一种RNA抑制剂及其在肿瘤中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种RNA抑制剂及其在肿瘤中的应用。

背景技术：

乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤,在欧美国家的发病率占女性恶性肿瘤的首位。我国虽然属乳腺癌相对低发地区,但发病率正逐年上升,在某些大城市已升至女性恶性肿瘤的首位,严重威胁着广大妇女身体健康和生活质量。乳腺癌的治疗包括手术治疗，内分泌治疗，化疗，放疗及分子靶向治疗，目前仍以根治性手术为基础。乳腺癌的靶向治疗研究已经成为乳腺癌治疗领域研究的热点。目前，乳腺癌的靶向药物主要包括两大类：HER2受体家族为靶点的药物(如曲妥珠单抗/赫赛汀、拉帕替尼等)和血管生成抑制剂(贝伐单抗/阿瓦斯汀)，其他靶向药物如法尼基转移酶抑制剂、泛素-蛋白酶通路等也相继问世。曲妥珠单抗适于HER2阳性乳腺癌的一线治疗。针对HER2新的靶向治疗药物越来越多地进入临床中，但仍有许多问题尚需解决，如HER2靶向治疗与放疗、化疗及内分泌治疗的相关性，靶向药物的耐药性、心脏毒性等。因此，迫切需要开发新的乳腺癌治疗性药物以补充或替代现有的乳腺癌治疗。

MicroRNA(miRNA)是一类大约22个核苷酸的非编码小RNA，其功能主要是负调控靶基因表达，通常与目标基因的mRNA 3'端非编码区互补配对诱导目标基因的翻译抑制，mRNA脱腺苷化和降解。MicroRNA-17-5p在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中高表达，与肿瘤的发生、发展有密切关系。

技术实现要素：

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种RNA抑制剂及其在肿瘤中的应用，可以用于预防肿瘤、治疗肿瘤、减小肿瘤重量、诱导肿瘤细胞凋亡和/或抑制肿瘤细胞增殖，具有预防和治疗效果好等优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种RNA抑制剂，具有SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

与SEQ ID NO.1所示的RNA序列具有90％同源性且具有相同或相近功能的RNA序列也在本发明的保护范围内。

本发明的有益效果是：上述的RNA序列通过促进肿瘤细胞凋亡，从而具有预防和治疗肿瘤效果好等优点。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述RNA抑制剂为经胆固醇修饰的且甲基化的miR-17-5p抑制剂。

采取上述方案的有益效果为：通过修饰后，可以提高RNA抑制剂的稳定性，有利于效果的发挥。

本发明提供一种编码上述的RNA抑制剂的DNA序列。

本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含上述的DNA序列。

本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞是一种可表达上述的RNA抑制剂的细胞。

进一步，所述宿主细胞包含上述的表达载体。

本发明提供一种上述的RNA抑制剂在预防肿瘤、治疗肿瘤、减小肿瘤重量、诱导肿瘤细胞凋亡和/或抑制肿瘤细胞增殖中的应用。所述肿瘤包括乳腺癌。尤其对乳腺癌的作用效果显著。

进一步，所述肿瘤细胞为所述肿瘤细胞为MDA-MB-231细胞。

本发明提供一种用于预防肿瘤、治疗肿瘤、减小肿瘤重量、诱导肿瘤细胞凋亡和/或抑制肿瘤细胞增殖的药物，所述药物含有上述的RNA抑制剂；或所述药物含有上述的RNA抑制剂以及药学上可接受的载体。

该药物可以采用常规方法制备成相应的制剂，如可制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。针剂、溶液等可以在无菌条件下制造。

本发明所述药物的用量和疗程可根据剂型、患者的年龄、疾病的轻重程度作适当调整，即具体施用剂量取决于多种因素，如给药方式、用药者健康状况等因素，这些都是在熟练医师技能范围内。

附图说明

图1为在MDA-MB-231荷瘤BALB/c-nu裸鼠肿瘤内注射合成的miR-17-5p的抑制剂，检测乳腺肿瘤生长情况，图1包括图1A和图1B。

图2为miR-17-5p的抑制剂在小鼠体内抑制miR-17-5p表达，促进caspase3的活化的结果,图2包括图2A和图2B。

图3为miR-17-5p的抑制剂抑制乳腺癌细胞增殖结果。

图4为miR-17-5p的抑制剂促进乳腺癌细胞凋亡结果，图4包括图4A和图4B。

图5为miR-17-5p的抑制剂促进乳腺癌细胞caspase-3和caspase-8活化的结果。

图6为miR-17-5p促进乳腺癌细胞增殖结果。

图7为miR-17-5p抑制乳腺癌细胞凋亡结果，图7包括图7A和图7B。

图8为miR-17-5p抑制乳腺癌细胞caspase-3和caspase-8活化的结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。例如：Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

