本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种多肽化合物分子，及该化合物的制备方法与其在制备用于提升动物机体的免疫能力及对疫苗的免疫应答能力的药物中的应用。
背景技术：
：生物体的遗传基因被存储在多聚脱氧核苷酸链上，遗传基因编码着执行生物学功能的蛋白质。生物体内的蛋白质多种多样，它们行使着各种生物学功能维持生命活动。蛋白质的种类虽然多不胜举，但它们基本上都是由20个自然界存在的天然氨基酸组成。由于氨基酸的组成和排列顺序的差异导致了蛋白质的千差万别。一般来说，含有50个以上氨基酸的分子被称为蛋白质，一般超过10个氨基酸的肽链被称为多肽，少于10个氨基酸的肽链被称做寡肽。目前发现最小的功能小肽只有2个氨基酸，通常较为常见的是由4个以上氨基酸组成的功能肽段。由于人类基因组计划的完成和人类蛋白组计划的开展，将会有越来越多的蛋白质功能片段被发现并被作为药物应用到生物医药领域中来。蛋白质的功能片段通常是指被发现具备某种特定生物学功能的天然多肽片段，它们通常是几十个至两个氨基酸组成的肽类片段，被鉴定和发现的蛋白质功能片段可通过人工合成的途径制备。现已开发并在临床上得到应用的多肽药物有“催产素”、“胸腺肽α1”、“胸腺五肽”等，有在天然肽链的基础上进行人工改构制备成为用于治疗消化道出血和肢端肥大症的多肽药物“奥曲肽”和抗凝血作用的“水蛭肽”等。蛋白质中的功能片段常常能筛选到含有几十个或小到只有二个氨基酸组成的多肽片段，它们为人工合成多肽功能片段并将它们投入应用奠定了基础。在蛋白质、多肽或寡肽中，单一氨基酸的缺失、增加或被替换；氨基端(N端)或羧基端(C端)被封闭；序列中或游离端被添加化学基团都会使得蛋白质、多肽或寡肽原有的生物学活性发生改变。设计、筛选和发现具有新的功能肽段或寻找高效肽段是药物开发的一个重要环节。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，一方面，提供一种多分支的多肽化合物，其结构式为：(XAXBXCXDXE-X)2KY，或{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY，或{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY；其中，XA为极性氨基酸分子，XB和XE为碱性氨基酸分子(可相同也可不相同)，XC和XD为非极性氨基酸分子(可相同也可不相同)，K为赖氨酸(Lys,K)，X和Y为空或任意一个或多个氨基酸或化学基团。(XAXBXCXDXE-X)2KY结构见式4：{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY结构见式5：{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY结构见式6：X和Y为空、或任意一种氨基酸，或任意个氨基酸组成的肽片段，或能将氨基酸或肽片段连接起来的化学基团，X和Y可相同，可不同；例如X为空，Y为甘氨酸(Gly，G)。XA选自极性氨基酸，可为半胱氨酸(Cys，C)、甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬酰胺(Asn，N)或谷氨酰胺(Gln，Q)；优选半胱氨酸(Cys，C)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬酰胺(Asn，N)或谷氨酰胺(Gln，Q)；更优选半胱氨酸(Cys，C)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)或谷氨酰胺(Gln，Q)。XB和XE选自碱性氨基酸，可分别为精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)或组氨酸(His,H)，可相同或不同；XB优选精氨酸(Arg，R)或赖氨酸(Lys，K)。XC和XD选自非极性氨基酸，可分别为丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、脯氨酸(Pro，P)、苯丙氨酸(Phe，F)、色氨酸(Trp，W)或蛋氨酸(Met，M)，可相同或不同；XC优选丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、脯氨酸(Pro，P)、苯丙氨酸(Phe，F)或色氨酸(Trp，W)，更优选丙氨酸(Ala，A)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)或脯氨酸(Pro，P)；XD优选亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)或脯氨酸(Pro，P)。