双吡啶并吲哚并咪唑酮丁酰-Lys-氨基葡萄糖，其制备，活性和应用的制作方法

本发明涉及[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys-氨基葡萄糖，涉及它的制备方法，涉及它的抗肿瘤作用以及抗炎活性，因而本发明涉及它在制备抗肿瘤药物和抗炎药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

技术背景

肿瘤是局部组织的细胞异常增生而形成的新生物。所有的恶性肿瘤总称为癌症。恶性肿瘤严重威胁着人类健康。在临床肿瘤的手术治疗、放疗和化疗中，化疗应用最广泛，发明疗效好和毒副作用低的抗肿瘤新药一直是药物研究的热点。在抗肿瘤新药研究中，发明人曾公开下面结构的化合物(式中AA为氨基酸残基)按1μmol/kg剂量腹腔单次给药，每天一次，连续给药7天具有抗肿瘤作用。

发明人并不满意这种疗效。经过5年研究，发明人发现在该结构中的AA-OBzl用Lys-氨基葡萄糖代替，不仅可以增强抗肿瘤活性，而且可以获得额外的抗炎活性。根据这些研究结果，发明人提出了本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个内容是提供下式的[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys-氨基葡萄糖。

本发明的第二个内容是提供[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys-氨基葡萄糖的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)L-色氨酸在硫酸的催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合制备 (S)-2，3，4，9-四氢-β- 咔啉-3-羧酸；

(2)(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸与(Boc)₂O在N-甲基吗啉催化下反应得到N-Boc-(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸；

(3)在二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)存在下N-Boc-(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸与L-亮氨酸甲酯缩合为N-Boc-(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-亮氨酸甲酯；

(4)在4N氯化氢-乙酸乙酯溶液中N-Boc-(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-亮氨酸甲酯脱去Boc生成(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-亮氨酸甲酯；

(5)三乙胺催化(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-亮氨酸甲酯在甲醇和丙酮中避光反应得到[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酸甲酯；

(6)在2N NaOH水/甲醇溶液中[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酸甲酯生成[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酸；

(7)在DCC和HOBt存在下[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酸与L-Lys(Boc)-OBzl缩合为[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys(Boc)-OBzl；

(8)在甲醇溶液中[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys(Boc)-OBzl在Pd/C催化下H₂解脱苄得到[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys(Boc)；

(9)在DCC和HOBt存在下[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys(Boc)与氨基葡萄糖缩合为[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys(Boc)-氨基葡萄糖；

(10)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys(Boc)-氨基葡萄糖脱去Boc生成[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys-氨基葡萄糖。

本发明的第三个内容是评价[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys-氨基葡萄糖抑制S180肿瘤小鼠的肿瘤生长作用。

本发明的第四个内容是评价[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys-氨基葡萄糖对ICR小鼠炎症的抑制作用。

附图说明

图1[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys-氨基葡萄糖的合成路线.i)稀硫酸，40％甲醛；ii)(Boc)₂O，DMF，三乙胺；iii)DCC，HOBt，NMM；iv)氯化氢/乙酸乙酯，甲醇，丙酮，三乙胺。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)

将2500mL蒸馏水置于2500mL反应瓶中，缓慢加入1.3mL浓硫酸，搅拌2min，再向得到的稀硫酸中加入32.6g(159mmol)L-色氨酸，超声至完全溶解，再加入65mL 40％甲醛溶液，室温搅拌7h TLC(CH₂Cl₂∶CH₃OH，5∶1)监测终止反应。向反应液中缓慢滴加浓氨水，调pH至6，静置半小时，过滤，滤饼分别用蒸馏水，丙酮洗涤3次，收集滤饼转移至表面皿中晾干，最后得到31.5g(91％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)215[M-H]-。

实施例2制备N-Boc-(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)