反转录试剂盒购自宝生物工程有限公司，产品目录号BK3802；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学公司，货号：jk06642；细胞凋亡检测试剂盒购自invitrogen公司，货号：V13241；定量检测引物均在invitrogen公司合成。转染试剂lipo2000购自invitrogen，产品目录号11668019；人乳腺癌细胞MDA-MB-231(ATCC number：HTB-26^TM)购自ATCC；BALB/c-nu裸鼠：购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

实施例1、miR-17-5p的抑制剂在抑制乳腺癌的生长中的应用

一、miR-17-5p的抑制剂的获得

人工合成miR-17-5p抑制剂，具有胆固醇修饰和甲基化修饰，该miR-17-5p抑制剂(包括序列的合成以及胆固醇修饰和甲基化修饰)由在广州锐博生物科技有限公司完成。

miR-17-5p抑制剂的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1，即cuaccugcacuguaagcacuuug。

miR-17-5p抑制剂的阴性对照RNA(具有胆固醇修饰和甲基化修饰)购自广州锐博生物科技有限公司，为miRNA mimic Ncontrol#22，产品信息为：

基本信息：人、小鼠、大鼠通用的miRNA mimic Ncontrol#22。

成熟miRNA名称：cel-miR-239b-5p；

成熟miRNA编号：MIMAT0000295；

成熟miRNA序列：UUUGUACUACACAAAAGUACUG。

miR-17-5p抑制剂与miR-17-5p抑制剂的阴性对照RNA的修饰方法相同。

二、miR-17-5p的抑制剂在小鼠体内对乳腺癌生长的作用

将6-8周龄的雌性BALB/c-nu裸鼠；体重相近，小鼠均约为16g，在15只小鼠右后背部皮下注射用含有7X10⁶个MDA-MB-231细胞的0.1ml PBS悬液，当肿瘤体积达到约150mm³时，选取肿瘤大小相差不大的10只小鼠，随机分成2组，每组5只。

第一组(对照组)：每只小鼠瘤内注射20nm miR-17-5p的抑制剂的阴性对照RNA溶液50ul；每三天注射一次，共注射5次。

第二组(miR-17-5p的抑制剂组)：每只小鼠瘤内注射20nm miR-17-5p的抑制剂RNA溶液50ul；每三天注射一次，共注射5次。

同时每三天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，并按照公式计算肿瘤的体积，肿瘤体积V＝a×b²/2(a：肿瘤长径，b：肿瘤短径)。3天以后，将各组小鼠处死，检测肿瘤的重量，以及肿瘤组织中miR-17-5p的水平和活化caspase-3的水平。具体方法如下：

(1)小鼠肿瘤重量的检测

将各组小鼠处死后，小心剥出肿瘤，称量各组肿瘤的重量。

结果如图1所示，两组肿瘤重量统计结果，其中，对照组肿瘤平均重量为1.9g，miR-17-5p的抑制剂组肿瘤平均重量为1.1g，两组结果具有显著性差异(p<0.05)。

(2)检测肿瘤组织中miR-17-5p的水平，首先每只小鼠取一块相同大小的肿瘤组织于EP管中，然后加入Trizol裂解液，用研磨棒将肿瘤组织磨碎，室温裂解20分钟。4℃13000rpm离心30分钟。将上清吸入到1.5ml的进口EP管中，加入200ul无RNA酶污染的氯仿，混匀15秒，4℃13000rpm离心15分钟，吸取上清转移到一个新的1.5ml进口EP管中，加入500ul异丙醇-20℃沉淀过夜，4℃13000rpm离心10min，倒掉上清，用DEPC水配制的75％乙醇洗涤沉淀一次，晾干，50ul DEPC水溶解，按照说明书，用Taqman反转录试剂盒转录成cDNA，RT-PCR定量检测，检测引物在invitrogen公司合成。

