基于单粒子脂质体计数的数字核酸杂交分析方法及试剂盒与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种基于单粒子脂质体计数的数字核酸杂交分析方法及试剂盒。

背景技术：

目前一项检测和定量核酸的新技术主要是数字PCR技术(dPCR)，被应用到了核酸含量的检测技术中。数字PCR一般包括两部分内容，即PCR扩增和荧光信号分析。在PCR扩增阶段，将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应；在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集；最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。

数字PCR技术的物理分隔方式，它的灵敏度(分辨率)和准确性有待进一步提高和优化，在临床诊断中需要进行大量的比较和验证实验。其分析的样品通量很低，基本每块芯片上万个反应单元都是针对单一样本的分析。荧光检测技术的局限性限制了多个芯片的同时检测，因此该技术目前在常规基因表达分析中不具备优势。基于精密仪器和复杂芯片的数字PCR技术成本高昂，也是制约其广泛应用的一个原因。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种灵敏度与准确性相对较高的基于单粒子脂质体计数的数字核酸杂交分析方法及试剂盒。

一种基于单粒子脂质体计数的数字核酸杂交分析方法，包括如下步骤：

将脂质体与目标链混合，充分反应后，得到捕获液，其中，所述脂质体包括纳米金及包覆于所述纳米金上的脂质膜，在所述捕获液中，所述目标链连接于所述脂质膜上，所述脂质体与所述目标链的摩尔比满足，充分反应后，部分脂质体上有且只有一条目标链，部分脂质体上没有目标链，连接有目标链的脂质体为目标对象，没有连接上目标链的脂质体为非目标对象；

处理所述捕获液，以使所述目标对象与所述非目标对象分离，得到含目标对象的目标液；

处理所述目标液，以使目标对象中的目标链从脂质体上脱离，得到中间液；

处理所述中间液，以使所述中间液中的目标链及脂质体分离，得到含脂质体的检测溶液；以及

采用生物质谱检测所述检测溶液，其中，在检测的过程中，单个脂质体线性通过质谱离子传输管。

在其中一个实施例中，所述脂质膜的成分包括检测磷脂、捕获磷脂及构型磷脂，所述捕获磷脂上修饰有第一连接基团，所述构型磷脂的亲水端上修饰有巯基，所述构型磷脂通过所述巯基与所述纳米金相互作用而包裹所述纳米金形成脂质膜内层，所述检测磷脂、所述捕获磷脂及所述构型磷脂形成磷脂双分子层包裹所述脂质膜内层形成所述脂质膜外层，所述第一连接基团暴露在所述脂质膜外层；

在得到所述捕获液的过程中，所述脂质体通过所述第一连接基团与所述目标链连接。

在其中一个实施例中，所述脂质体还包括分散于所述脂质膜上的稳定剂。

在其中一个实施例中，所述检测磷脂为DSPC、DAPC、DMPC、DPPC或DSPE，所述构型磷脂为DSPC-SH、DAPC-SH、DMPC-SH、DPPC-SH或DSPE-SH，所述捕获磷脂为DSPC-PEG-R、DAPC-PEG-R、DMPC-PEG-R、DPPC-PEG-R或DSPE-PEG-R，R为第一连接基团，PEG的分子量为1500～3000；

及/或，所述检测磷脂、所述捕获磷脂、所述构型磷脂及所述稳定剂的摩尔比为100：5：5：0.5；

及/或，所述纳米金的粒径为20nm～120nm；

及/或，所述稳定剂为胆固醇。

在其中一个实施例中，所述脂质体的制作方法包括如下步骤：

提供原料，所述原料包括检测磷脂、捕获磷脂及构型磷脂或者所述原料包括检测磷脂、捕获磷脂、构型磷脂及稳定剂；

将所述原料放入反应容器中，并于反应容器中加入混合溶剂，混匀，得到 混合物料，所述混合溶剂为体积比为3:1的氯仿与甲醇；

将盛有混合物料的反应容器接在旋转蒸发仪上，减压旋蒸，至反应容器内表面生成一层均匀透明的薄膜，然后往反应容器中通惰性气体保护；以及

在生成有薄膜的反应容器内加入用超纯水分散的洗涤过的纳米金，溶胀0.5～1.5h，探头超声0.5～1.5h，再离心，去上清液，反复离心三次，即得到所述脂质体。

在其中一个实施例中，在得到所述捕获液的过程中，包括如下步骤：

提供脂质体、目标链及连接件，所述连接件一端修饰有第二连接基团，另一端用于连接所述目标链，所述连接件能通过所述第二连接基团与所述第一连接基团之间的反应与所述脂质体连接；

