一种实验动物资源质量快速监测方法与流程

本发明属于生物学领域，更具体地，本发明涉及一种实验动物资源质量快速监测方法。

背景技术：

实验动物资源(胚胎、精子等)冷冻技术的应用有许多优点。在医学生物学研究中，需要各种品系的实验动物，在隔离器内保养动物品系需要花费大量的人力和物力，代价昂贵。如将暂时用不着的动物资源进行冷冻，就可以长期保存，既安全又能节省人力和物力。采用动物资源运输代替活动物运输，既方便又能减少疾病的传播，便于国际间实验动物品系的相互交流。此外，能够保存有价值的遗传物质，建立基因库，防止实验动物的遗传漂变。

实验动物资源中若带有的病原微生物，会对生殖细胞等的品质、保存及受胎效果等产生影响，并且可能导致最后获得的实验动物中也带这些病原微生物，最终影响实验动物质量。而病原微生物在实验动物上可以引起动物疫病表现，甚至发生死亡，使动物繁殖率下降和动物发育不良，影响动物自身的稳定性和反应性，甚至引起人兽共患病，严重影响动物实验的正常进行，并对饲养人员和实验人员的健康和安全造成威胁。

目前已有共识，实验动物资源(胚胎、精子等)冷冻操作都不是无菌的技术，在动物的运输过程中，资源的冷冻过程中，包括冷冻所需的试剂和实验室的环境中可能都会导致实验动物资源中带有某些日常生活中比较常见的病原微生物。并且实验室所使用的主要冷冻媒介是液氮(-196℃)，液氮中微生物含量非常低，但是，在储存和分配过程中会被病原微生物污染，从而成为冷冻芽孢、酵母菌、细菌和病毒的有效培养基。在实验动物的微生物质量控制中，很多病原微生物必须被排除，但是目前在实验动物资源中对这些病原微生物还没有进行严格检测控制，所以建立一个实验动物资源(胚胎、精子等)质量(微生物)快速监测方法以保证实验动物资源的微生物质量达标。

金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、乙型溶血性链球菌是实验动物上比较常见的病原微生物，它们广泛存在于空气和水中，是人和动物体表、皮、毛、鼻、口腔、消化道的常见菌，也是条件性致病菌。

中华人民共和国国家标准GB14922.2-2011规定金黄色葡萄球菌检测采用分离培养法与生化鉴定相结合的方法。采取可疑样品接种于高盐甘露醇(SP)培养基，置37℃培养18-24h。SP培养基上形成1mm左右、凸起、黄色的菌落，菌落周围的培养基因金黄色葡萄球菌发酵甘露醇而红色变成黄色。挑取单菌落转接于血琼脂平皿，37℃培养18-24h，形成白色或金黄色、凸起、圆形、不透明、表面光滑、周围有β溶血环的群落。革兰氏染色后镜检观察，其为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄球状，无荚膜和芽孢。当符合以上结果时，做血浆凝固酶实验。同时设立已知的血浆凝固酶阳性和阴性的金黄色葡萄球菌及营养肉汤培养基作为对照。但已知的阳性株和待检株均出现凝固块时，可判断待检菌株为金黄色葡萄球菌。

中华人民共和国国家标准GB14926.13-2001规定肺炎克雷伯氏菌采用分离培养法与生化鉴定相结合的方法。采取可疑样品接种于胆盐硫乳琼脂(DHL)培养基，置37℃培养18-24h。DHL培养基上形成淡粉色，大而隆起，光滑湿润，呈粘液状，相邻菌落易融合成浓汁样，直接接种针挑取时刻拉出较长的丝。革兰氏染色后镜检观察，其为革兰氏阴性短杆菌，单个、成双或成短链排列，有荚膜，无芽孢。挑取单菌落转接于碘化钾或三糖铁(TSI)琼脂培养基36±1℃培养18-24h，斜面产酸，底层产酸产气，或仅产酸不产气，硫化氢阴性。VP试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，MR阴性，西蒙氏柠檬酸盐利用实验阳性，丙二酸盐试验阳性，尿素酶阳性，赖氨酸脱羧酶阳性、鸟氨酸脱羧酶阴性，利用葡萄糖和乳糖，靛基质阴性，半固体动力试验阴性。凡符合上市各项检测结果者，可判断待检菌株为肺炎克雷伯氏菌。