Taqman反转录试剂盒：购自invitrogen，产品货号：4366596。

miR-17-5p探针：购自invitrogen，产品目录号：Cat.#4427975，货号：002308。

U6内参探针：购自invitrogen，产品目录号：Cat.#4427975，货号：01093。

结果见(如图2A)所示，与对照组相比，miR-17-5p的抑制剂组的miR-17-5p水平有明显下降，大约下降了70％。

(3)Westen-blot检测活化的caspase-3的水平。

免疫印迹检测步骤如下：

细胞裂解液(pH7.5)：20mM Hepes、150mM NaCl、0.5％Triton X-100、1mM EDTA、10％Glycerol、蛋白酶抑制剂抑制剂1片/50mL(抑制剂为多组分药片，属罗氏公司产品，货号04 693 132 001)。

抗体：一抗为cleaved caspase3(Asp175)Rabbit polyclonal antibody(Cell Signaling Technology，货号9661)。二抗为HRP标记的IgG抗体(购自SEROTEC公司，产品号为STAR124P)。

1)首先每只小鼠取一块相同大小的肿瘤组织于EP管中，然后加入细胞裂解液(pH7.5)，用研磨棒将肿瘤组织磨碎，4℃裂解30分钟。20mM Hepes、150mM NaCl、0.5％Triton X-100、1mM EDTA、10％Glycerol、蛋白酶抑制剂1片/50ml(抑制剂为多组分药片，属罗氏公司产品，货号04 693 132 001)。4℃13000rpm离心30分钟。收集裂解液，12000rpm低温离心15分钟，收集上清于1.5ml离心管中，测定蛋白浓度。

2)将离心后的液体各取30μl加入到上样孔中，SDS-PAGE电泳。

3)电泳结束按照“正极”白板+1层海绵垫子+3张滤纸+NC膜(光面朝上，正对着蛋白，赶走气泡)+电泳胶(赶走气泡)+3张滤纸+1层海绵垫子+黑板“负极”的顺序夹好夹板，放入转移电泳槽内，100V转膜120分钟。

4)取出硝酸纤维素膜(NC膜)，放入小槽内，1X TBST缓冲液(20mMTris-HCL，150mM NaCl，0.05％(v/v)Tween 20)洗5min/3次，摇床摇动。

5)5％封闭液(称量0.15g脱脂奶粉加入到3ml的TBST Buffer中)室温封闭2小时。

6)一抗(用5％封闭液1:1000稀释)室温孵育1小时。

7)回收一抗，TBST缓冲液洗NC膜5min/次×3次。

8)吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗(用5％封闭液1:2000稀释)，室温孵育1小时。

9)弃二抗，TBST缓冲液洗NC膜10min/次×3次。

10)暗室显影。

结果见(如图2B)，与对照组相比，miR-17-5p的抑制剂组的活化的caspase-3的水平水平有明显增加。

实施例2、miR-17-5p的抑制剂对乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖作用效果

实施例2中的control为miR-17-5p抑制剂的阴性对照RNA。

一、miR-17-5p抑制剂抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖

通过CCK-8试剂盒(购自日本同仁化学研究所，货号CK04-05)检测miR-17-5p的抑制剂对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的抑制作用。具体操作步骤如下：

1、将MDA-MB-231细胞铺到12孔板中，于37℃CO₂培养箱培养16-24小时，使细胞汇合度为60％左右，分别加入50pm miR-17-5p的抑制剂做为实验组和50pm的control(即miR-17-5p抑制剂的阴性对照)做为对照组。生长48小时以后，将细胞铺到96孔板中，汇合度为50％左右。每组细胞设三个复孔。

2、在不同的时间检测点(0，24，48，72,96小时)，每孔中加入CCK-8检测试剂10ul，37℃孵育2小时。

3、测定490nm的OD值。

与对照组相比，miR-17-5p的抑制剂在24，48,72,96小时能抑制MDA-MB-231细胞的增殖，细胞生长抑制率分别为31.2％，29.3％，25.8％，26.9％，结果见图3。

细胞生长抑制率计算公式为：(对照组OD490平均值-实验组OD490平均值)/对照组OD490*100％。

二、miR-17-5p的抑制剂促进乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡

运用Invitrogen公司生产的试剂盒 Apoptosis Assay kit对细胞染色后通过流式细胞仪分析结果。

具体的操作步骤如下：

1、将MDA-MB-231细胞铺到12孔板中，于37℃CO₂培养箱培养16-24小时，使细胞汇合度为60％左右，分别加入50pm miR-17-5p的抑制剂做为实验组和50pm的control(为miR-17-5p的抑制剂阴性对照)做为对照组。生长48小时以后，加入50ng/ml TRAIL(购自sigma-aldrich)处理8小时。

