法获得转基因棉花植株

采用农杆菌介导法，将含有G2-aroA基因(ZL 03826892.2)的植物表达载体pG2(pG2的基因表达盒示意图如图1所示)导入受体材料珂312。具体如下：

(1)选取饱满的珂312种子，用少量浓硫酸脱绒后用大量清水清冲。75％(体积分数)的酒精灭菌5min，灭菌水冲洗三遍。然后用1.8％(体积百分比)次氯酸钠溶液消毒30分钟，无菌水冲洗6遍。最后将灭过菌的种子置于37℃过夜培养，进行催芽。

(2)用镊子轻轻的将种皮剥去，置于500mg/ml头孢塞污钠溶液浸泡30-45分钟后用大量的无菌水清洗6遍。用滤纸将种子表面的水分吸干后播种于I号培养基中，28℃暗培养5-7天。

(3)将无菌苗的下胚轴切成5-6mm小段，置于含有pG2的农杆菌菌液中28℃侵染30min；

(4)侵染结束后，将下胚轴放在无菌的滤纸上晾干并接种到共培养培养基上，25℃暗培养2-3天；

(5)共培养结束后，将外植体接种到愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导，28℃暗培养。

(6)将诱导出的愈伤组织接种到继代培养基上进行胚性愈伤组织的筛选，每半月继代一次。

(7)将颗粒状的胚性愈伤组织转入分化培养基上进行植株再生，一个月继代一次，直至再生苗出现。

(8)将3-4cm高的再生苗接种到生根培养基中进行生根培养。

(9)等植株长出3-4片真叶，主根和侧根都生长良好时，去除封口膜，室温炼苗1周左右。

(10)炼苗结束后移入田间生长结籽。

经过大约1年的时间，获得了T0代再生植株(图2)，将所得各植株进行编号。

二、转基因棉花阳性植株的PCR检测

(1)PCR鉴定

利用基因组DNA提取试剂盒提取步骤一获得的T0代再生植株(编号分别为BG2-1、BG2-2、BG2-3、BG2-7、BG2-12、BG2-14、BG2-17、BG2-20)的基因组DNA。根据G2-aroA基因序列设计引物G2-F-1和G2-R-2。

G2-F-1：5’-GGCTCCAAATCCATTACCAACC-3’；

G2-R-2：5’-CGCAGGTTCGCCAGTTCA-3’。

以G2-F-1/G2-R-2为引物，以各T0代再生植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应条件为PCR扩增程序：95℃5min；95℃45sec，57℃45sec，72℃1min，32次循环；72℃10min。

同时以未转基因受体材料珂K312和植物表达载体pG2作为对照。

检测结果如图3所示，只有以T0代再生植株(编号分别为BG2-1、BG2-2、BG2-3、BG2-7、BG2-12、BG2-14、BG2-17、BG2-20)的基因组DNA和植物表达载体pG2为模板时扩增得到了大小约为896bp的目的条带，而非转基因对照珂312中没有目的条带的扩增。

三、T1转基因棉花的草甘膦抗性分析

T0代再生植株自交后获得T1代植株。在棉花生长的3-5叶期，对T1代转基因棉花(编号分别为BG2-1、BG2-2、BG2-3、BG2-7、BG2-12、BG2-14、BG2-17、BG2-20)喷施2000ppm的除草剂草甘膦(将2ml有效成分为41％的草甘膦异丙胺盐水剂(商品名为农达)加入到408ml水中即得到2000ppm的草甘膦溶液)，以非转基因受体材料珂312为对照。2周后进行调查，结果发现喷施2000ppm的除草剂草甘膦的非转基因受体材料珂312全部死亡，而不同的转基因株系中都有植株存活，其中BG2-7株系中存活植株的生长没有受到抑制，而其他几个株系中的存活植株生长缓慢，最终影响了正常结实(图4)。因此，选择BG2-7进行后续的研究工作。

四、转基因棉花BG2-7的拷贝数分析

选用的杂交试剂盒是Thermo公司的生物素探针标记试剂盒Biotin Random Prime Labeling Kit(Number 17075)及化学发光杂交检测试剂盒Chemiluminescent Hybridization and Detection Kit(Number 17097)。