本发明还包括在所述多肽化合物基础之上通过化学修饰、改造而产生的衍生物，如：所述多肽化合物与有机酸或无机酸形成的盐类化合物；所述的多肽化合物所带有的羟基可形成但不限于所形成的醚、酯、苷或甙等的化合物；所述的多肽化合物所带有的巯基可形成但不限于所形成的硫醚、硫苷，或与半胱氨酸或含半胱氨酸的肽所形成的含有二硫键的化合物；所述的多肽化合物所带有的氨基可形成但不限于所形成的酰化物、烃化物、与糖类物质所形成的苷类物质等；所述的多肽化合物所带有的羧基可形成但不限于所形成的酯、酰胺类化合物等；所述的多肽化合物所带有的亚氨基可形成但不限于所形成的苷、酰化物、烃化物等；所述的多肽化合物所带有的酚羟基可形成但不限于所形成的酯、醚、苷、甙类化合物，与有机碱或无机碱所形成的盐类化合物；所述的多肽化合物与金属离子所形成的配合物、络和物或螯合物；所述的多肽化合物所形成的水合物或溶剂物。第二方面，本发明提供一种药物组合物，其含有上述的多肽化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐或溶剂化合物以及可药用载体或赋形剂的药物组合物。第三方面，本发明提供制备上述多肽化合物的方法，(XAXBXCXDXE-X)2KY合成路线见式1，先把Y固定在WANG固相树脂上，再通过缩合连接赖氨酸(Lys,K)；进而在KY中K的两个氨基末端与两个XAXBXCXDXE-X片段连接，形成两分支肽(XAXBXCXDXE-X)2KY-WANG固相树脂，可以先合成好XAXBXCXDXE-X片段，再与WANG固相树脂-YK缩合，或者在WANG固相树脂-YK的基础上依次连接X、XE、XD、XC、XB、XA；最后将二分支肽从WANG固相树脂上裂解下来，得到二拷贝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物(XAXBXCXDXE-X)2KY。{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY合成路线见式2，先把Y固定在WANG固相树脂上，再通过缩合连接赖氨酸(Lys,K)，形成KY-WANG固相树脂；再在KY中K的两个氨基末端与另外两个赖氨酸K的羧基端通过缩合连接，形成两分支骨架K2KY-WANG固相树脂；进而在“K2”的每个赖氨酸K的两个氨基末端通过缩合连接XAXBXCXDXE-X，形成四分支肽{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY-WANG固相树脂；最后将四分支肽从WANG固相树脂上裂解下来，得到四拷贝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY。{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY合成路线见式3，先把Y固定在WANG固相树脂上，再通过缩合连接赖氨酸(Lys,K)，形成KY-WANG固相树脂；再在KY中K的两个氨基末端与另外两个赖氨酸K的羧基端通过缩合连接，形成两分支骨架K2KY-WANG固相树脂；再在K2KY-WANG固相树脂中“K2”的每个K的两个氨基末端与另外两个赖氨酸K的羧基端通过缩合连接，形成四分支骨架K4K2KY-WANG固相树脂；进而在“K4”的每个赖氨酸K的两个氨基末端通过缩合连接XAXBXCXDXE-X，形成八分支肽{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY-WANG固相树脂；最后将八分支肽从WANG固相树脂上裂解下来，得到八拷贝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY。在将K的羧基端与Y-WANG固相树脂缩合前，需要先将K的两个氨基保护起来，优选叔丁氧羰基(Boc)保护法和芴甲氧羰基(Fmoc)保护法。所述另外两个赖氨酸的羧基与KY中K的两个氨基缩合前，先将该每个赖氨酸的两个氨基保护起来；XAXBXCXDXE-X的羧基与该每个赖氨酸的氨基缩合前，先将XAXBXCXDXE-X中的氨基保护起来；保护方法优选叔丁氧羰基(Boc)保护法和芴甲氧羰基(Fmoc)保护法。具体步骤为：步骤一：用Fmoc保护法将赖氨酸K中的两个氨基保护起来；步骤二：用多肽自动合成仪，将KY固定在WANG固相树脂上，连接顺序为：WANG固相树脂-YK；制备二拷贝的多肽化合物时，在KY的赖氨酸活化后的两个氨基端上继续缩合连接另外两个XAXBXCXDXE-X，得到固定在WANG固相树脂上的二拷贝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物(XAXBXCXDXE-X)2KY；或在KY的赖氨酸活化后的两个氨基端上继续缩合连接另外两个赖氨酸K，且该每个赖氨酸K上的两个氨基已被Fmoc保护，制备得到两分支骨架K2KY-WANG固相树脂；制备四拷贝的多肽化合物时，在两分支骨架“K2”的每个赖氨酸K活化后的两个氨基末端继续进行两个XAXBXCXDXE-X的缩合，