玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增实时荧光检测试剂盒及使用方法与流程

技术特征：

1.一套用于玉米内州萎蔫病菌快速检测的环介导等温扩增引物组，其特征在于，可用于玉米内州萎蔫病菌快速检测的环介导等温扩增反应。

所述玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增引物组，其特征在于，包括一组内引物(FIP，BIP)和一对外引物(F3，B3)，其引物序列为：

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2.如权利1中所述的玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增引物组，其特征在于，用于玉米内州萎蔫病菌快速检测的方法包括：1)直接荧光目视方法，其特征在于，在扩增反应前向体系中加入钙黄绿素作为荧光指示剂，可直接通过肉眼观测结果，反应管中反应液呈绿色的为阳性结果，不呈绿色的为阴性结果；2)紫外光照射荧光目视方法，其特征在于，扩增反应后反应管中反应液在紫外光照射下，呈红色荧光的为阳性结果，不呈红色的为阴性结果；3)凝胶电泳方法，其特征在于，反应后反应液电泳时有特征梯形条带者为阳性结果，无特征梯形条带者为阴性结果；4)实时荧光检测方法，其特征在于，反应时实时检测反应管中的荧光信号，获得等温扩增曲线和溶解曲线，进而判定检测结果；5)实时浊度检测方法，反应时实时监测反应管中的浊度信号，获得等温扩增曲线，进而判定检测结果；6)微全分析方法，其特征在于，样品裂解、核酸提取纯化、等温扩增和检测均集成在微全分析系统上自动完成，结果判定方法包括前述的直接荧光目视方法、紫外光照射荧光目视方法、凝胶电泳方法、实时荧光检测方法、实时浊度检测方法，该微全分析系统由微膜片泵(阀)驱动，通过程序控制微膜片泵(阀)的开启与闭合实现微流体样品的驱动控制。

3.一种如权利要求1所述的玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增引物组用于玉米内州萎蔫病菌快速检测的试剂盒，主要由玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增引物组溶液、环介导等温扩增反应预混液、玉米内州萎蔫病菌阳性样品和各玉米内州萎蔫病菌阴性样品构成，其特征在于，采用实时荧光检测方法，实现对玉米内州萎蔫病菌的快速检测。

所述玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增引物组溶液，其特征在于，是由其中的内引物与外引物按2∶1-12∶1的比例配制成，优选比例为6∶1。所述环介导等温扩增反应预混液，其特征在于，由Bst聚合酶、dNTP、甜菜碱、MgSO₄、缓冲溶液和显色试剂构成。所述玉米内州萎蔫病菌阳性样品，其特征在于，可以是由玉米内州萎蔫病菌人工合成片段构建的重组质粒，其浓度均为1ng/μL。所述各玉米内州萎蔫病菌阴性样品，其特征在于，不含玉米内州萎蔫病菌基因 组片段。

4.一种如权利要求3所述的玉米内州萎蔫病菌快速检测试剂盒，其特征在于，将八联管作为一个整体，分别加入环介导等温扩增反应预混液15μL，引物组混合液7μl，待测阳性样品或者阴性样品1μl，剩余加入DEPC水补足至25μL。所述实时荧光检测方法，其特征在于，使用环介导等温扩增荧光检测系统实现同步等温扩增并实时检测反应管中的荧光信号，获得等温扩增曲线和溶解曲线，荧光检测系统的扩增程序为：①64℃，60min，②98℃-80℃，0.05℃/s，10min。

5.如权利要求1所述的引物组溶液、如权利要求2所述的玉米内州萎蔫病菌结果分析方法和如权利要求3、4所述的玉米内州萎蔫病菌试剂盒及环介导等温扩增检测方法包括但不限定于采用微全分析技术；其特征在于，待测试样浸提液的细胞裂解、核酸提取纯化、核酸扩增和检测均集成在微全分析系统上自动完成，该微全分析系统由微膜片泵(阀)驱动，通过程序控制微膜片泵(阀)的开启与闭合实现微流体样品的驱动控制。