提取转基因基因组DNA，利用EcoR I和HindIII分别进行过夜单酶切，每组酶切反应中基因组总量在200μg以上。电泳后进行转膜、洗膜和预杂交。以植物表达载体pG2质粒为模板，以F-1(CAGAAAACCGTGACCGTTAC)和R-1(GATACGTACTGGCTGGACAA)为引物进行PCR扩增，扩增出的大约515bp的DNA条带回收测序后作为标记探针。按照试剂盒说明对探针进行标记。为了计算标记探针的产量，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000C测量该探针溶液的OD260、OD280的吸光值，获得质量浓度。预杂交结束后加入标记好的探针进行杂交，杂交条件为55 ℃过夜。过夜结束后用1×的严谨洗膜液200μl/cm²加入到杂交瓶中，55℃洗膜单次15～20min，共计3次。将膜至于发光检测工作液(等体积混合Luminol Enhancer溶液和Peroxide(过氧化氢)溶液)中孵育5min(RT)，将湿润的膜置于干净的保鲜膜上，包好，赶走气泡，不要有褶皱。将膜用胶带固定于X光片夹的增感屏上，含有DNA的一面朝上；在暗室中压上一张大小合适的X光片，用胶带固定两角，上面再放一张增感屏，扣紧X光片夹，-70℃曝光数小时至数天。最后将X光胶片浸没与显影液中直到看到清晰的目的条带，然后浸没与酸性定影液中定影5～10min，用清水冲洗胶片，晾干保存。

Southern检测结果如图5所示，转基因棉花BG2-7基因组DNA经EcoR I和HindIII单酶切后，都只能杂交得到1条DNA条带，证明转基因棉花BG2-7中外源基因为单拷贝插入。

综上，本发明采用农杆菌介导法，将耐除草剂基因G2-aroA导入受体材料珂312。获得的再生植株通过PCR检测、Southern杂交、Western杂交、耐草甘膦能力检测等分析，最终筛选出外源基因单拷贝插入且耐草甘膦的转基因棉花新种质BG2-7，其表现出了极强的草甘膦抗性。本发明的发明人将该BG2-7，株系于2015年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，参椐的生物材料(株)为BG2-7，建议的分类命名为陆地棉(Gossypium hirsutum)，其保藏编号为CGMCC No.10412。

实施例2、陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7的侧翼序列的克隆

一、陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7的5’端侧翼序列的克隆

1、根据棉花转化时所用植物表达载体中的已知序列设计如下引物F1、F2和F3。所有引物由上海生物工程有限责任公司合成。引物用水溶解至终浓度为100μM。

F1：5’-aacacggcggcatcagagca-3’；

F2：5’-taccgaggggaatttatggaacg-3’；

F3：5’-gttgcggttctgtcagttccaa-3’；

2、利用植物基因组DNA提取试剂盒提取陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412叶片DNA，具体操作按试剂盒说明书进行。提取的DNA用水稀释至终浓度100ng/μl。

3、根据Genome Walking Kit试剂盒(TaKaRa，北京，Code：D316)说明书，在PCR反应管中依次加入10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺plus)5μl，dNTP混合物(2.5mM each)5μl，上游引物F1(100pM)1μl，试剂盒所带随机引物AP1或AP2或AP3或AP4(100pM)1μl，植物基因组DNA 2.5μl，TaKaRa LA(5U/μl)0.5μl，最 后加水至终体积为50μl。反应液混合均匀后置于T-100PCR仪进行PCR反应，反应条件为：94℃2分钟；94℃30秒，62℃1分钟，72℃2分钟，5个循环；94℃30秒，25℃3分钟，72℃3分钟；94℃30秒，60-68℃1分钟，72℃2分钟，15个循环；94℃30秒，44℃1分钟，72℃2分钟，15个循环。

4、在PCR反应管中依次加入10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺plus)5μl，dNTP混合物(2.5mM each)5μl，上游引物F2(100pM)1μl，试剂盒所带随机引物AP1或AP2或AP3或AP4(100pM)1μl，步骤3的扩增产物0.5μl，TaKaRa LA(5U/μl)0.5μl，最后加水至终体积为50μl。反应液混合均匀后置于T-100PCR仪进行PCR反应，反应条件为：94℃2分钟；94℃30秒，60-68℃1分钟，72℃2分钟，15个循环；94℃30秒，44℃1分钟，72℃2分钟，15个循环。

