一种肉制品中氨基吡啶类致癌物的定量检测方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种氨基[!比啶类致癌物的定量检测方法，特别是涉及肉制品中氨基口比啶类致癌物的定量检测方法。
【背景技术】
[0002]在癌症的众多诱发因素中，饮食是不容忽视的一项。多项研究表明，长期摄入“过度”加工的肉制品可显著提高人类患癌的风险，而导致这一现象的主要原因已被证实可能与肉制品在加工过程中产生的小分子危害物密切相关。
[0003]氨基吡啶是一类在高温肉制品中最为常见的杂环芳香烃类致癌和致突变化合物，以2-氨基-1-甲基-6苯基咪唑并[4，5-b]吡啶为代表，简称为PhIP，此外还包括2-氨基-1，6-二甲基咪唑并[4，5-b]吡啶，简称为DMIP，2-氨基-1，5，6-三甲基咪唑并[4，5-b]吡啶，简称为TMIP，以及2-氨基-1-甲基-6-(4'-羟苯基)_咪唑并[4，5-b]吡啶，简称为V-OH-PhIP等。近年来的研究表明，氨基吡啶类化合物能显著诱导动物体内多器官患癌，同时还具有极强的致突变性。国际癌症研究机构于1993年已将包括PhIP在内的8种杂环芳香烃类化合物定义为2B级潜在致癌物，并将PhIP作为导致人类致癌的因素之一列入了国家毒理学计划中。高温肉制品中由氨基吡啶类化合物带来的饮食安全问题已引起人们广泛的关注，使得对于该化合物形成机制和抑制途径的研究成为焦点，而一套快速、准确的检测前处理方法的提出往往是各项进一步研究的基础。
[0004]在复杂的肉制品体系中，氨基吡啶的含量极少，通常以ng/g的水平存在。要想从复杂的肉基质中提取含量极少的氨基吡啶，选取一种合适的提取试剂，在最大程度保证提取率的基础上，尽可能的去除干扰UHPLC-MS/MS杂质有很大的技术难度，也给后期的净化提出了一定的要求。同时，由于氨基吡啶的含量极低，想要采用UHPLC-MS/MS对该化合物进行精确测定，必须要对该化合物进行富集，并去除基质的干扰，因此在提取后所采用的固相萃取等富集净化步骤也必不可少。
[0005]目前行业上还未有对于氨基吡啶检测的检测标准出现。而对于肉制品中氨基吡啶类化合物的测定前处理方法已有报道。现行传统检测主要基于液液萃取以及串联固相萃取来完成，简称液液串联固相萃取法。具体方法是:首先向粉碎后的肉粉末中加入一定量的高浓度碱溶液后均质，与固定剂硅藻土混合后采用如乙酸乙酯或二氯甲烷的有机试剂将氨基吡啶从碱液中萃取出来。再将萃取液先后通过PRS和Ci8两种固相萃取小柱净化，最后用UHPLC-MS/MS进行测定。但是在应用的过程中发现，该方法对目标化合物的加标回收率低，所得结果误差过大，且操作繁琐复杂，不利于大规模样本的测定。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种肉制品中氨基吡啶类致癌物的定量检测方法，该方法主要是利用UHPLC-MS/MS定量检测的原理，通过预处理的方法将肉制品中微量的氨基吡啶类致癌物富集和溶解，使其完全准确的被UHPLC-MS/MS分离和定量，达到定量检测的目的。所述定量检测方法包括肉制品预处理和UHPLC-MS/MS定量检测两部分，依次包括如下步骤:
[0007]制备肉制品的粉末；
[0008]加三氯乙酸水溶液并均质处理；
[0009]在频率为40 ± 1kHz超声提取15 ±5min后离心并取上清液；
[0010]调节上清液的pH值至3.0±0.5，并通过活化好的MCX小柱；
[0011]依次采用盐酸溶液、甲醇溶液淋洗和氨水-甲醇= l:9(v/v)混合液洗脱，得到洗脱液；
