动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液的制作方法

本发明涉及一种动物间充质干细胞免疫抑制能增强的无血清培养液，在基础培养液中添加增殖因子和特定添加物，用于动物间充质细胞的无血清培养，能令动物间充质干细胞增殖后的免疫抑制能作用增强。

背景技术：

间充质干细胞除具有多种分化潜能外，还具有免疫调节功能。体外实验表明，间充质干细胞在体外可以抑制T细胞的增殖，使T细胞维持在一个休眠的状态，而不是凋亡。间充质干细胞在炎症细胞因子刺激后，对免疫系统表现出很强的抑制作用。由于间充质干细胞具备很强的免疫调节功能和低免疫原性，因此间充质干细胞是治疗移植和自身免疫病等难以治疗的的免疫系统疾病的研究重点。间充质干细胞不仅自身免疫原性很低，对各种各样的免疫细胞(T细胞、B细胞、NK细胞、树状细胞)的机能也有影响。因此，对与免疫反应相关疾病的治疗，使用间充质干细胞是令人期待的。

美国FDA批准的与间充质干细胞有关的临床试验，主要包括以下几个方面：造血干细胞移植、组织损伤的修复、自身免疫性疾病治疗、作为基因治疗的载体。中国也已开始用间充质干细胞治疗临床上一些难治性疾病，如脊髓损伤、脑瘫、肌萎缩侧索硬化症、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、克隆氏病、中风、糖尿病、糖尿病足、肝硬化等，根据初步的临床报告，间充质干细胞对这些疾病的治疗都有明显的疗效。

再生医疗中移植后的免疫抗宿主反应是一个严重的问题，为避免该免疫排斥反应，需要使用免疫抑制剂。由于间充质干细胞具有免疫抑制作用，如果能够利用这种作用，或许可以不用使用免疫抑制剂。因此，制造不含动物成分、拥有免疫抑制作用的间充质干细胞无血清培养液是不可缺少的。

培养液是供给动植物细胞、组织及微生物生长繁殖用的人工配制的养料，基础培养液中一般均含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及生长素和水等。传统的动物细胞的培养需要在基础培养基中加入5～20％的胎牛血清(FBS)等异种动物来源的血清，该血清用作促进细胞在体外生长增殖的营养来源，同时也作为激素、因子等生物活性物质的供给源。也就是说，通常，动物细胞的生长均有赖于血清的存在，在普通培养液中，如不加血清，绝大部分细胞便不能增殖。

上述应用方案的缺点是：

使用动物间充质干细胞血清培养液，血清价格昂贵；

因生产批号不同会造成批间差，导致产品和实验结果的重现性差；

需去除血清本身带入的蛋白成分，必要时还需要提纯，使操作变得复杂化；

血清中可能会混入未知病原体(病毒等)，进而存在污染培养细胞的可能。

公开号为CN102703385A，公布日为2012年10月3日，发明名称为“一种间充质干细胞培养液”的中国发明专利申请公开了一种动物间充质干细胞无血清培养液；以及公开号为CN103805562A，公布日为2014年5月21日，发明名称为“培养胎盘间充质干细胞的无血清培养基”的中国发明专利申请公开了一种胎盘间充质干细胞培养扩增的无血清培养基；但是这些发明的无血清培养液成分较简单，对动物间充质干细胞的生长和扩增的营养促进作用有限。

前述等涉及间充质干细胞培养液的专利都没有考虑到对所培养间充质干细胞免疫抑制作用的影响，可能使所培养间充质干细胞免疫抑制作用降低。

技术实现要素：

本发明为解决上述问题，提供一种动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液，添加特定物质，增强间充质干细胞免疫抑制能。该细胞培养液能用于动物间充质干细胞的培养，具备无血清细胞培养液的优点并且维持和增强间充质干细胞的免疫抑制能力。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明的配方在基础培养液中添加各种添加因子组成；

优选地，本发明动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液中，所述基础培养液为Ham’s F12、DMEM、RPMI-1640中的一种或多种混合组成；

