玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增实时荧光检测试剂盒及使用方法与流程

本发明涉及一种用于植物致病菌快速检测的LAMP引物、试剂盒及其使用方法。尤其涉及一种用于玉米内州萎蔫病菌的LAMP引物、试剂盒及其使用方法，属于植物性病菌检测领域。

背景技术：

玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskense)是一种革兰氏阳性，无鞭毛，不固酸的严格好养性棒状杆菌。其是一种造成严重农业经济损失的植物病害，最早于1969年在美国内布拉斯加州中部和东部的马齿型玉米上发现，之后相继在爱荷华州西部、堪萨斯州、南达科塔州及科罗拉多州等地发生，2000年已经扩散至加拿大的安大略湖区。该病菌对玉米生产有严重的影响，在该病害大暴发时，可导致玉米产量损失率达50％。因此，为玉米内州萎蔫病菌建立一种快速高效的检测方法具有重要意义。

目前针对玉米内州萎蔫病菌常用的检测方法包括分离培养检测、酶联免疫吸附试验、免疫胶体金检测试验等，这些方法检测周期较长，灵敏度和效率偏低。分子生物学包括普通PCR，实时荧光定量PCR，DNA探针技术等，但这些方法对操作人员素质要求高，及其易于污染，且造价高昂，难以进行大批量的检测。环介导等温扩增(LAMP)法是2000年由日本Notomi博士发明的一种新的核酸扩增技术，其具有简便、快速、敏感性高和特异性强等优点。经过十几年的发展，该方法得到不断完善，尤其在结果判定方面，已有多种肉眼可视的方法及实时荧光检测法得到广泛应用，可从源头上控制住由电泳开盖造成的气溶胶污染，尤其适合于现场快速检测。

技术实现要素：

本发明的主要目的是提供了一套用于玉米内州萎蔫病菌快速检测的环介导等温扩增引物组，可用于玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增实时荧光反应扩增的快速检测。引物组中的各引物可按一定比例配制成引物组溶液，用于制备玉米内州萎蔫病菌快速检测的试剂盒，其中内引物与外引物的浓度比例确定方法为，分别按内引物与外引物的浓度比例为2∶1-12∶1配制引物组溶液，构成环介导等温扩增反应体系，通过观察出峰时间得出，内引物与外引物的最佳比例为6∶1。

所述的环介导等温扩增反应预混液，可以是使扩增产物发出荧光信号的一种商品化试剂盒Isothermal Master mix或者等效的其他试剂盒，由Bst聚合酶、dNTP、甜菜碱、MgSO₄和缓冲溶液构成。试剂盒中还同时引入一组阳性样品和阴性样品，阳性样品是由玉米内州萎蔫病菌人工合成片段构建的重组质粒，其浓度均为1ng/μL，阴性样品是不含玉米内州萎蔫病菌 基因组的介质溶液。

本发明还提供一种用于玉米内州萎蔫病菌快速检测的环介导等温扩增试剂盒的使用方法，其特征在于，将玉米内州萎蔫病菌加入到环介导等温扩增反应体系，使用环介导等温扩增荧光检测系统实现同步等温扩增并实时监测反应管中的荧光信号，获得等温扩增曲线和溶解曲线。所述的环介导等温扩增实时荧光反应25μL反应体系包括：环介导等温扩增反应预混液15μL，DEPC水2μl，引物组混合液7μl，DNA模板1μl，阴性对照中以阴性样品代替DNA模板。扩增曲线平台荧光值高于本底噪音信号且溶解曲线为单一尖锐峰的判定位阳性结果；扩增曲线平台荧光值高于本底噪音信号但溶解曲线不是单一锐锋的判定为非特异性扩增；扩增曲线平台荧光值低于本底噪音信号的判定为阴性结果。环介导等温扩增荧光检测系统的扩增程序为：①64℃，60min，②98℃-80℃，0.05℃/s，10min。

一种用于玉米内州萎蔫病菌快速检测的环介导等温扩增试剂盒的使用方法，还包括灵敏度的检验，其方法为，用DEPC水稀释玉米内州萎蔫病菌的阳性样品(1ng/μL)，浓度梯度为1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL，进行灵敏度实验，通过环介导等温扩增荧光检测系统实现等温扩增并实时监测反应管中的荧光信号，得出其灵敏度。

附图说明

图1 溶液中内、外引物摩尔浓度比的优化图。其中管1-6中内、外引物摩尔浓度配比为2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1，12∶1；管7为阴性对照。

图2 LAMP法检测反应温度结果图。其中管1-8反应槽所设置温度为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃。

图3 LAMP法检测玉米内州萎蔫病菌灵敏度反应结果图。其中管1-7分别为1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg；8为阴性对照。

图4 PCR检测玉米内州萎蔫病菌灵敏度反应结果图。其中M为DNA markerl；1-5分别为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg；6为超纯水。

图5 LAMP法检测玉米内州萎蔫病菌特异性的扩增曲线图。其中1-7分别是玉米内州萎蔫病菌，玉米细菌性枯萎病菌，玉米细菌性叶斑病，马铃薯环腐病菌，苜蓿细菌性萎蔫病菌，小麦苗枯病菌，番茄溃疡病菌；8为阴性对照。