将所述脂质体与所述连接件混合，充分反应后，得到第一反应液；以及

将所述目标链加入所述第一反应液中，充分反应后，得到所述捕获液，其中，在所述捕获液中，所述连接件一端连接所述目标链，另一端连接所述脂质体。

在其中一个实施例中，所述第一连接基团为炔基或叠氮基，所述第二连接基团为叠氮基或炔基，所述第一连接基团与所述第二连接基团能通过叠氮基与炔基之间的点击化学反应连接。

在其中一个实施例中，所述连接件包括中部修饰有光裂解基团的光裂解链，所述光裂解链一端修饰有所述第二连接基团，另一端用于连接所述目标链；

在处理所述目标液，以使目标对象中的目标链从脂质体上脱离，得到中间液的过程中，采用紫外光照射目标液进行光裂解反应，使得目标链从脂质体上脱离。

在其中一个实施例中，所述连接件还包括捕获链，所述捕获链一端用于连接所述光裂解链远离所述第二连接基团的一端，另一端用于连接目标链。

在其中一个实施例中，在得到所述目标液的过程中，包括如下步骤：

提供报告探针及具有磁性的沉淀件，所述报告探针一端用于连接所述目标链远离所述脂质体的一端，另一端用于连接所述沉淀件；

在所述捕获液中加入所述报告探针及所述沉淀件，充分反应后，得到第二 反应液，其中，在所述第二反应液中，所述报告探针一端连接所述目标链远离所述脂质体的一端，另一端连接所述沉淀件；以及

对所述第二反应液进行离心处理，得到固体物质，再将所述固体物质分散于溶剂中，得到所述目标液。

在其中一个实施例中，在得到所述检测溶液的过程中，包括如下步骤：

提供吸磁件；以及

在所述中间液中加入所述吸磁件，所述吸磁件与所述沉淀件结合，上层液体即为所述检测溶液。

在其中一个实施例中，所述报告探针用于连接沉淀件的一端修饰有生物素，所述沉淀件上修饰有链霉亲和素；

所述沉淀件为磁珠。

一种用于检测目标链的试剂盒，包括：

脂质体，所述脂质体包括纳米金及包覆于所述纳米金上的脂质膜；

中部修饰有光裂解基团的光裂解链，且光裂解链的一端能连接所述脂质体，另一端能连接目标链；

捕获链，能与目标链远离脂质体的一端连接；以及

具有磁性的沉淀件，能与捕获链远离脂质体的一端连接。

在其中一个实施例中，还包括捕获链，所述捕获链一端能连接光裂解链远离脂质体的一端，另一端能连接目标链；

及/或，还包括能与所述沉淀件结合的吸磁件。

上述方法使用过量的脂质体去捕获目标链，使得目标液中的每一个脂质体上有且只有一条目标链。再将脂质体与目标链分离，得到含脂质体的检测溶液，而检测溶液中的脂质体的数目即为目标链的数目。再采用生物质谱检测检测溶液，并使得单个脂质体线性通过质谱离子传输管(也即，一段时间内只有一个脂质体通过质谱离子传输管)。而一个脂质体通过质谱离子传输管时，可以转化为一个或多个m/z峰(特征峰)，选择监测其中一个m/z峰(该被监测的m/z峰为表征峰)，就能得到相应的质谱图。在该质谱图中，一个表征峰就表示一个脂质体，也即表示一条目标链。通过数质谱图中的表征峰的个数，即可获得目标 链的数目，从而实现对目标链的定性及定量分析。采用生物质谱作为检测手段，由于生物质谱具有灵敏度高、选择性强、准确性好等特点，因此，上述试剂盒对于检测目标链具有较高的灵敏度与准确性。

附图说明

图1为一实施方式的基于单粒子脂质体计数的数字核酸杂交分析方法的工作原理图；

图2为脂质体的TEM图；

图3为质谱检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对基于单粒子脂质体计数的数字核酸杂交分析方法及试剂盒进行进一步描述。