[0012]用氮气吹干洗脱液，加入乙腈复溶，并加入2.5mg/mL的咖啡碱甲醇溶液；
[0013]用UHPLC-MS/MS检测，对比标准品与样品图谱中的保留时间，确定样品图谱中对应的峰，并采用外标法对所得质谱图峰面积进行计算，最终得到肉制品中氨基吡啶类致癌物的含量。
[0014]其中，所述UHPLC-MS/MS检测条件为:Acquity UPLC BEH C18色谱柱;流动相A相为lOmmol/L的乙酸铵水溶液，其pH为6.8，流动相B相为乙腈;梯度洗脱程序:O?1min，10 %?15% 流动相B; 1?I Imin，15% ?100% 流动相B; ll?12min，100% 流动相B; 12?13min，100%?10%流动相8，13?1711^11，10%流动相8，流速为0.3111171^11，柱温为35°(:。质谱采用ESI源，正离子模式。源温为120°C，毛细管电压为3.5V，脱溶剂为氮气，脱溶剂气流速为650L/h，脱溶剂温度为350°C，锥孔气为氮气，锥孔气流速为60L/h，碰撞气为氩气，碰撞气流速为0.13mL/min0
[0015]在UHPLC-MS/MS检测中，使用的质谱定量模式为多反应监测质谱定量模式。
[0016]所述氨基吡啶类致癌物包括DMIP，TMIP，PhIP和V-OH-PhIP，在多反应监测质谱定量模式中，四种氨基吡啶类致癌物的定量离子对分别为:
[0017]a)DMIP:定量离子对为163>148，锥孔电压为46V，碰撞能量为34V;
[0018]b)TMIP:定量离子对为177>162，锥孔电压为54V，碰撞能量为30V;
[0019]c)PhIP:定量离子对为225>210，锥孔电压为54V，碰撞能量为42V;
[0020](1)47 -OH-PhIP:定量离子对241 >225，锥孔电压为54V，碰撞能量为32V。
[0021 ] 进一步，在频率为40 ± 1kHz超声提取15 ±5min后离心并取上清液中，所述离心的转速为11000r/min，离心的时间为15±5min。
[0022]—种优化的方法，所述在频率为40 ± 1kHz超声提取15 ±5min后离心并取上清液的步骤后，还包括将离心的沉淀物再用频率为40 ± 1kHz超声提取15 ±5min，并离心，合并两次离心后的上清液。
[0023]有益效果
[0024]1、本发明提供的方法较现行常用方法更为简便。采用添加三氯乙酸水溶液并均质的方法，辅助超声处理，仅仅添加了一种溶液和单步提取方式代替多步液液萃取步骤，同时采用单步固相萃取步骤代替串联固相萃取操作，因此对可节省约50%的预处理时间。同时，本发明采用了 MCX小柱，经过检索，MCX小柱目前尚未被使用在氨基吡啶类致癌物的定量检测中，MCX小柱替代了传统方法中两次过小柱，仅仅用了一个小柱就完成了之前通过PRS和C18两中种固相萃取小柱净化的操作，完全富集了氨基吡啶类致癌物，并将对UHPLC-MS/MS定量检测有影响的杂质过滤掉，同时使肉制品中氨基啦啶类致癌物的定量检测更为快速，在高温肉制品安全控制方面有很高的应用前景。
[0025]2、本发明采用了三氯乙酸水溶液提取的方法，发明人发现三氯乙酸水溶液溶解可以提高氨基吡啶类致癌物定量检测的准确率，配合MCX小柱的富集和过滤，使检测结果准确率得到显著提高。同时，较现行常用方法，本发明提供的预处理方法所得四种氨基吡啶的加标回收率都有显者提尚，进一步又提尚了肉制品中氣基卩比唆检测的准确性。经过检测，本发明实施例1采用的预处理方法得到的加标回收率范围为59.29 %?108.24 %，而现行传统液液串联固相萃取法的加标回收率仅为21.35?45.33%，通过加标回收率数据得出，本发明方法检测的准确率很高，氨基吡啶的损失率可以被忽略，较传统方法有显著提升。