5、在PCR反应管中依次加入10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺plus)5μl，dNTP混合物(2.5mM each)5μl，上游引物F3(100pM)1μl，试剂盒所带随机引物AP1或AP2或AP3或AP4(100pM)1μl，步骤4的扩增产物0.5μl，TaKaRa LA(5U/μl)0.5μl，最后加水至终体积为50μl。反应液混合均匀后置于T-100PCR仪进行PCR反应，反应条件为：94℃2分钟；94℃30秒，65℃1分钟，72℃2分钟，15个循环；94℃30秒，44℃1分钟，72℃2分钟，15个循环。

6、步骤5的扩增产物进行电泳检测，回收大于已知片段的DNA条带。回收的DNA条带连接pMD-18T载体，挑选阳性克隆进行测序。

7、通过DNAman软件和Phytozome分析，发现获得的DNA序列1-734bp为棉花基因组序列，与棉花第11染色体上61253333-61253972间的序列同源性为94.2％(图6)，735-1138为已知转化载体上的DNA序列。比对结果证明获得了转基因棉花BG2-7中外源基因在棉花基因组插入位点的5’端侧翼序列。

5’端侧翼序列的核苷酸序列如序列表中序列5所示。该5'端侧翼序列由棉花基因组序列片段和转化载体pG2上的片段两部分组成。具体的，序列5的第1-734位为棉花基因组序列片段，第735-1138位为转化载体pG2上的序列片段。

二、陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7的3’端侧翼序列的克隆

1、根据Phytozome网站上公布的雷蒙德氏棉第十一号染色体上61,252,000到61,253,333之间的DNA序列和已知植物表达载体序列设计引物F(5’-CTGGCGTAATAGCGAAGAG-3’)和R(5’–ACAAGCGGAGGCGGTATT-3’)。

2、利用植物基因组DNA提取试剂盒提取陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412叶片DNA，具体操作按试剂盒说明书进行。提取的DNA用水稀释至终浓度100ng/μl。

3、以提取的基因组DNA为模板，以F/R为引物进行PCR扩增。扩增条件为：95 ℃5min；95℃45sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃扩增10min。

4、PCR反应产物进行电泳检测，回收DNA条带。回收的DNA条带连接pMD-18T克隆载体，挑选阳性克隆进行测序。

5、通过DNAman软件和Phytozome分析，发现获得的DNA序列1-190bp为已知转化载体上的序列，191-859为棉花基因组序列，与棉花第11染色体上61252920-61253302间的序列同源性为100％。比对结果证明我们获得了转基因棉花BG2-7中外源基因在棉花基因组插入位点的3’端侧翼序列，并造成了棉花基因组30bp和T-DNA右边界298bp的缺失。

3’端侧翼序列的核苷酸序列如序列表中序列6所示。该3'端侧翼序列由转化载体pBG2-G2-aroA上的片段和棉花基因组序列片段两部分组成。具体的，序列6的第1-190位为转化载体pG2上的序列片段，第191-859位为棉花基因组序列片段。

实施例3、耐草甘膦转基因陆地棉BG2-7的侧翼序列的特异性PCR检测

一、5’端侧翼序列特异性PCR检测

1、根据陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7外源基因插入位点5’端的侧翼序列(序列5)，设计外源基因位点特异性PCR检测的引物BG2-7-5-F和BG2-7-5-R。

BG2-7-5-F：5’-CCTATTACACGGCTATGC-3’(序列1，为序列5的第495-512位)；

BG2-7-5-R：5’-GTCATAACGTGACTCCCTTAATTCTCC-3’(序列2，为序列5的第1112-1138位的反向互补序列)。

2、利用植物基因组DNA提取试剂盒提取陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7、非转基因受体棉花珂312、海岛棉7124的叶片DNA，具体操作按试剂盒说明书进行。提取的DNA用水稀释至终浓度100ng/μl。