一种基于单粒子脂质体计数的数字核酸杂交分析方法，包括如下步骤：

步骤S110，将脂质体与目标链混合，充分反应后，得到捕获液。其中，脂质体包括纳米金及包覆于纳米金上的脂质膜。在捕获液中，目标链连接于脂质膜上。脂质体与目标链的摩尔比满足，充分反应后，部分脂质体上有且只有一条目标链，部分脂质体上没有目标链，连接有目标链的脂质体为目标对象，没有连接上目标链的脂质体为非目标对象。

步骤S120，处理捕获液，以使目标对象与非目标对象分离，得到含目标对象的目标液。

步骤S130，处理目标液，以使目标对象中的目标链从脂质体上脱离，得到中间液。

步骤S140，处理中间液，以使中间液中的目标链及脂质体分离，得到含脂质体的检测溶液。

步骤S150，采用生物质谱检测检测溶液，其中，在检测的过程中，单个脂质体线性通过质谱离子传输管。

上述方法使用过量的脂质体去捕获目标链，使得目标液中的每一个脂质体 上有且只有一条目标链。再将脂质体与目标链分离，得到含脂质体的检测溶液，而检测溶液中的脂质体的数目即为目标链的数目。再采用生物质谱检测检测溶液，并使得单个脂质体线性通过质谱离子传输管(也即，一段时间内只有一个脂质体通过质谱离子传输管)。而一个脂质体通过质谱离子传输管时，可以转化为一个或多个m/z峰(特征峰)，选择监测其中一个m/z峰(该被监测的m/z峰为表征峰)，就能得到相应的质谱图。在该质谱图中，一个表征峰就表示一个脂质体，也即表示一条目标链。通过数质谱图中的表征峰的个数，即可获得目标链的数目，从而实现对目标链的定性及定量分析。采用生物质谱作为检测手段，由于生物质谱具有灵敏度高、选择性强、准确性好等特点，因此，上述试剂盒对于检测目标链具有较高的灵敏度与准确性。

如图1所示，在本实施方式中，脂质体210包括纳米金212及包覆于纳米金212上的脂质膜214。脂质膜214的成分包括检测磷脂、捕获磷脂及构型磷脂。捕获磷脂上修饰有第一连接基团214a。构型磷脂的亲水端上修饰有巯基，构型磷脂通过巯基与纳米金212相互作用而包裹纳米金形成脂质膜内层。检测磷脂、捕获磷脂及构型磷脂形成磷脂双分子层包裹脂质膜内层形成脂质膜外层。第一连接基团214a暴露在脂质膜外层。其中，检测磷脂、捕获磷脂及构型磷脂的总量(总物质的量)以使每一纳米金212颗粒的外表面包覆有一层脂质膜214，脂质膜214将纳米金212密封即可。

构型磷脂的巯基能与纳米金颗粒结合，从而构型磷脂能包覆于纳米金上。而由于亲疏水作用，检测磷脂及捕获磷脂与构型磷脂能形成磷脂双分子层，从而检测磷脂及捕获磷脂也能包覆于纳米金上。捕获磷脂的第一连接基团214a暴露在脂质膜外层，也即第一连接基团214a位于脂质体210的外表面，从而使得脂质体210能通过第一连接基团214a与其他物质连接。

此时，在步骤S110中，也即在得到捕获液的过程中，脂质体210通过第一连接基团214a与目标链220连接。

进一步，在本实施方式中，检测磷脂为DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，二硬脂酰磷脂酰胆碱)、DAPC(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine，二花生酰基磷脂酰胆碱)、DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)、DPPC(dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，二棕榈酰磷脂酰胆碱)或DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylethanolamine)。捕获磷脂为DSPC-PEG-R、DAPC-PEG-R、DMPC-PEG-R、DPPC-PEG-R或DSPE-PEG-R，R为第一连接基团214a，PEG(聚乙二醇，polyethylene glycol)的分子量为1500～3000。构型磷脂为DSPC-SH、DAPC-SH、DMPC-SH、DPPC-SH或DSPE-SH，SH为巯基。

其中，检测磷脂、捕获磷脂及构型磷脂可以为同一种磷脂，也即可以分别为DSPC、DSPC-PEG-R及DSPC-SH。当然，检测磷脂、捕获磷脂及构型磷脂也可以为分别为三种不同的磷脂。