[0026]3、本发明提供的氨基吡啶致癌物定量检测的方法，包括预处理以及UHPLC-MS/MS检测，具有检测限低，精密度高，重现性好的优势，可应用于市售多种肉制品中氨基吡啶化合物的定量检测。
【附图说明】
[0027]图1为本发明的方法的工艺流程图；
[0028]图2为实施例1中四种氨基吡啶标准品的MRM图谱；
[0029]图3为实施例1中本发明方法样品中四种氨基吡啶标准品的MRM图谱；
[0030]图4为实施例1中本发明方法与传统液液串联固相萃取法方法的加标回收率对比图。
【具体实施方式】
。
[0031]下述实施例中所用的材料、试剂未特别说明均为分析纯，并从商业途径得到。
[0032]实施例1
[0033]1、烤肉样品制备:购买新鲜猪肉，并置于225°C下焙烤30min，烤至规定时间一半时翻一面，得到烤肉样品，并用组织绞碎机粉碎，得到烤肉样品粉末。
[0034]2、加三氯乙酸均质处理:精确称取4.0Og烤肉样品粉末加入均质管，并向其中加入25g 5%三氯乙酸水溶液，均质15s，重复4次，其中，均质采用德国IKAT-25型高速分散机，分散时转速为15000 ±250转/min。
[0035]3、超声提取:将步骤2得到的混合液转移到三角瓶中再超声提取15±5min，超声波工作频率为40 ± 1kHz，温度为室温。
[0036]4、离心取上清液:离心的转速为11000r/min，所述离心的时间为15±5min:提取后后将混合物转移至50mL离心管中，离心15±5min，收集上清液后，将残渣再用步骤3的条件超声提取一次，合并离心后的上清液。
[0037]5、调节pH值至3.0:向合并后的上清液加入4mol/LNaOH溶液调节pH至3.0 ±0.5，过滤得到提取液I。
[0038]6、MCX小柱预处理:所述固相萃取小柱的型号为:0asis MCX小柱，规格是60mg，3mL。依次用6mL甲醇、6mL超纯水、6mL 0.lmol/L盐酸溶液通过Oasis MCX小柱，对其进行活化，再将提取液I上样至活化好的小柱。并依次采用6mL 0.lmol/L盐酸和6mL甲醇溶液淋洗，再采用6mL氨水-甲醇=1:9(v/v)的混合液洗脱。
[0039]7、收集洗脱液并用高纯氮气吹干，加入500yL乙腈复溶，加入10yL2.5mg/mL咖啡碱后，进行UHPLC-MS/MS检测。
[0040]8、UHPLC_MS/MS检测:其中，所述UHPLC-MS/MS检测条件为:Acquity BEH C18柱;流动相A相为lOmmol/L的乙酸铵水溶液，其pH为6.8，流动相B相为乙腈;梯度洗脱程序:O?1min，10% ?15%流动相B; 10?I Imin，15% ?100%流动相B; 11?12min，100%流动相B;12?13min，100%?10%流动相B，13?17min，10%流动相B，流速为0.3mL/min，柱温为35°C。质谱采用ESI源，正离子模式。源温为120°C，毛细管电压为3.5V，脱溶剂为氮气，脱溶剂气流速为650L/h，脱溶剂温度为350 °C，锥孔气为氮气，锥孔气流速为60L/h，碰撞气为氩气，碰撞气流速为0.13mL/min。
[0041]质谱定量模式为多反应监测质谱定量模式。测定以下四种氨基吡啶:
[0042]1)DMIP:定量离子对为163>148，锥孔电压为46V，碰撞能量为34V;