2、用胰酶常规消化细胞，PBS洗两遍(细胞数量一般为12孔板细胞数量的二分之一)。

3、用20ul 1x Annexin V缓冲液将细胞轻轻悬起来，加入1ul的FITC annexin V后轻轻混匀，室温避光染色15分钟。

1x Annexin V缓冲液、PI和FITC annexin V这三种试剂均由Invitrogen公司生产的试剂盒 Apoptosis Assay kit所提供。

4、向反应管中加入1x Annexin V缓冲液使终体积为200ul。加入浓度为100ug/ml的PI，使其终浓度为1ug/ml，室温避光染色3分钟左右即可上机检测。

细胞凋亡的计算方法：Annexin V单阳性的细胞与annexin V和PI双阳性的细胞占总细胞的百分比。

结果如图4所示，对照组凋亡大约为12.8％，miR-17-5p的抑制剂组细胞凋亡明显增加大约为23.26，两组之间差别有统计学意义(P<0.05)。说明miR-17-5p的抑制剂可以促进乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡。

三、miR-17-5p的抑制剂促进乳腺癌细胞凋亡分子caspase-3和caspase-8的活化

免疫印迹检测步骤如下：

1)将MDA-MB-231细胞铺到6孔板中，于37℃CO₂培养箱培养16-24小时，使细胞汇合度为60％左右，分别加入50pm miR-17-5p的抑制剂做为实验组和50pm的control做为对照组。生长48小时以后，将细胞上的培养基吸干净，并用冷的PBS缓冲液清洗两遍，在培养皿中加入细胞裂解液(0.8ml/10cm皿)，4℃裂解30分钟，收集裂解液，12000rpm低温离心15分钟，收集上清于1.5ml离心管中，测定蛋白浓度。

2)将离心后的液体各取30μl加入到上样孔中，SDS-PAGE电泳。

3)电泳结束按照“正极”白板+1层海绵垫子+3张滤纸+NC膜(光面朝上，正对着蛋白，赶走气泡)+电泳胶(赶走气泡)+3张滤纸+1层海绵垫子+黑板“负极”的顺序夹好夹板，放入转移电泳槽内，100V转膜120分钟。

4)取出硝酸纤维素膜(NC膜)，放入小槽内，1X TBST缓冲液(20mMTris-HCL，150mM NaCl，0.05％(v/v)Tween 20)洗5min/3次，摇床摇动。

5)5％封闭液(称量0.15g脱脂奶粉加入到3ml的TBST缓冲液中)室温封闭2小时。

6)一抗(用5％封闭液1:1000稀释)室温孵育1小时。

7)回收一抗，TBST缓冲液洗NC膜5min/次×3次。

8)吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗(用5％封闭液1:2000稀释)，室温孵育1小时。

9)弃二抗，TBS缓冲液洗NC膜10min/次×3次。

10)暗室显影。

结果见图5，与对照组相比，实验组活化的caspase-3,caspase-8蛋白水平明显升高。

实施例3、miR-17-5p对乳腺癌细胞MCF-7的增殖作用效果

一、miR-17-5p的获得

人工合成miR-17-5p，具有胆固醇修饰和甲基化修饰，miR-17-5p(包括序列的合成以及胆固醇修饰和甲基化修饰)在广州锐博生物科技有限公司合成。

miR-17-5p的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.2，即caaagugcuuacagugcagguag。

miR-17-5p的阴性对照RNA(具有胆固醇修饰和甲基化修饰)购自广州锐博生物科技有限公司，为miRNA mimic Ncontrol#22，产品信息如下：

基本信息：人、小鼠、大鼠通用的miRNA mimic Ncontrol#22；

成熟miRNA名称：cel-miR-239b-5p；

成熟miRNA编号：MIMAT0000295；

成熟miRNA序列：UUUGUACUACACAAAAGUACUG)。

人工合成miR-17-5p与miR-17-5p的阴性对照RNA的修饰方法相同。

二、miR-17-5p促进乳腺癌细胞MCF-7增殖

通过CCK-8试剂盒(购自日本同仁化学研究所，货号CK04-05)检测miR-17-5p对乳腺癌细胞MCF-7增殖的促进作用。具体操作步骤如下：

1、将MCF-7细胞铺到12孔板中，于37℃CO₂培养箱培养16-24小时，使细胞汇合度达到70％左右，将培养基换成opti-MEM(life technologies产品目录号：31985070)于37℃CO₂培养箱培养1小时。分别转染50pm miR-17-5p及50pm control,4-6小时细胞用PBS洗三次，并换成2ml 10％FBS的DMEM全培养基。