一个脂质体210通过质谱离子传输管可以转化为一个检测磷脂的m/z峰、一个捕获磷脂的m/z峰及一个构型磷脂的m/z峰。当检测磷脂、捕获磷脂及构型磷脂为同一种磷脂时，只有一种m/z峰，该m/z峰即为表征峰；当检测磷脂、捕获磷脂及构型磷脂为三种不同磷脂时，有三种m/z峰，各自的物质的量决定了其m/z峰的峰高，某一磷脂的物质的量越大，对应的m/z峰越高，检测灵敏度越高。通过检测其中一种磷脂的m/z峰(表征峰)的数目(通常检测检测磷脂的m/z峰的数目)，即可获得脂质体210的数目。

进一步，在本实施方式中，检测磷脂、捕获磷脂及构型磷脂的摩尔比为100：5：5。在实际应用中，由于检测磷脂上没有修饰功能基团，选择检测检测磷脂的m/z峰的个数来实现定量分析相对较简单，而检测磷脂的量相对较多，可以确保有较高的检测灵敏度。可以理解，在其他实施方式中，检测磷脂、捕获磷脂及构型磷脂的摩尔比也可以为其他值。

进一步，在本实施方式中，纳米金212的粒径为20nm～120nm。

进一步，在本实施方式中，脂质体110还包括稳定剂。稳定剂分散于脂质膜214上。稳定剂可以有效防止脂质膜214包裹的纳米金212发生团聚，影响实验精确度。优选的，检测磷脂、捕获磷脂、构型磷脂及稳定剂的摩尔比为100：5：5：0.5，稳定剂为胆固醇。

进一步，在本实施方式中，第一连接基团214a为叠氮基或炔基。

进一步，在本实施方式中，脂质体210是自己制备的，具体包括如下步骤：

步骤S111，提供原料。原料包括检测磷脂、捕获磷脂及构型磷脂；或者原料包括检测磷脂、捕获磷脂、构型磷脂及稳定剂。

具体的，原料包括检测磷脂、捕获磷脂、构型磷脂及稳定剂，检测磷脂、捕获磷脂、构型磷脂及稳定剂的摩尔比为100：5：5：0.5。可以理解，在其他实施方式中，原料包括检测磷脂、捕获磷脂及构型磷脂，检测磷脂、捕获磷脂及构型磷脂的摩尔比为100：5：5。优选的，检测磷脂为DSPC，捕获磷脂为DSPE-PEG2000-NH-CO-(CH2)2-C≡CH，构型磷脂为DSPE-SH，稳定剂为胆固醇。

步骤S112，将原料放入反应容器中，并于反应容器中加入混合溶剂，混匀，得到混合物料，混合溶剂为体积比为3:1的氯仿与甲醇。其中，反应容器为圆底烧瓶。

步骤S113，将盛有混合物料的反应容器接在旋转蒸发仪上，减压旋蒸，至反应容器内表面生成一层均匀透明的薄膜，然后往反应容器中通惰性气体保护。

具体的，减压旋蒸的温度为35～45℃，压强为0.06MPa，氩气保护10min。

步骤S114，在生成有薄膜的反应容器内加入用超纯水分散的洗涤过的纳米金，纳米金的粒径为20～120nm，溶胀0.5～1.5h，探头超声0.5～1.5h，再离心，去上清液，反复离心三次，即得到脂质体。

进一步，在本实施方式中，在步骤S110中，也即在得到捕获液的过程中，包括如下步骤：

步骤S115，提供脂质体210、目标链220及连接件230。连接件230一端修饰有第二连接基团230a，另一端用于连接目标链220。连接件230能通过第二连接基团230a与第一连接基团214a之间的反应与脂质体210连接。

步骤S116，将脂质体210与连接件230混合，充分反应后，得到第一反应液。

步骤S117，再将目标链220加入第一反应液中，充分反应后，得到捕获液。其中，在捕获液中，连接件230一端连接目标220链，另一端连接脂质体210。

进一步，在本实施方式中，第二连接基团230a为叠氮基或炔基，第一连接 基团214a与第二连接基团230a能通过叠氮基与炔基之间的点击化学反应连接。

在本实施方式中，脂质体210与目标链220通过连接件230连接，也即脂质体210与目标链220为间接连接。可以理解，在其他实施方式中，连接件230可以省略，此时，可以根据待检测的目标链220的特性(例如，目标链220上具有某一特定基团)，在脂质体210上修饰与该特定基团相应的基团，以便脂质体210与目标链220连接。