图6 LAMP法检测玉米内州萎蔫病菌特异性的溶解曲线图。其中1-7分别是玉米内州萎蔫病菌，玉米细菌性枯萎病菌，玉米细菌性叶斑病，马铃薯环腐病菌，苜蓿细菌性萎蔫病菌，小麦苗枯病菌，番茄溃疡病菌；8为阴性对照。

具体实施方法

下面结合附图，对本发明的具体实施方法做进一步详细描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例

1.试验材料与方法

1.1试验材料

玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.Nebraskensis)、玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartii)、玉米细菌性叶斑病(Acidovoraxavenae subsp.avenae)、马铃薯环腐病菌(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)、苜蓿细菌性萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.Insidiosus)、小麦苗枯病菌(Clavibacter fangii)、番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)均购自美国ATCC。

1.2引物设计

运用在线软件PrimerExplorer V4(http：//primerexplorer.jp/e/)设计玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增实时荧光检测方法的特异性引物组(表1)：包括一组内引物(FIP，BIP)和一对外引物(F3，B3)，其引物序列为：

1.3重组质粒的提取及验证

在3mL预先加入氨苄青霉素的LB培养基中接入100uL的甘油菌液，37℃，160rpm振荡培养8-10h，参照质粒小提试剂盒的说明提取质粒，进行测序鉴定，其余菌液加入30％甘油后放入-80℃保存。用Nanophotometer仪器测量质粒浓度。

1.4引物组溶液中内、外引物摩尔浓度比的优化

引物组溶液的内外引物摩尔浓度比例分别为2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1，进行环介导等温扩增实时荧光反应，根据获得扩增曲线的时间来确定内外引物摩尔数的最优比例。

1.5环介导等温扩增实时荧光法反应温度的优化

按照图1中所获得的最佳引物摩尔浓度比配制引物组溶液，加入环介导等温扩增实时荧光反应体系中，设定反应温度在60℃～67℃区间，相邻温度间间隔1℃，每个温度反应30min，98℃～80℃，0.05℃/s，10min，根据获得扩增曲线的时间来分析结果。

1.6环介导等温扩增实时荧光法检测玉米内州萎蔫病菌的灵敏度试验

将玉米内州萎蔫病菌克隆质粒pGM-T-27822的DNA稀释1000倍，用紫外分光光度计测其OD₂₆₀的值，依照如下公式计算出质粒DNA的浓度：

μg/μl＝OD₂₆₀×50×X×10^-3

OD₂₆₀：波长260nm处的吸光度值；X：样品的稀释倍数

通过公示计算出克隆质粒pGM-T-27822DNA浓度为2500ng/μl，按照25μl的反应体系换算后可得反应管中模板的最终浓度为100ng，经一系列10倍梯度稀释(1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg)，以各稀释度样品作为模板，进行环介导等温扩增实时荧光反应。获得扩增曲线平台荧光值高于本底噪音信号判定位阳性结果，否则判定为阴性结果或非特异性扩增。

1.7环介导等温扩增实时荧光法检测玉米内州萎蔫病菌的特异性试验

利用玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增实时荧光法引物组溶液，分别以玉米内州萎蔫病菌和6种常见病原菌的DNA为模板，按照上述反应体系的要求，进行环介导等温扩增实时荧光反应，通过扩增曲线的获得与否来判定引物组溶液的特异性。

2.结果与分析

2.1引物组溶液中内、外引物摩尔浓度比的优化结果

将引物组中的内引物与外引物摩尔浓度比依次按照2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1的比例配制成引物组溶液，加入到环介导等温扩增实时荧光反应体系中，通过实时荧光检测仪实时监测反应管中的荧光信号，结果如图1所示3号反应管中最先出现扩增曲线，因此确定其最优摩尔浓度比为6∶1.

2.2环介导等温扩增实时荧光法反应温度的优化结果

按照图1中所获得的最佳引物摩尔浓度比配制引物组溶液，加入环介导等温扩增实时荧光反应体系中，反应温度依次为60℃～67℃，结果如图2所示，温度为64℃时最先扩增，因此该反应的最优温度为64℃。

2.3环介导等温扩增实时荧光法检测玉米内州萎蔫病菌的灵敏度试验

将换算浓度后的玉米内州萎蔫病菌克隆质粒pGM-T-27822的DNA依次进行10倍梯度稀 释(1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg)，通过环介导等温扩增实时荧光反应对不同稀释度的DNA模板进行检测。同时将上述终浓度的质粒作为DNA模板依次进行10倍梯度稀释(10ng、1ng、100pg、10pg、1pg)以F3，B3作为引物进行PCR扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图3所示，图3中，60min内环介导等温扩增实时荧光法可检测到100fg/反应，而图4中PCR只能检测到10pg/反应，经比较可见，所建立的环介导等温扩增实时荧光法检测灵敏度比PCR的灵敏度高两个数量级。由此可见，本研究建立的环介导等温扩增实时荧光法灵敏性较高。

2.4环介导等温扩增实时荧光法检测玉米内州萎蔫病菌的特异性试验

分别以玉米内州萎蔫病菌及6种常见病原菌的DNA为模板，用玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增实时荧光法引物组溶液进行扩增反应，结果如图5、6所示，只有玉米内州萎蔫病菌出现扩增曲线，且溶解曲线为单一尖锐峰，其他病原菌均无扩增，说明该引物组溶液的特异性良好。