一种单端孢霉烯族毒素的LAMP检测引物组合及其LAMP检测试剂盒和LAMP方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)的LAMP检测引物组合及其LAMP检测试剂盒和LAMP方法。

背景技术：

由禾谷镰刀菌引起的麦类赤霉病是一种毁灭性的病害，在亚洲、欧洲、加拿大和美国北部等地频繁爆发。病菌能在收获前仅仅几周的时间内在小麦穗部迅速扩展，阻碍种子形成并使麦粒萎缩，造成严重的经济损失。近年来，随着全球气候变化和耕作制度改变，发生区域不断扩大。赤霉病不仅可造成作物产量严重损失，而且其病原物镰刀菌代谢产生单端孢霉烯族毒素污染食物和饲料可造成人类和动物严重疾病和免疫力下降(Pestka and Smolinski 2005)，阻止真核生物蛋白质合成(Ueno et al.，1973)。因此，造成食品安全上的重大隐患。

单端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)是一大结构相似的倍半萜烯类化合物，迄今已发现有70多种，是镰刀菌产生的最重要的真菌毒素。根据化学结构主要可分为A型和B型两大类：A型包括二乙酰氧基草镰刀菌烯醇(Diacetoxyscirpenol，DAS)、T-2毒素和HT2毒素等；B型包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyldeoxynivalenol，3ADON)、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyldeoxynivalenol，15ADON)和雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)等。在我国，禾谷镰刀菌是小麦赤霉病的主要致病菌，也是产生单端孢霉烯族毒素的主要病原菌，严重影响了人畜的健康。

目前，真菌毒素的测定方法主要有生物测定法、化学测定法和免疫学测定法。生物测定法是缺乏统一的规范化标准，并且容易受到环境因素的影响，通常仅能用于定性分析。化学测定法是主要的测定方法，具有准确、重复性好的特点，但是要依赖于昂贵的科研仪器，并且前期的提取纯化步骤繁琐，技术要求高，耗时长，难以满足快速现场检测的要求。免疫学测定法与化学测定法相比，操作简单，快速，但依赖于特异性抗体，仅能检测少数毒素，并且容易受到一些衍生物干扰，假阳性率高，测定结果不够准确。

近年来，随着分子生物学的发展，特别是镰刀菌全基因组序列的公布，国内外科学家在单端孢霉烯族毒素的合成与调控方面取得了重要进展，解析了毒素合成基因簇中各基因以及多个相关调控基因的功能。基于毒素合成及调控基因的序列信息，开发快速且成本低廉的检测方法逐渐成为科学家研究的热点。如：Kim等(2003)利用Tri5、Tri7和Tri13基因序列信息开发了检测NIV和DON毒素的PCR检测方法，Li等(2005)通过分析Tri5～Tri6基因间 序列信息，设计了区分NIV和DON的检测引物，该方法稳定性好，适用于大规模检测。Zhang等(2010)根据Tri11基因开发了特异性引物组合，能够在一个反应内同时区分DON及其两种衍生物3ADON、15ADON，取得了很好的效果。但是，这些方法都仅限于检测部分B型单端孢霉烯族毒素，而无法检测样品是否含有T2、HT2等A型单族毒素。因此，应用范围受到很大限制，制约了这些方法在食品安全中毒素检测的应用。而且目前尚没有通过PCR检测同时检测A型与B型单端孢霉烯族毒素的报道。除此之外，以上检测均需要进行在PCR仪上完成聚合酶链式反应，对仪器要求较高，并且常规PCR反应及时间长，灵敏度也相对较低。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的等温扩增技术，因其操作简单快速、特异性、灵敏度高、成本低等特点，逐渐成为可以替代传统PCR的新的核酸扩增检测技术。它是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用BstDNA聚合酶的链置换活性在同一反应体系中恒温高效扩增，大量合成目的DNA的同时，产生副产物-白色焦磷酸镁沉淀。由于扩增反应依赖于靶DNA的6个独立的区域，因此特异性非常高，反应在等温条件下进行，则不需要PCR仪等昂贵设备，仅用水浴锅等能够维持稳定恒温的设备即可完成，检测成本大大降低，应用范围显著扩大，可以在田间进行实时监测。由于LAMP技术多方面的优点，近年来在病原物检测等方面应用广泛，但在单端孢霉烯族毒素检测方面尚无相关报到。

技术实现要素：

发明目的：针对以上存在的问题，本发明的目的是提供一组检测单端孢霉烯族毒素的LAMP引物组合，能够同时检测A型和B型单端孢霉烯族毒素。本发明的另一目的是提供上述单端孢霉烯族毒素的LAMP检测试剂盒。本发明的另一目的是提供上述单端孢霉烯族毒素的LAMP检测方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于检测单端孢霉烯族毒素的LAMP引物组合，由正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP，反向内引物BIP，正向环引物LB和反向环引物RB组成，各引物序列如下：

