基于聚胸腺嘧啶为模板生成铜纳米粒子的高灵敏度DNA荧光分析方法与流程

本发明属于荧光分析应用领域，具体涉及一种基于聚胸腺嘧啶(PolyT)为模板生成铜纳米粒子(CuNPs)的高灵敏DNA荧光分析方法。

背景技术：

高灵敏度高特异性的DNA检测技术在疾病诊断、药物开发、食品安全、环境监测等方面得到了广泛的应用，灵敏度、特异性、检测速率的提高，成本的降低以及更简便的过程控制是目前DNA检测技术发展的趋势。与早期的DNA检测技术如比色法、凝胶电泳、紫外光谱等检测方法相比，采用荧光法的DNA传感器由于其高灵敏度、低成本及便携性等特点受到了越来越多的关注。

文献1(李宏业，范树国、刘玉乐、陈刚、王寰宇，改良聚丙烯酰胺凝胶电泳检测DNA，细胞生物学杂志，1999,21,201-202。)利用改良的聚丙烯酰胺凝胶电泳法，用30％丙烯酰胺，10×TBE，TEMED，10％过硫酸铵配制成10mL的3.5％凝胶，灌胶后采用15V/cm的电压梯度电泳，利用银染法对拟南芥基因组DNA为模板的PCR产物及其克隆于pGEM7Z上的重组质粒限制酶切产物进行检测，DNA片段得到很好的分离，条带显示清晰。目前，这种聚丙烯酰胺凝胶电泳法对于DNA的检测技术已经发展成熟，然而此法需要制胶、聚合酶链式反应，电泳、染色等一系列的过程，消耗时间长，劳动强度大，染料毒性大，银染的DNA片段不能直接回收纯化，且无法用于痕量及突变DNA的检测，因此具有很大的局限性。

文献2(Fernando Patolsky,Yossi Weizmann,Itamar Willner.Redox-Active Nucleic-Acid Replica for the Amplified Bioelectrocatalytic Detection of Viral DNA.JACS.2002,124,770-772.)将短链DNA探针固定于金电极表面，其与待测的环状病毒DNA部分杂交，在聚合酶的作用下，以长链上未杂交部分的DNA作为母链进行DNA复制，复制原料中的dUTP标记有电活性物质羧酸二茂铁，从而得到具有二茂铁标记的寡聚核苷酸修饰电极，在电极上引入电信号。为了获得放大的检测信号，用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的氧化来加速电子传递。该实验通过测定峰电流的变化，达到特异性的检测病毒DNA的目的。目前，利用二茂铁的电活性来对DNA进行检测的方法已经得到了广泛的应用，然而电化 学法背景噪音大，重现性差，且难以用于单核苷酸多态性检测。

技术实现要素：

本发明的目的是为了检测痕量的DNA片段，包括对完全互补、单碱基错配、三碱基错配和对照序列的鉴别，提供一种高灵敏度高特异性DNA荧光分析方法。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种基于聚胸腺嘧啶为模板生成铜纳米粒子的高灵敏DNA荧光分析方法，包括如下步骤：

步骤一、将链霉亲和素磁珠(SA-MB)悬浮在PBS缓冲液中，加入3’端修饰生物素的捕获DNA(cDNA)，反应结束后进行磁分离并用PBS缓冲液清洗多次；

步骤二、将固定了捕获DNA的磁珠复悬在Tris-HCl缓冲液中，加入目标DNA(tDNA)片段，杂交结束后进行磁分离并用Tris-HCl缓冲液清洗多次；

步骤三、杂交后的磁珠复悬在1×TdT缓冲液中，加入TdT、脱氧胸腺三磷酸(dTTP)，催化结束后加热以终止反应；

步骤四、再将步骤三中的反应混合物转移到含NaCl的3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)缓冲液中，加入抗坏血酸钠及硫酸铜溶液后，进行荧光分析。

步骤一中，所述的链霉亲和素磁珠的浓度为0.5～1.5mg/mL，cDNA的浓度为0.5～1.5μM，cDNA的序列为5’-AAC CAT ACA ACC TAC TAC CTC A-Biotin-3’，反应条件为室温振荡0.5～1.5h。

步骤二中，所述的tDNA浓度为0.1nM～10nM，选用序列为5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’的完全互补的DNA片段，序列为5’-TGA GGT AGT AGG TTG TGT GGT T-3’的单碱基错配的DNA片段，序列为5’-TGA GGT ATT AGA TTG TGT GGT T-3’的三碱基错配的DNA片段或序列为5’-ACT TAC CTT TGC TCA TTG ACG A-3’的对照DNA片段；反应条件为37℃下振荡0.5～1.5h。

步骤三中，所述的TdT的浓度为0.5～1.5U/μL，dTTP的浓度为2～3mM，反应条件为37℃下振荡5～7h，反应终止条件为60～80℃下加热5～15min。

步骤四中，所述的抗坏血酸钠溶液浓度为4～6mM，硫酸铜溶液浓度为1nM～0.1M，荧光激发波长为320～360nm。

与现有技术相比，本发明的显著优点是：

1、采用荧光法进行分析具有很高的灵敏度，且背景噪声小、成本低、方法简便、分析时间短。

2、通过TdT在tDNA末端原位聚合胸腺嘧啶，荧光信号得到了显著放大。

3、以PolyT为模板，加入还原剂及二价铜离子后能够立即生成CuNPs，极大程度上简化了分析过程。

4、此方法具有很高的灵敏度，且对单核苷酸多态性具有很好的鉴别能力。

附图说明

图1是本发明基于PolyT为模板生成CuNPs的高灵敏DNA荧光分析示意图。

图2是本发明实施例2中的的透射电镜图(其中，a为对照序列分析结果，b为互补序列分析结果)。

图3是本发明实施例3中的铜离子浓度优化图(其中，a为荧光光谱的比较，b为峰值的比较)。

图4是本发明实施例4中的CuNPs荧光稳定特性图(其中，a为荧光光谱随时间的变化，b为峰值随时间的变化)