进一步，在本实施方式中，连接件230包括中部修饰有光裂解基团(PC，含o-硝基的分子)230b的光裂解链232，光裂解链232一端修饰有第二连接基团230a，另一端用于连接目标链220。第一连接基团214a为炔基，第二连接基团230a叠氮基。

在步骤S116中，也即在点击化学反应中，包括如下步骤：

步骤S1161，将脂质体210分散于超纯水中，得到脂质体溶液。

步骤S1162，在脂质体210溶液中加入硫酸铜、L-抗坏血酸钠、水合红菲绕啉二磺酸钠、磷酸缓冲液以及光裂解链232，在惰性气体的保护下，于室温下充分反应，其中，脂质体210、光裂解链232、硫酸铜、L-抗坏血酸钠及水合红菲绕啉二磺酸钠的摩尔比为1000:1000:10:100:2。优选的，在氩气的保护下，于室温下反应0.5～2h。

需要说明的是，一个脂质体210上具有多个捕获磷脂，其中一个或多个捕获磷脂上连接有光裂解链232，也即，一个脂质体210上可以同时具有多条光裂解链232。但可以控制脂质体210的浓度远大于目标链220的浓度，确保部分脂质体210上有且只捕获一条目标链220(目标对象)，部分脂质体210没有捕获到目标链220(非目标对象)。

进一步，在本实施方式中，连接件230还包括捕获链234，捕获链234一端用于连接光裂解链232远离第二连接基团230a的一端，另一端用于连接目标链220。光裂解链232通过捕获链234与目标链220连接，也即光裂解链232与目标链220间接连接。由于光裂解链232相对较贵，为了使得同一条光裂解链232能应用于几组不同的实验中，以检测不同的目标链，从而设计捕获链234，以降低实验成本。

而且分别选用不同的脂质体210(检测磷脂不同)，设计不同的捕获链234(也可以设计不同的光裂解链232)，从而可以在同一反应溶液中同时捕获不同的目标探针，通过质谱对多种目标探针进行同时检测，从而实现高通量检测。

在步骤S120，也即在得到目标液的过程中，包括如下步骤：

步骤S122，提供报告探针240及具有磁性的沉淀件250。报告探针240一端用于连接目标链220远离脂质体210的一端，另一端用于连接沉淀件250。

步骤S124，在捕获液中加入报告探针240及具有磁性的沉淀件250，充分反应后，得到第二反应液。其中，在第二反应液中，报告探针240一端连接目标链220远离脂质体210的一端，另一端连接沉淀件250。

步骤S126，对第二反应液进行离心处理，得到固体物质，再将固体物质分散于溶剂中，得到目标液。在本实施方式中，溶剂为超纯水。

具体的，在本实施方式中，报告探针240用于连接沉淀件250的一端修饰有生物素240a，沉淀件250上修饰有链霉亲和素250a。优选的，沉淀件250为磁珠。

进一步，在本实施方式中，在捕获液中加入沉淀件250(得到固液混合物)并于37℃下进行反应20～40min。再采用超纯水对固液混合物进行多次清洗，得到固体物质，然后将固体物质放入超纯水里，即得到含目标对象的目标液。

其中，脂质体210、光裂解链232、捕获链234、报告探针240及目标链220的摩尔比为1000:1000:1000:1000:1，从而使得部分脂质体210有且只捕获一条目标链220，部分脂质体210没有捕获到目标链220。报告探针240与沉淀件250的质量比1:500，沉淀件250过量。

在步骤S130中，也即在得到中间液的过程中，采用紫外光照射目标液进行光裂解反应，使得目标链220从脂质体210上脱离。具体的，在紫外光交联仪中进行光裂解20～40min。