将41.9g(193.9mmol)(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸加到300mL DMF中，冰浴搅拌下向悬浮液中加50.8g(233mmol)(Boc)₂O，然后滴加三乙胺调反应液pH至10，室温反应48h，每8h水泵抽气1次，TLC(CH₂Cl₂∶CH₃OH，5∶1)显示原料点消失，终止反应。减压浓缩，残留物用300mL乙酸乙酯溶解，用5％KHSO₄溶液洗3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h，过滤，滤液减压浓缩。残留物加入少量CH₂Cl₂超声为悬浮液后过滤，收集滤饼。滤液浓缩后重复上述步骤，直至溶液内无悬浮物终止。收集滤饼得33.94g(55％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)315[M-H]-。

实施例3制备N-Boc-(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-亮氨酸甲酯(3)

冰浴下将31.35g(99.7mmol)N-Boc-(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸溶解于250mL无水THF并加13.39g(99.7mmol)HOBt，然后加24.51g(119.6mmol)DCC与150mL无水THF的溶液，反应30min；再加19.87g(99.7mmol)L-亮氨酸甲酯，用NMM调反应液pH至9，室温反应24h。TLC(石油醚∶丙酮，3∶1)显示原料点消失，终止反应。过滤，滤液减压浓缩。残留物用250mL乙酸乙酯溶解，依次用饱和NaHCO₃溶液洗3次，饱和NaCl溶液洗3次，5％KHSO₄溶液洗3次，饱和NaCl溶液洗3次，5％NaHCO₃溶液洗 3次，饱和NaCl溶液洗3次。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h，过滤，滤液减压浓缩得43.42g(99％)标题化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)444[M+H]+。

实施例4制备[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酸甲酯(4)

冰浴搅拌下向21.0g(48.4mmol)N-Boc-(S)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-亮氨酸甲酯滴入220mL氯化氢-乙酸乙酯溶液(4N)，冰浴下反应4h TLC(石油醚∶丙酮，3∶1)监测原料点消失。抽干溶剂，残留物用110mL CH₃OH溶解，加入110mL丙酮，用三乙胺调反应液pH至9，室温避光反应2周。TLC(石油醚∶丙酮，3∶1)显示原料点消失，终止反应。反应液过滤，滤液减压浓缩有沉淀析出。再过滤，滤液减压浓缩又有沉淀析出。重复此步骤，直至无沉淀析出。收集滤饼。滤液浓缩后用400mL乙酸乙酯溶解，用饱和NaCl溶液洗8次，合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h后过滤，滤液减压浓缩，残留物用少量CH₃OH悬浮，过滤，收集滤饼。滤液重复此步骤，直至无沉淀析出。合并收集的所有滤饼，晾干得11.75g(65％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)384[M+H]+。

实施例5制备[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酸(5)

向10.32g(26.9mmol)[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酸甲酯加入300mL THF和100mL CH₃OH。冰浴搅拌下用4N NaO H调反应液的pH至12。冰浴反应48h TLC(石油醚∶丙酮，3∶1)监测原料点消失，终止反应。冰浴下用饱和KHSO₄溶液将反应液pH调至7。减压浓缩去除THF和CH₃OH后，冰浴下用5％KHSO₄溶液将残留物液的pH调至2，使析出大量无色沉淀。过滤，滤饼用少量蒸馏水洗涤，将滤饼晾干得9.45g(95％)标题化合物，为浅黄色固体。ESI-MS(m/e)368[M-H]-。

实施例6制备[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys(Boc)-OBzl (6)

将1.0g(2.74mmol)[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酸用70mL无水THF溶解，冰浴搅拌并加0.37g(2.74mmol)HOBt及0.62g(3.28mmol)EDC，反应30min后加入1.51g(2.74mmol)L-Lys(Boc)-OBzl。反应混合物用NMM调pH至9，反应21h，TLC(石油醚∶丙酮，3∶1)监测原料点消失，终止反应。过滤，滤液减压浓缩，残留物用150mL乙酸乙酯溶解，依次用饱和NaHCO₃溶液 洗3次，饱和NaCl溶液洗3次，5％KHSO₄溶液洗3次，饱和NaCl溶液洗3次，5％Na HCO₃溶液洗3次，饱和NaCl溶液洗3次。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h，过滤，滤液减压浓缩得1.65g(89％)标题化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)688[M+H]+。