上述基础培养液中添加有无血清培养液常用的基础成分BSA、胰岛素、转铁蛋白，并添加有地塞米松；

本发明动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液中添加三种增殖因子；

优选地，所述增殖因子为FGF、PDGF-BB、TGF-β、HGF；

优选地，所述增殖因子具体种类：FGF为FGF-2(bFGF)、PDGF为PDGF-BB或PDGF-AB、TGF-β为TGF-β3；

本发明动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液中添加一种或多种脂质；

优选地，所述脂质为二硫代磷酸、溶血磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、磷脂酰甘油中的一种或多种；

本发明动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液中添加一种或多种脂肪酸；

优选地，所述脂肪酸为亚油酸、油酸、丙氨酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、棕榈酰酸、硬脂酸；

本发明动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液可选择性添加胆固醇；

本发明动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液中添加一种或多种脂质抗氧化剂；

优选地，所述脂质抗氧化剂为维生素E、还原型谷胱甘肽、2-巯基乙醇；

本发明动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液特定添加物中含有IFN-γ和TNF-a；

本发明动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液中添加一种表面活性剂；

优选地，所述表面活性剂为Pluronic-F(泊洛沙姆)和Tween80；

本发明动物间充质干细胞免疫抑制能增强培无血清养液中添加一种锂盐化合物；

优选地，所述锂盐化合物为氯化锂；

本发明动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液中添加BSA；

本发明动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液中添加一种含硒化合物；

优选地，所述含硒化合物为亚硒酸盐。

本发明的有益效果是：

1.可以增强所培养间充质干细胞的免疫抑制能力；

2.可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性；

3.避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，避免血清组分对实验研究的影响；

4.有效促进有丝分裂原，缩短细胞群体倍增时间，可以促进细胞增殖，抑制细胞凋亡；

5.使细胞培养的条件更稳定，维持细胞在体外较长时间生长繁殖，有利于体外培养细胞的分化；

6.可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化；

7.使间充质干细胞扩增时细胞膜更加稳定，且可稳定细胞的信号传导途径；

8.添加剂中引入高分子非离子表面活性剂，减少机械剪切力对细胞的损害，对细胞有保护作用，同时可减少白蛋白的使用，节约成本；

9.不仅适合于人体任何组织来源的间充质干细胞的培养扩增，而且理论上适用于几乎全部哺乳动物来源的间充质干细胞的培养扩增。

附图说明

图1-a为显示利用10％FBS-MSCGM培养液共培养人骨髓间充质干细胞与鼠来源活化T细胞，针对抗CD3和CD28刺激的T细胞增殖反应结果图。图1-b为显示利用本发明动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液共培养人骨髓间充质干细胞与鼠来源活化T细胞，针对抗CD3和CD28刺激的T细胞增殖反应结果图。

图2-a为显示利用10％FBS-MSCGM培养液共培养人骨髓间充质干细胞与鼠来源活化T细胞，针对抗PMA/Ionomycin刺激的T细胞增殖反应结果图。图2-b为显示利用本发明动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液共培养人骨髓间充质干细胞与鼠来源活化T细胞，针对抗PMA/Ionomycin刺激的T细胞增殖反应结果图。

图3为骨髓由来hMSC对鼠淋巴细胞混合反应(MLR)下的T细胞增殖的免疫抑制效果图。针对鼠淋巴混合反应刺激的T细胞增殖反应，人MSC培养第3天的免疫抑制效果(图3-a)；针对鼠淋巴混合反应刺激的T细胞增殖反应，人MSC培养第4天的免疫抑制效果(图3-b)。

图4-a显示应用本发明间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液培养人脂肪间充质干细胞第8天后细胞生长状态的显微镜检图；图4-b显示应用10％FBS-MEM培养液培养人脂肪间充质干细胞第8天后细胞生长状态的显微镜检图。

图5(人滑膜组织间充质干细胞不同培养液培养比对结果)为应用两种本发明间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液，两种无血清培养液所含增殖因子种类不同，分别培养人滑膜间充质干细胞，培养第八天后的细胞增殖情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。