可以理解，在其他实施方式中，当不使用光裂解链232时，也可以采用其他方式使得目标链220从脂质体210上脱离，例如，可以采用链置换的方式、酶切的方式等。

在步骤S140中，也即在得到检测溶液的过程中，包括如下步骤：

步骤S142，提供吸磁件260。

步骤S144，在中间液中加入吸磁件260，吸磁件260与沉淀件250结合，上层液体即为检测溶液。具体的，吸磁件260为磁力架。

吸磁件260使得沉淀件250沉入底部，不需要进行离心处理，即可将中间液中的目标链220及脂质体210分离，得到含脂质体210的检测溶液。可以理解，在其他实施方式中，吸磁件260可以省略，此时，可以通过离心的方式使得中间液中的目标链220及脂质体210分离。

在步骤S150中，也即在采用生物质谱检测检测溶液的过程中，如果检测溶液的浓度较大，可以先将检测溶液稀释到一定浓度后再进生物质谱，以保证单个脂质体210线性通过质谱离子传输管。

由于生物质谱具有灵敏度高、选择性强、准确性好等特点，将注入的检测溶液中的脂质体转化为相应的磷脂的m/z峰，又由于脂质体的量为目标链的量的1000倍，可以保证光裂解下来的一个脂质体上捕获有一个目标链，从而可以通过计数m/z峰(特征峰)个数来计算出目标链浓度。

在本实施方式中，目标链220是根据“前列腺癌细胞中谷胱苷肽S转移酶P1(Glutathione S Transferase Pi，GSTP1)基因启动子区”人工合成的。

目标链220为

5’-CGC GAT GTT TCG GCG CGT TAG TTC GTT GCG TAT ATT TCG TTG CG-3’

光裂解链232为

5’-N₃-TTTTTTTT-PC-TTTT-PC-TTTTTTGGCAGCACCGACGTAGAC-3’，PC为光裂解基团；

捕获链234为

5’-CGCGCCGAAACATCGCGGTCTACGTCGGTGCTGCC-3’；

报告探针240为

5’-Biotin-TTTTTTCGCAACGAAATATACGCAACG-3’，Biotin为生物素。

目标链220、光裂解链232、捕获链234及报告探针240均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

可以理解，在实际应用中，可以人工提取目标链220，具体步骤如下：

提供组织样品，将组织样品剪碎，加入磷酸缓冲液，混匀，再按照QIAamp Mini spin column试剂盒的说明操作，得到中间品。再按CpGenomeTM快速DNA修饰试剂盒修饰DNA，然后将从组织提取的基因组DNA以Alu I核酸内切酶处理，得到不同大小的DNA片段，即得到目标链。

其中，按照QIAamp Mini spin column试剂盒的说明操作的具体过程如下：将25mg组织样品剪碎，置于2mL离心管中，加入不超过80μL的PBS，匀浆器处理，再加入100μL Buffer ATL。加入20μL proteinase K，振荡处理20s，56℃水浴至组织完全裂解。短时离心以去除离心管盖内沿液体。加入200μLBuffer AL，振荡15s，70℃水浴10min，短时离心。加入200μL乙醇(96％-100％)，振荡15s，短时离心。小心将以上所得混合液小心加入到QIAamp Mini spin column中将离心柱放入2mL收集管中。盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min。将离心管取出，放入一支洁净的2mL收集管中。丢弃收集管及其中液体，小心加入500μL Buffer AW1到QIAamp Mini spin column中，再以6000×g离心1min。将离心管取出，放入一支洁净的2mL收集管中。丢弃收集管及其中液体。小心加入500μL Buffer AW2到QIAamp Mini spin column中。盖紧离心管盖，以20000×g(14000rpm)离心3min。将离心管取出，放入一支洁净的2mL收集管中，丢弃收集管及其中液体。将QIAamp Mini spin column置入一支洁净1.5mL收集管中，丢弃收集管及其中液体。小心在QIAamp Mini spin column中加入200μL超纯水。室温下静置1min，6000×g(8000rpm)离心1min。将收集管盖好即得。