实施例7制备[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys(Boc) (7)

向1.65g(2.4mmol)[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys(Boc)-OBzl(6)加入80mL CH₃OH溶解和170mg Pd/C，搅拌均匀，通入氢气，反应24h(石油醚∶丙酮，3∶1)监测原料点消失，终止反应。过滤，滤液减压浓缩后得1.42g(99％)标题化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)596[M-H]-。

实施例8制备[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys(Boc)-氨基葡萄糖(8)

按照实施例6的方法从600mg(1mmol)[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys(Boc)和860mg(4mmol)盐酸氨基葡萄糖得到25mg(3％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)793[M+Cl]-。

实施例9制备[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys-氨基葡萄糖(9)

冰浴搅拌下向30mg(0.04mmol)[(S)-2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基丁酰-Lys(Boc)-氨基葡萄糖加5mL氯化氢-乙酸乙酯溶液(4N)，反应30min后TLC(CH₂Cl₂∶CH₃OH∶HAc，15∶1∶1.5)监测原料点消失。反应混合物减压浓缩，残留物加无水乙醚抽干，得29mg(96％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)659.3690[M+H]+；Mp：261-263℃；¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ/ppm：11.02(s，1H)，7.80(m，4H)，7.40(m，1H)，7.02(m，1H)，4.30(m，5H)，3.92(m，3H)，3.45(m，5H)，3.29(m，1H)，3.05(m，2H)，2.06(m，1H)，1.91(m，2H)，1.58(m，6H)，1.30(m，6H)，0.92(d，6H)。

实验例1评价化合物9抑制S180小鼠肿瘤生长的活性

测定前将化合物9和阿霉素溶用生理盐水溶解。无菌条件下取接种于ICR小鼠10天的S180肉瘤，加适量生理盐水配制成瘤细胞数为1×10⁷个/mL的悬液，接种于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2mL，制造S180小鼠模型。肿瘤接种24h后，小鼠每日腹腔注射1次0.2mL化合物9的生理盐水溶液，剂量为0.01μmol/kg，连续注射9天，或每日腹腔注射1次0.2mL生理盐水，连续注射9天，或每日腹腔注射1次0.2mL阿 取各组小鼠的肿瘤称重。结果列入表1。结果表明0.01μmol/kg化合物9治疗的S180小鼠的瘤重显著轻于生理盐水治疗的S180小鼠的瘤重。此外，0.01μmol/kg化合物9治疗的S180小鼠的瘤重与2μmol/kg阿霉素治疗的S180小鼠的瘤重没有显著差异。说明化合物9具有良好的抗肿瘤活性。与发明背景中提到的已经公开的化合物相比，有效剂量降低了100倍，获得了意想不到的技术效果。

表1化合物对9对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

n＝15；a)与生理盐水比较p＜0.01，与阿霉素比较p＞0.05，

实验例2评价化合物9的抗炎活性

20±2g ICR雄性小鼠随机分为空白对照组、阳性用药组及给药组，小鼠使用前静息1天，操作间保持室内温度22℃，每组小鼠10只。一次口服生理盐水(剂量为0.2mL/20g)或阿司匹林的生理盐水溶液(剂量为1.11mmol/kg)或化合物9的生理盐水溶液给(剂量为1μmol/kg)30分钟后，往小白鼠的左耳外廓涂二甲苯(0.045mL)，1小时后将小鼠麻醉，颈椎脱臼处死。将小鼠的左和右耳剪下，用直径7mm的打孔器在两耳的相同位置，取圆形耳片，分别称重，求出两圆耳片的重量差作为肿胀度，以表示。本实验数据统计均采用t检验和方差分析。结果见表2。可以看出化合物9治疗组的鼠耳肿胀度与生理盐水组相比具有显著性差异，表明化合物9在发挥体内抗肿瘤作用下，还具有抗炎作用。与发明背景中提到的已经公开的化合物相比，抗炎症活性是意想不到的技术效果。

表2化合物9的抗炎活性评价

n＝10；a)与生理盐水组比较p＜0.01。