3、以上述提取的DNA为模板，以BG2-7-5-F和BG2-7-5-R为引物进行5’端侧翼序列特异性PCR检测。反应体系为：0.5μl Taq Polymerase(5U/μl)、5.0μl 10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)、5.0μl dNTP(2.5mM)、BG2-7-5-F和BG2-7-5-R各1μl(10.0μM)、模板DNA1μl，用灭菌ddH₂O补足体积至50μl。反应条件为：95℃预变性4min，95℃变性30sec、55℃退火30sec、72℃延伸1min，34个循环，72℃扩增10min。

4、PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，结果得到只有以陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7的基因组DNA为模板时能扩增到644bp左右的目标DNA条带，而其它样品中未能扩增到相应的目标条带(图7)。将644bp的目标DNA条带回收测序，其序列为序列表中序列5的第495-1138位。

二、3’端侧翼序列特异性PCR检测

1、根据陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7外源基因插入位点3’端的侧翼序列 (序列6)，设计外源基因位点特异性PCR检测的引物BG2-7-3-F和BG2-7-3-R。

BG2-7-3-F：5’-TCCTTTCGCTTTCTTCCCTT-3’(序列3，为序列6的第71-90位)；

BG2-7-3-R：5’-ACACTTACATGGCGTCTTCT-3’(序列4，为序列6的第662-681位的反向互补序列)。

2、利用植物基因组DNA提取试剂盒提取陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7、非转基因受体棉花珂312、海岛棉7124的叶片DNA，具体操作按试剂盒说明书进行。提取的DNA用水稀释至终浓度100ng/μl。

3、以上述提取的DNA为模板，以BG2-7-3-F和BG2-7-3-R为引物进行3’端侧翼序列特异性PCR检测。反应体系为：0.5μl Taq Polymerase(5U/μl)、5.0μl 10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)、5.0μl dNTP(2.5mM)、BG2-7-3-F和BG2-7-3-R各1μl(10.0μM)、模板DNA1μl，用灭菌ddH₂O补足体积至50μl。反应条件为：95℃预变性4min，95℃变性45sec、58℃退火30sec、72℃延伸1min，34个循环，72℃扩增5min。

4、PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，结果得到只有以陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7基因组DNA为模板时能扩增到611bp左右的目标DNA条带，而其它样品中未能扩增到相应的目标条带(图8)。将611bp的目标DNA条带回收测序，其序列为序列表中序列6的第71-681位。

实施例4、检测耐草甘膦转基因陆地棉BG2-7的侧翼序列的灵敏度检测

分别提取陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7和受体材料珂312的基因组DNA，将珂312和BG2-7的基因组DNA按按质量百分含量成比例混合，依次配制成BG2-7的基因组DNA含量为10.00％、1.00％、0.50％、0.10％、0.05％和0％的系列样品(拷贝数分别为8800，880，440，88，44和0)，作为灵敏度检测的模板使用。

分别以如上系列拷贝数的基因组DNA样品作为模板，采用实施例3得到的两个特异性引物对(引物对BG2-7-5-F/BG2-7-5-R和引物对BG2-7-3-F/BG2-7-3-R)分别进行PCR扩增。两个引物对所采用的反应体系和反应程序参见实施例3进行。

实验同时设置以水代替模板DNA的阴性对照。

结果如图9所示，以引物对BG2-7-5-F/BG2-7-5-R进行PCR扩增，44(0.05％)个拷贝数的基因组DNA样品即可扩增出大小为644bp的目的条带(图9中A)，以引物对BG2-7-3-F/BG2-7-3-R进行PCR扩增，88(0.1％)个拷贝数的基因组DNA样品即可扩增出大小为611bp的目的条带(图9中B)。本发明的发明人进一步将扩增得到的大小为644bp的目的条带和大小为611bp的目的条带胶回收后送样测序，结果表明644bp的目的条带确实为序列表中序列5所示的第495-1138位序列，611bp的目的条带确实如序列表中序列6所示的第71-681位序列。以上结果表明实施例3得到的引 物对BG2-7-5-F/BG2-7-5-R和引物对BG2-7-3-F/BG2-7-3-R具有较强的灵敏度。