中华人民共和国国家标准GB14926.13-2001规定乙型溶血性链球菌采用分离培养法与生化鉴定相结合的方法。采取可疑样品接种于血琼脂培养基，置37℃培养18-24h。血琼脂培养基上形成1mm左右，灰白色圆形、凸起，半透明或不透明，表面光滑，周围有2-4mm界限分明，无色透明溶血环(β溶血)的小菌落。革兰氏染色后镜检观察，其为革兰氏阳性球菌，成链状排列。固体培养基上生长多呈短链或葡萄状，而液体培养基中则成典型的链球状排列。 链激酶试验阳性，杆菌肽敏感试验阳性。凡符合上市各项检测结果者，可判断待检菌株为乙型溶血性链球菌。

多年来，在实验动物病原微生物的检测中主要是依靠传统的分离培养和生化鉴定方法，它是微生物学上普遍认可的经典方法，容易得出明确的结论，实验结果可以反复验证，并可以在绝大多数的实验室开展。但是这些方法或耗时，或特异性低，且需要检测人员对病原微生物的菌落形态、理化反应性质等有准确的判断，才能得出正确的结论，这就要求检测人员必须具有扎实的微生物学理论基础和丰富的病原微生物检测经验。

因此，对于实验动物病原微生物的检测技术，还需要加以改进，以提高检测效率，提高检测准确性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种实验动物资源质量快速监测方法。

在本发明的第一方面，提供一种特异性鉴定实验动物资源中目标微生物感染情况的方法，所述方法包括：

(1)以实验动物资源待测样品的DNA为模板，以目标微生物特异性引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(2)分析PCR扩增产物，若测得阳性产物，则表明存在目标微生物感染；

其中，所述的目标微生物是金黄色葡萄球菌，其PCR引物选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的引物，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物，或SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物；或

所述的目标微生物是肺炎克雷伯氏菌，其PCR引物选自：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的引物，或SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物；或

所述的目标微生物是乙型溶血性链球菌，其PCR引物选自：SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的引物，SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物，SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的引物，SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物，SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的引物，SEQ ID NO:29和SEQ ID NO: 30的引物，或SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的引物。

在一个优选例中，所述的实验动物资源是冷冻的实验动物资源。

在另一优选例中，所述的实验动物资源包括(但不限于)：动物胚胎，精子、卵子。

在另一优选例中，步骤(2)中，通过对PCR扩增产物进行电泳，若电泳条带阳性，则表明存在目标微生物感染。

在另一优选例中，步骤(2)中，通过对PCR扩增产物进行电泳，若电泳条带阳性，将阳性条带中的DNA进行测序，将测序结果与目标微生物的基因序列进行BLAST比较，从而准确确定PCR扩增产物中是否存在目标微生物。

在本发明的另一方面，提供一种PCR引物，所述引物是扩增金黄色葡萄球菌的引物，选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的引物，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物，或SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物；或

所述引物是扩增金黄色葡萄球菌的引物，选自：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的引物，或SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物；或

所述引物是扩增乙型溶血性链球菌的引物，选自：SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的引物，SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物，SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的引物，SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物，SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的引物，SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的引物，或SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的引物。

在本发明的另一方面，提供所述的引物的用途，用于特异性鉴定实验动物资源中目标微生物感染情况。

在本发明的另一方面，提供一种用于特异性鉴定实验动物资源中目标微生物感染情况的试剂盒，其中包括：

扩增金黄色葡萄球菌的引物，选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的引物，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物，或SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物；和/或