按CpGenomeTM快速DNA修饰试剂盒修饰DNA的具体过程如下：10μg DNA加100μL超纯水再加入7.0μL 3mol/L NaOH混匀，37℃孵育10min，加入550μL DNA修饰液混匀，水浴箱内50℃孵育16～20h。冰上放置上述样品5min，加750μL结合缓冲液混匀。将样品加入DNA纯化柱中央，5000r/min离心30s，丢弃余液。加750μL 1×洗涤缓冲液，12000r/min离心1min。加50μL 20mmol/L的NaOH(溶剂为体积分数为90％的乙醇)在纯化柱中央的膜上，室温孵育10min，12000r/min离心30s，弃液。加750μL 1×洗涤缓冲液， 12000r/min离心30s，重复。纯化柱装入1.5mL离心管中，加30～45μL冼脱缓冲液在膜中央，孵育1min，12000r/min离心1min。离心管中即冼脱下来的DNA。

在本实施方式中，还提供一种用于检测目标链的试剂盒，包括：

脂质体，脂质体包括纳米金及包覆于纳米金上的脂质膜。

中部修饰有光裂解基团的光裂解链，且光裂解链的一端能连接脂质体，另一端能连接目标链。

捕获链，能与目标链远离脂质体的一端连接。

具有磁性的沉淀件，能与捕获链远离脂质体的一端连接。

捕获链，捕获链一端能连接光裂解链远离脂质体的一端，另一端能连接目标链。

能与沉淀件结合的吸磁件。

以下为具体实施例部分：

1、捕获磷脂的制备

将DSPE-PEG2000-NH₂和己炔酸在PH＝4.7～6.0的条件下，经DCC(Dicyclohexylcarbodiimide，二环己基碳二亚胺)、NHS(N-Hydroxysuccinimide，N-羟基琥珀酰亚胺)催化发生酯化反应，生成的产物用氯仿萃取，得到DSPE-PEG2000-NH-CO-(CH2)2-C≡CH溶液。

2、脂质体的制备：

(1)10mL干净的圆底烧瓶中加入物质的量之比为100：5：5：20的DSPC、DSPE-PEG2000-NH-CO-(CH2)2-C≡CH、DSPE-SH和胆固醇(其中，DSPC的物质的量为2.5μmol)，溶于4mL的氯仿-甲醇(体积比为3：1)溶剂里，混匀。

(2)将圆底烧瓶接在旋转蒸发仪上，在35～45℃的温度下，缓慢地旋转，减压(0.06MPa)蒸馏至圆底烧瓶内表面生成一层均匀透明的薄膜，氩气保护10min。

(3)在圆底烧瓶中加入用2mL超纯水(电阻≥18.25MΩ)分散的洗涤过的500μL粒径为60nm的纳米金，50℃溶胀1h。

(4)探头超声1h(3Φ，10％，2s on，5s off)。

(5)5500rpm，15℃，离心6min，去上清液。反复离心三次，去掉未包埋上纳米金的磷脂。沉淀溶于1mL的超纯水中。

(6)检测脂质体是否合格，结果如图2所示。从图中可以明显看出纳米金颗粒上包覆有一侧脂质膜，脂质体合格。

3、点击化学：

取50μL制得的脂质体加入1.5mL的离心管中，再加入60pmol CuSO₄、600pmol L-抗坏血酸钠以及120pmol水合红菲绕啉二磺酸钠、500μL PBS缓冲液(0.5M NaCl)以及6nmol的光裂解链。冲入氩气，室温下反应1h。

4、DNA链交联：

在发生点击化学反应后的离心管中加入6pmol的捕获链、6pmol的报告探针、6fmol的目标链以及适量PBS缓冲液(0.5M NaCl)，37℃的条件下反应1h。

5、链霉亲和素与生物素交联：

将修饰有链霉亲和素的磁珠用PBS缓冲液洗三次，加入5μL于发生DNA链交联反应后的体系中，37℃的条件下反应20min。

6、光裂解获取目标链：

用超纯水洗三次，除去没有交联上的脂质体。在紫外光交联仪中进行光裂解30min。用磁力架除去磁珠，上层液体即为目标链溶液。

7、生物质谱检测：

将所得目标链溶液进质谱(LTQ Orbitrap Velos)检测，直接进样，检测参数如下：ESI，Ion Trap；喷雾电压:3.8kv；SIM scan，mass range：790.63±1.00；max inject time：10ms；流速：5μL/min，毛细管温度：280℃；鞘气流速：15，雾化气、辅助气体均为0，信号采集10min，取10min内得到的峰的个数(DSPC的m/z峰的个数)作为定量依据。

检测结构如图3所示，图3中显示有46个峰。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和 改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。