图5是本发明实施例5中的对不同浓度tDNA片段的检测特性图(其中，a为荧光光谱的比较，b为峰值的比较)。

图6是本发明实施例6中的对不同序列DNA片段的荧光响应对比图(其中，a为荧光光谱的比较，b为峰值的比较)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的说明，其目的是为更好理解本发明的内容，但所举的实施例并不限制本发明的保护范围：

实施例1：基于PolyT为模板生成CuNPs的紫外和荧光光谱表征。

采用本发明所述的基于PolyT为模板生成CuNPs的高灵敏DNA荧光分析，其过程示意图见图1。将1mg/mL SA-MB悬浮在20μL的PBS缓冲液中，加入1μM的3’端修饰生物素的cDNA(序列为5’-AAC CAT ACA ACC TAC TAC CTC A-Biotin-3’)，室温振荡反应1h，反应结束后进行磁分离并用PBS缓冲液清洗多次，再将固定了cDNA的磁珠复悬在20μL的Tris-HCl缓冲液中，加入10nM互补DNA片段(序列为5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’)，37℃下振荡反应1h，杂交结束后进行磁分离并用Tris-HCl缓冲液清洗多次，杂交后的磁珠复悬在20μL的1×TdT缓冲液中，加入1U/μL的TdT、2.5mM的dTTP，37℃下振荡反应6h，催化结束后在70℃下加热10min以终止反应，将反应混合物转移到 300μL含NaCl的MOPS缓冲液中，加入5mM抗坏血酸钠及1mM硫酸铜溶液后，进行紫外和荧光分析，荧光激光波长为340nm。结果表明：基于PolyT为模板生成CuNPs具有良好的荧光特性，该荧光分析方法具有可行性及高效性。

实施例2：基于PolyT为模板生成CuNPs的透射电镜表征。

采用本发明所述的基于PolyT为模板生成CuNPs的的高灵敏DNA荧光分析，操作步骤如同上述实施例1。其中，选用10nM序列为5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’的互补DNA片段作为目标分析物，10nM序列为5’-ACT TAC CTT TGC TCA TTG ACG A-3’的DNA片段作为对照，其透射电镜图如附图2所示，其中，a是对照组，b是实验组，由图可见，CuNPs仅在tDNA与cDNA互补配对后才会生成。

实施例3：铜离子浓度优化。

采用本发明所述的基于PolyT为模板生成CuNPs的的高灵敏DNA荧光分析，操作步骤如同上述实施例1。其中，选用10nM序列为5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’的互补DNA片段作为目标分析物，改变铜离子浓度依次为1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1mM、10mM、100mM，分析不同的铜离子浓度对本发明DNA荧光分析结果的影响，其分析结果如附图3所示，其中，a为荧光光谱的比较，b为峰值的比较，由图可知，铜离子浓度为1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM时，随着浓度的增加，荧光强度显著增强，而在浓度高于1mM的情况下，随着浓度的增加，荧光强度显著降低，因此在实际检测过程中，选用100μM作为适宜的铜离子浓度。

实施例4：CuNPs荧光稳定性实验。

采用本发明所述的基于PolyT为模板生成CuNPs的的高灵敏DNA荧光分析，操作步骤如同上述实施例1。其中，选用10nM序列为5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’的互补DNA片段作为目标分析物，铜离子浓度为100μM，检测产生的CuNPs的荧光随时间的变化，其结果如附图4所示，其中，a为荧光光谱随时间的变化，b为峰值随时间的变化，由图可知，在静置1h以后，CuNPs仅下降不到35％的荧光，具有较好的荧光稳定性，因此适用于荧光分析应用。

实施例5：基于PolyT为模板生成CuNPs的的高灵敏DNA荧光分析对不用浓度DNA片段的荧光响应特性。

采用本发明所述的基于PolyT为模板生成CuNPs的的高灵敏DNA荧光分析，操作步骤如同上述实施例1。其中，选用序列为5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’的互补DNA片段作为目标分析物，浓度分别为0.1nM、0.2nM、0.4nM、0.6nM、0.8nM、1nM、2nM、4nM、6nM、8nM、10nM，分析不同浓度tDNA片段的荧光响应特性，分析结果如附图5所示，由图可知，在该检测浓度范围内，荧光强度随着tDNA浓度的增加而增加，具有良好的线性关系，检测极限为98.2pM，荧光响应特性较好且灵敏度较高。

实施例6：基于PolyT为模板生成CuNPs的的高灵敏DNA荧光分析对不用序列DNA片段的荧光响应特性。

采用本发明所述的基于PolyT为模板生成CuNPs的的高灵敏DNA荧光分析，操作步骤如同上述实施例1。其中，以完全互补(5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’)、单碱基错配(5’-TGA GGT AGT AGG TTG TGT GGT T-3’)、三碱基错配(5’-TGA GGT ATT AGA TTG TGT GGT T-3’)、对照(5’-ACT TAC CTT TGC TCA TTG ACG A-3’)的DNA片段作为目标分析物，对不同序列DNA片段进行荧光分析，分析结果如附图6所示，由图可知，本发明的DNA荧光分析方法对于不同序列的DNA片段具有不同的荧光响应，因而可以有效区分单核苷酸多态性，具有高特异性和选择性。