扩增金黄色葡萄球菌的引物，选自：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的引物，或SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物；和/或

扩增乙型溶血性链球菌的引物，选自：SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的引物，SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物，SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的引物，SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物，SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的引物，SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的引物，或SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的引物。

在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：含有目标微生物标准菌株的检测标准品。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定实验动物资源中目标微生物感染情况的方法的使用说明书。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、利用阳性标准菌株建立PCR体系及筛选引物的流程示意图。

图2、针对冷冻资源的快速检测方法的流程示意图。

图3、利用金黄色葡萄球菌引物1进行PCR扩增，电泳获得的目的条带的序列Blast结果。

图4、利用金黄色葡萄球菌引物2进行PCR扩增，电泳获得的目的条带的序列Blast结果。

图5、利用肺炎克雷伯氏菌引物1进行PCR扩增，电泳获得的目的条带的序列Blast结果。

图6、利用肺炎克雷伯氏菌引物2进行PCR扩增，电泳获得的目的条带的序列Blast结果。

图7、利用乙型溶血性链球菌引物1进行PCR扩增，电泳获得的目的条带的序列Blast结果。

图8、利用乙型溶血性链球菌引物2进行PCR扩增，电泳获得的目的条带的序列Blast结果。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示一种可特异性鉴定实验动物资源中目标微生物感染情况的方法，筛选获得了特异性非常好的PCR引物，具有检测灵敏度和准确性。

如本文所用，所述的“目标微生物”包括：金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、乙型溶血性链球菌中的一种或多种。

本发明人通过对引物的筛选，获得一种可特异性鉴定实验动物资源、特别是冷冻的实验动物资源中目标微生物感染的引物，其特异性良好，对于目标微生物的DNA样品发生特异性扩增，而对没有目标微生物的DNA不发生特异性扩增样品。

因此，本发明提供一种引物，所述的引物是扩增金黄色葡萄球菌的引物，选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的引物，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物，或SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物。或，所述引物是扩增金黄色葡萄球菌的引物，选自：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的引物，或SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物；或所述引物是扩增乙型溶血性链球菌的引物，选自：SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的引物，SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物，SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的引物，SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物，SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的引物，SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的引物，或SEQ ID NO:31和SEQ ID NO: 32的引物

本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

利用本发明的引物以及PCR扩增体系，只需进行PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的有无，就可以准确、快速地判断待测样品是否存在目标微生物的感染，而且所需的样品量很少，对于微量的目标微生物也能有效地检出。

聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明提供了一种优化的PCR技术。

获取待测样品的DNA的方法可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。

本发明还涉及一种用于特异性鉴定实验动物资源中目标微生物感染情况的试剂盒，所述试剂盒中含有前面所述的引物。此外，所述的试剂盒中还可含有能够与所述的引物的扩增产物中某一位点发生特异性结合的探针，所述的探针可携带可检测信号如荧光信号，从而应用于荧光定量PCR检测。

此外，所述的试剂盒还可含有其它对于鉴定实验动物资源中目标微生物感染情况有用的试剂，如(但不限于)：

(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或

(B)各种提取DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；或

(C)提取DNA的试剂盒。

此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定实验动物资源中目标微生物感染情况的使用说明书和/或标准操作程序。本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测实验动物资源中目标微生物感染情况的目的，大大缩短了实验动物资源中检测病原微生物所需的时间和所耗费的试剂。

与传统的形态分析方法相比，PCR技术更具特异性和精确性，不会受外界因素(如温度改变、化学药物)影响而改变，而且其敏感度高、快速、简便， 它不仅能检测出活的病原微生物，而且也能检测出死亡的和难以培养的病原微生物，对检测人员的相关技术和经验要求不高。