FIP：5’-TATTGTTGGCTACCCCAAGGCACCTTGACTCGAACTTCGCC-3’；

BIP：5’-GTCGGCCTTGGTGGTGTCATAAGGCCTTTGCTGAGATGTACC-3’；

F3：5’-CGCCTTACAAAGCCTTGAGA-3’；

B3：5’-TCCGATTGGAGGAGAACACT-3’；

LF：5’-TCCAGGCAAGAAGGAACACCTT-3’；

LB：5’-CGCAATGCGAGAAAGGGCGA-3’；

所述引物组合在检测单端孢霉烯族毒素中的应用。

一种检测单端孢霉烯族毒素的LAMP试剂盒，包含以下成分：

(1)包含上述引物组合的引物混合液，浓度分别为：正向外引物F3 1μM、反向外引物B3 1μM、正向内引物FIP 8μM、反向内引物FIP 8μM、正向环引物2μM、反向环引物2μM；

(2)反应液，包含：7mM dNTPs、100mM Tris-HCl，50mM KCl，50mM(NH₄)₂SO₄，40mM MgSO₄、0.5％Triton X-100、5M Betain、40U Bst DNA聚合酶、25mM羟基萘酚蓝；

(3)阳性对照为禾谷镰刀菌NRRL5883的基因组DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。

所述的检测单端孢霉烯族毒素的LAMP试剂盒在检测单端孢霉烯族毒素中的应用

一种检测单端孢霉烯族毒素的方法，包括提取待测材料的总DNA，以提取的DNA为模板，利用LAMP引物组或LAMP试剂盒进行LAMP扩增，观察反应溶液的颜色变化，显示紫色表示检测为阴性，不存在单端孢霉烯族毒素，而显示天蓝色的为阳性，样品中存在单端孢霉烯族毒素。

所述的检测单端孢霉烯族毒素的方法，提取待测样品的总DNA，取1μL DNA溶液，加入5μL反应液、5μL引物液、14μL灭菌超纯水进行LAMP反应，反应程序为60～65℃，时间为30～50min，扩增产物进行颜色变化的观察。

本发明检测单端孢霉烯族毒素的方法，包括待测样品DNA的提取，以DNA为模板，利用所述引物组合进行LAMP反应。羟基萘酚蓝(Hydroxynaphthol blue，HNB)属于金属离子指示剂的一种，是Mg²⁺的滴定及剂，其颜色随溶液PH改变而变化，因此可以通过监测Mg²⁺浓度及PH的变化起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加到反应液中，溶液呈紫色，反应过程中大量形成副产物焦磷酸镁沉淀，使Mg²⁺浓度下降，PH发生改变，溶液颜色由紫色转变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化判断单端孢霉烯族毒素的有无。显示紫色表示检测为阴性，不存在单端孢霉烯族毒素，而显示天蓝色的为阳性，样品中存在单端孢霉烯族毒素。

本发明的关键技术之一是单端孢霉烯族毒素的高效特异扩增引物序列及其扩增方法。为了验证引物序列的特异性，本发明以18株产生A型和B型单端孢霉烯族毒素毒素的不同种镰刀菌和9株产生其他类型毒素或不产毒素的不同种镰刀菌为供试材料(表1)，采用快速DNA提取法提取镰刀菌基因组DNA。具体方法如下：用已灭菌的牙签或枪头在样品表面上挑取少量菌丝，放入PCR管，加入50μL Buffer A溶液(100mM NaOH，2％20)，95℃温育10min。再加入50μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振荡混匀，12000rpm离心15s，取1μL上清液做LAMP扩增的模板。

当发生LAMP反应时，产生大量的焦磷酸镁沉淀导致浊度上升。通过HNB显色反应结果所示，产生A型和B型单端孢霉烯族毒素的镰刀菌样品反应管里均为天蓝色，其为阳性结果，而产生其他种毒素和不产毒素镰刀菌样品管均呈紫色，为阴性结果。证明设计的LAMP引物组合具有特异性。说明该引物组合可被用于田间和收获小麦中单端孢霉烯族毒素快速可靠的检测鉴定。当用于收获小麦中单端孢霉烯族毒素检测时，采用快速裂解法提取总DNA，具体过程如下：将待测小麦样品加入2mL离心管，并同时加入直径4mm钢珠，液氮速冻后与Biospec研磨仪高速研磨1min，加入200μL Buffer A溶液(100mM NaOH，2％20)，95℃温育10min。再加入200μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振荡混匀，12000rpm离心30s，取上清液做LAMP扩增的模板。

有益效果：现有技术相比，本发明的有点和积极效果表现在：

1)检测范围广。与以往报道仅检测一种或几种B型毒素的PCR检测方法相比，本发明能够同时检测到A型和B型单端孢霉烯族毒素，扩大了检测范围，有利于保障食品安全与粮食安全。