实施例1：

取人骨髓来源间充质干细胞与鼠来源活化T细胞共培养，所用培养液分别为10％FBS-MSCGM培养液和本发明动物间充质干细胞无血清培养液(SF-MSCGM)进行培养，本发明SF-MSCGM组成如下：基础培养液+增殖因子(bFGF、HGF、TGF-β3、PDGF-BB)+CD+胆固醇+VE+卵磷脂+地塞米松+转铁蛋白+亚硒酸+BSA+胰岛素+INF-γ+TNF-α。针对抗CD3和CD28刺激的T细胞增殖反应，结果显示用本发明无血清培养液培养的人间充质干细胞具有免疫抑制能增强作用(图1-a，图1-b)。

实施例2：

取人骨髓来源间充质干细胞与鼠来源活化T细胞共培养，所用培养液分别为10％FBS-MSCGM培养液和本发明动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液(SF-MSCGM)，本发明SF-MSCGM组成成分同实施例1。针对抗PMA/Ionomyein刺激的T细胞增殖反应，结果显示用本发明无血清培养液培养的人间充质干细胞具有免疫抑制能增强作用(图2-a，图2-b)。

实施例3

骨髓由来hMSC对鼠淋巴细胞混合反应(MLR)下的T细胞增殖的免疫抑制效果实验。实验方法及使用细胞、使用的培养液均与实施例1相同。骨髓由来hMSC的处理方法是，96孔各孔内播种2×10⁴个密度的细胞；鼠脾脏细胞的活性化方法为，用2×10⁴密度的鼠脾脏细胞与鼠骨髓由来树状细胞(BMDC)共培养，后者播种密度是3.3×10⁴个/孔。实施例结果显示用本发明SF-MSCGM培养的骨髓由来hMSC同MSCGM培养液培养的骨髓由来hMSC一样有免疫抑制能；且用MSCGM培养液培养的骨髓由来hMSC从第 4天开始呈现免疫抑制效果(图3-b)，而用本发明SF-MSCGM培养的骨髓由来hMSC从第3天开始呈现免疫抑制效果(图3-a).也就是说，用本发明SF-MSCGM培养的骨髓由来hMSC更早呈现出免疫抑制效果。

实施例4

脂肪组织由来hMSC按以下顺序分离培养，采集人脂肪组织，用无血清DMEM培养液洗2～3回，用剪刀将洗净后的脂肪组织细细切碎，(1mm³)，用0.1～0.2％胶原蛋白酶溶液处理脂肪碎片，(37℃、30～60分)。用100mm滤膜过滤上述胶原蛋白酶处理过的脂肪组织，然后100×g、10分离心，分离脂肪组织由来hMSC。用Red lysis buffer(sigma R7757)处理分离后的细胞5～10分，再用无血清DMEM培养液洗2-3次。洗净后的细胞播种到plate(BECTON，DICKINSON(Falcon)353047)，分别用本发明SF-MSCGM和10％FBS-MEM进行培养。培养后第8天，每天用显微镜观察细胞形态。培养第8天后人脂肪来源间充质干细胞的增殖状态(图4-a)。

实施例5：

滑膜由来hMSC按以下顺序分离培养：采集人滑膜组织，用PBS洗净后，加入0.4％的胶原蛋白酶溶液10ml，37℃下1～4小时反应，过滤后离心离心后的滑膜由来hMSC用下列培养液培养，10％FBS-DMEM、培养液1、培养液2来培养。其中，培养液1组成如下：基础培养液+增殖因子(bFGF、PDGF-BB)+CD+胆固醇+VE+卵磷脂+地塞米松+转铁蛋白+亚硒酸+BSA+胰岛素+INF-γ+TNF-a；培养液2组成如下：基础培养液+增殖因子(bFGF、HGF、TGF-β3、PDGF-BB)+CD+胆固醇+VE+卵磷脂+地塞米松+转铁蛋白+亚硒酸+BSA+胰岛素+INF-γ+TNF-α。即，培养液1与培养液2相比少了两种增殖因子HGF和TGF-β3。从培养第12天开始(PO)，显微镜观察形态，计数。结果表明培养液2对细胞生长的促进效果是1的8倍左右，是10％FBS-DMEM的40倍。