2、培养48小时以后，将转染后的MCF-7细胞铺到96孔板中，汇合度为50％左右。每组细胞设三个复孔。

3、在不同的时间检测点(0，24，48，72,96小时)，每孔中加入CCK-8检测试剂10ul，37℃孵育2小时。

3、测定490nm的OD值。

与对照组相比，miR-17-5p在24，48,72,96小时能促进MCF-7细胞的增殖，细胞生长增长率分别为35％，36％，48.5％，27.9％，结果见图6。

细胞生长增长率计算公式为：(实验组OD490平均值-对照组OD490平均值)/对照组OD490*100％。

三、miR-17-5p抑制乳腺癌细胞MCF-7细胞凋亡

运用Invitrogen公司生产的试剂盒 Apoptosis Assay kit对细胞染色后通过流式细胞仪分析结果。

具体的操作步骤如下：

1、将MCF-7细胞铺到12孔板中，于37℃CO2培养箱培养16-24小时，使细胞汇合度达到70％左右，将培养基换成opti-MEM于37℃CO2培养箱培养1小时。分别转染50pm miR-17-5p及50pm control(即miR-17-5p的阴性对照RNA),4-6小时细胞用PBS洗三次，并换成2ml 10％FBS的DMEM全培养基。生长48小时以后，加入50ng/ml TRAIL处理8小时。

2、用胰酶常规消化细胞，PBS洗两遍(细胞数量一般为12孔板的细胞数量的二分之一)。

3、用20ul 1x Annexin V缓冲液将细胞轻轻悬起来，加入1ul的FITC annexin V后轻轻混匀，室温避光染色15分钟。

4、向反应管中加入1x Annexin V缓冲液使终体积为200ul。加入浓度为100ug/ml的PI，使其终浓度为1ug/ml，室温避光染色3分钟左右即可上机检测。

细胞凋亡的计算方法：Annexin V单阳性的细与annexin V和PI双阳性的细胞的总和占总细胞的百分比。

结果如图7所示，对照组凋亡大约为18.4％，miR-17-5p组细胞凋亡明显降低大约为9.57，两组之间差别有统计学意义(P<0.05)。

四、miR-17-5p抑制乳腺癌细胞MCF-7凋亡分子caspase-3和caspase-8的活化

免疫印迹检测步骤如下：

1)将MCF-7细胞铺到12孔板中，于37℃CO₂培养箱培养16-24小时，使细胞汇合度达到70％左右，将培养基换成opti-MEM于37℃CO₂培养箱培养1小时。分别转染100pm miR-17-5p及100pm control(即miR-17-5p的阴性对照RNA),4-6小时细胞用PBS洗三次，并换成2ml 10％FBS的DMEM全培养基。

2)培养48小时以后，加入50ng/ml TRAIL处理8小时。将细胞上的培养基吸干净，并用冷的PBS缓冲液清洗两遍，在培养皿中加入细胞裂解液(0.8ml/10cm皿)，4℃裂解30分钟，收集裂解液，12000rpm低温离心15分钟，收集上清于1.5ml离心管中，测定蛋白浓度。

3)将离心后的液体各取30μl加入到上样孔中，SDS-PAGE电泳。

4)电泳结束按照“正极”白板+1层海绵垫子+3张滤纸+NC膜(光面朝上，正对着蛋白，赶走气泡)+电泳胶(赶走气泡)+3张滤纸+1层海绵垫子+黑板“负极”的顺序夹好夹板，放入转移电泳槽内，100V转膜120分钟。

5)取出硝酸纤维素膜(NC膜)，放入小槽内，1X TBST缓冲液(20mMTris-HCL，150mM NaCl，0.05％(v/v)Tween 20)洗5min/3次，摇床摇动。

6)5％封闭液(称量0.15g脱脂奶粉加入到3ml的TBST缓冲液中)室温封闭2小时。

7)一抗(用5％封闭液1:1000稀释)室温孵育1小时。

8)回收一抗，TBST缓冲液洗NC膜5min/次×3次。

9)吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗(用5％封闭液1:2000稀释)，室温孵育1小时。

10)弃二抗，TBS缓冲液洗NC膜10min/次×3次。

11)暗室显影。

结果见图8，与对照组相比，实验组活化的caspase-3,caspase-8蛋白水平明显降低。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。