2)特异性强。本发明针对镰刀菌单端孢霉烯族毒素合成关键基因Tri4序列的6个区域设计了4条特异引物，对产毒镰刀菌进行特异性识别，其特异性强、灵敏度高，使本发明能够快速准确完成单端孢霉烯族毒素的检测。

3)操作简便快捷。本发明提供的检测单端孢霉烯族毒素的方LAMP法，克服了现有生物与化学检测方法样品处理繁琐，检测周期长、费时费力及需要PCR热循环仪等问题。该方法无需PCR反应中的退火、复性等温度的变化，30～50min内即可完成检测，大大提高了检测的效率。

4)成本低。本方法无需昂贵、精密的试验仪器设备，仅需要恒温水浴锅即可完成检测，且所用DNA快速提取和PCR过程均为常规试剂，价格低廉。

因此本方法实用性强，可满足田间及收获小麦中单端孢霉烯族毒素快速检测，为食品安全提供了保障。

表1 用于检测引物特异性的产不同种毒素的镰刀菌菌株

*菌株产生毒素经LC-MS确认

(四)附图说明

图1：LAMP引物组合的特异性验证结果

图中菌株编号与表1相同，图中显示1-18反应管为产生单端孢霉烯族毒素镰刀菌，检测结果呈阳性，19-27为产生其他毒素或不产毒镰刀菌，结果显示阴性。

图2：LAMP引物组合的灵敏度试验结果

1.100ng；2.10ng；3.1ng；4.100pg；5.10pg；6.1pg。图中显示25μL反应体系内含有10pg-100ng DNA均显示阳性，而含有1pg DNA呈阴性，说明反应灵敏度为10pg。

图3：收获小麦中单端孢霉烯族毒素检测结果

1.阳性对照(NRRL5883)；2.江苏；3.安徽；4.浙江；5.河北；6.河南；7.山东；8.阴性对照(water)。图中显示江苏与安徽样品呈阳性，含有单端孢霉烯族毒素，而其余样品呈阴性。

(五)具体实施方式

下面以具体实施例做进一步说明，但本发明不受以下实施例的限制。

实施实例1：单端孢霉烯族毒素LAMP反应的特异性实验

为了验证LAMP方法的特异性，以27个种的镰刀菌为参试对象，其中18个种产生单端孢霉烯族毒素、7个种产生伏马毒素等其他毒素，2个种不产毒素(表1)。

模板DNA提取：用已灭菌的牙签或枪头在样品表面上挑取少量菌丝，放入PCR管，加入50μL Buffer A溶液(100mM NaOH，2％20)，95℃温育10min。再加入50μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振荡混匀，12000rpm离心15s，取1μL上清液做LAMP扩增的模板。

LAMP反应：取1μL DNA溶液，加入5μL反应液、5μL引物组混合液、14μL灭菌超纯水进行LAMP反应，反应程序为65℃，时间为45min，扩增产物进行颜色变化的观察。

LAMP检测结果如图1所示，18株产生单端孢霉烯族毒素菌株反应管均显示天蓝色的阳性反应，而7株产其他毒素和2株不产毒菌株均呈紫色的阴性反应。

实施实例2：单端孢霉烯族毒素LAMP反应的灵敏度实验

为了验证LAMP方法的灵敏度，提取单端孢霉烯族毒素阳性的镰刀菌菌株NRRL5883(表1)，并采用分光光度计测定DNA浓度(100ng/μL)，用超纯水进行10倍梯度稀释，-20℃保存做模板。分别取各浓度的DNA溶液1μL做模板，加入5μL反应液、5μL引物组混合液、14μL灭菌超纯水进行LAMP反应，反应程序为65℃，时间为45min，扩增产物进行颜色变化的观察。结果表明(图2)，加入100ng、10ng、1ng、100pg、10pg DNA的反应管呈明显天蓝色，而加入1pg DNA的反应管呈紫色，表明LAMP反应的灵敏度达到10pg基因组 DNA。

实施实例3：收获小麦中检测单端孢霉烯族毒素

模板DNA提取：待测样品为江苏、安徽、浙江、河北、河南、山东6个省份收集的收获

小麦。将待测小麦样品加入2mL离心管，并同时加入直径4mm钢珠，液氮速冻后与Biospec研磨仪高速研磨1min，加入200μL Buffer A溶液(100mM NaOH，2％20)，95℃温育10min。再加入200μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振荡混匀，12000rpm离心30s，取上清液做LAMP扩增的模板。

LAMP反应：取1μL DNA溶液，加入5μL反应液、5μL引物组混合液、14μL灭菌超纯水进行LAMP反应，反应程序为65℃，时间为45min，扩增产物进行颜色变化的观察。

LAMP检测结果如图3所示，采集自江苏和安徽的小麦样品呈阳性，表明含有单端孢霉烯族毒素，而浙江、河北、河南、山东采集的样品为阴性，不含有单端孢霉烯族毒素。