本发明的PCR方法只需将冷冻实验动物资源、冷冻和复苏过程中所需要的溶液、保存冻存物液氮的灭菌水的冷冻物直接用微量DNA提取试剂盒的提取微生物的DNA，设计对应的引物和相应的条件后进行PCR(聚合酶链反应)，从而快速了解冷冻资源中的微生物情况。

此外，也可以使用LAMP方法代替上述的PCR方法检测三种病原微生物，该方法所需的时间更短，实验过程中不需要使用PCR仪，并且不需要通过电泳的方式检测扩增产物，可以通过比浊法等进行扩增产物的检测，其所需要的仪器成本更低。LAMP技术主要是利用四条不同的引物特异的识别目的基因上的六个特定序列，然后借助具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在60℃-65℃恒温条件下催化新链的合成，从而实验目的基因高效、快速的扩增。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、实验技术路线的制定及利用阳性标准菌株筛选引物

1、阳性对照的PCR方法建立

本实验需检测的目标微生物为：金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎克雷伯氏菌。

从中国医学微生物菌种保藏中心(CMCC)购买上述三株标准菌株作为阳性对照，将这三株标准菌株进行复苏，提取复苏后的标准菌株的DNA，根据各个标准菌株的基因序列设计与其相对应的特异性引物，对相应引物筛选和PCR体系优化，将PCR产物测序后比对，验证阳性标准菌株准确性，以此建立PCR方法。流程如图1。

2、引物筛选

经过大量的反复研究筛选，本发明人优化了适用于进行金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、乙型溶血性链球菌的PCR引物。具体如下：

(1)、金黄色葡萄球菌的引物及PCR条件与PCR扩增体系

针对金黄色葡萄球菌的引物及扩增条件如表1。

表1

PCR扩增体系如下：

(2)、肺炎克雷伯氏菌的引物及PCR条件

针对肺炎克雷伯氏菌的引物及扩增条件如表2。

表2

PCR扩增体系如下：

(3)、乙型溶血性链球菌的引物及PCR条件

针对乙型溶血性链球菌的引物及扩增条件如表3。

表3

PCR扩增体系如下：

实施例2、阳性标准菌株PCR结果产物测序结果BLAST

对获得的阳性标准菌株PCR产物进行电泳、测序。将获得的测序结果进 行BLAST。参数如下：

Score为比对得分，两个序列相似性越高；

E Value值越小，越可信；

Identities为一致性，就是两个序列保持一致的比例。

1、金黄色葡萄球菌引物1

利用金黄色葡萄球菌引物1，获得目的条带122bp。Blast结果如图3所示。

2、金黄色葡萄球菌引物2

利用金黄色葡萄球菌引物2，获得目的条带132bp。Blast结果如图4所示。

3、肺炎克雷伯氏菌引物1

利用肺炎克雷伯氏菌引物1，获得目的条带368bp。Blast结果如图5所示。

4、肺炎克雷伯氏菌引物2

利用肺炎克雷伯氏菌引物2，获得目的条带423bp。Blast结果如图6所示。

5、乙型溶血性链球菌引物3

利用乙型溶血性链球菌引物3，获得目的条带346bp。Blast结果如图7所示。

6、乙型溶血性链球菌引物5

利用乙型溶血性链球菌引物5，获得目的条带423bp。Blast结果如图8所示。

由上述实验结果说明，金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和乙型溶血性链球菌使用PCR方法检测是可行的，且检测准确性高。

实施例3、针对冷冻资源的快速检测方法的建立

将冷冻资源(胚胎和精子等)、冷冻和复苏过程中所需要的溶液、含有保存 冻存物液氮的灭菌水分别用微量DNA提取试剂盒(购自QIAGEN)提取DNA。

以前述实施例1提供的针对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、乙型溶血性链球菌的PCR引物及相应的PCR条件和PCR反应体系对上述样品DNA进行PCR反应，若得到阳性条带，即可证明冷冻资源中有相应菌株存在，同时可以回收PCR产物进行DNA测序进一步确认。

操作流程如图2所示。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。