得到固定在WANG固相树脂上的四拷贝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY；或在两分支骨架“K2”的每个赖氨酸K活化后的两个氨基末端继续进行两个赖氨酸K的缩合，该每个赖氨酸K上的两个氨基已被Fmoc保护，制备得到四分支骨架K4K2KY-WANG固相树脂；制备八拷贝的多肽化合物时，在四分支骨架“K4”的每个赖氨酸K活化后的两个氨基末端继续进行两个XAXBXCXDXE-X的缩合，得到固定在WANG固相树脂上的八拷贝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY；最后用TFA法将目的多肽化合物从WANG固相树脂裂解下来，得到多肽化合物粗品；步骤三：用色谱柱(型号为DaisoC18，10μm,50x250mm)纯化多肽化合物粗品，流动相A为(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流动相B为90％乙腈/水，流速为每分钟25毫升，紫外检测波长220纳米；收集流出峰溶液，再经过冷冻干燥，得到呈白色絮状的多肽化合物。第四方面，本发明提供上述多肽化合物或上述方法制备得到的多肽化合物在制备人或动物用免疫药物或增强免疫功能药物中的应用。本发明提供的多肽化合物将多拷贝的三类(三类为极性氨基酸分子、碱性氨基酸分子和非极性氨基酸分子)、共五个氨基酸分子共价连接，形成分支状的多肽化合物。该多肽化合物有望成为多种药物的有效成分，在制备预防、治疗多种病症的药物用都会有所应用，特别是在制备增强免疫能力药物中会广泛应用，还可以作为分子示踪剂使用，抑制血管新生的使用。本发明阐述的多肽化合物由于是非天然分子结构，对生理环境下的降解酶不敏感，因此能有效延长该多肽化合物在生物体内的作用半衰期，使其生物学作用在体内更加持久。具体实施方式本发明设计和制备出一种含有多拷贝XAXBXCXDXE-X的分支状多肽分子(XAXBXCXDXE-X)2KY，或{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY，或{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY，其中，XA为极性氨基酸分子，为半胱氨酸(Cys，C)、甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬酰胺(Asn，N)或谷氨酰胺(Gln，Q)；XB和XE为碱性氨基酸分子(可相同也可不相同)，为精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)或组氨酸(His,H)中的一种或两种，可相同可不同；XC和XD为非极性氨基酸分子(可相同也可不相同)，为丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、脯氨酸(Pro，P)、苯丙氨酸(Phe，F)、色氨酸(Trp，W)或蛋氨酸(Met，M)中的一种或两种，可相同可不同；K为含有两个活性氨基的赖氨酸FmocLys-(Fmoc)-OH，X和Y为空或任意一个氨基酸或任意多个氨基酸组成的肽片段或能将氨基酸、肽片段连接起来的化学基团。本发明的多肽化合物通过变化XA、XB、XC、XD、XE的种类用以适应治疗多种疾病，尤其是提高人或动物机体的体液免疫及细胞免疫能力，从而开发出一种可在临床应用(人用或动物用)涉及增强免疫功能的药物。1963年美国科学家R.B.Merrifield发明创立了将目的肽的氨基酸的羧基端(C端)固定在不溶性树脂上，树脂上结合的氨基酸的氨基端(N端)与有待连接的氨基酸的羧基端进行缩合反应达到延长肽链的固相合成法；也就是从多肽的羧基端(C端)开始逐个氨基酸缩合并向多肽段的氨基端(N端)方向不断延伸。因此，在进行氨基酸的缩合反应时，要将有待连接的氨基酸上的氨基及侧链基团保护起来避免发生反应。目前常用的有叔丁氧羰基(Boc)保护法和芴甲氧羰基(Fmoc)保护法，因此每连接上一个氨基酸就要经历一次脱保护的过程(即固相载体上的氨基先脱保护，再同过量的有待连接的下一个目标氨基酸的羧基发生缩合反应以延长肽链)。通过这样的步骤反复多次地进行下去，即：缩合、洗涤、脱保护、中和、洗涤，再进入下一轮缩合(连接目标氨基酸)，直至达到所需要合成的目标肽链长度。合成完成后采用TFA法将目的多肽从树脂上裂解下来，得到目的肽的粗品。纯化过程如下：一般情况下，合成直链多肽时，使用的是带有一个活性氨基的赖氨酸(Lys，K)Fmoc-Lys(Boc)-OH，其侧链的氨基被BOC-OH保护不参与缩合反应。因此赖氨酸(Lys，K)中只有一个氨基可以发生缩合反应，氨基酸被逐一连接肽链得以沿直链延长。然而，合成本发明阐述的分支骨架时，分支点是一个带有两个活性氨基的赖氨酸Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，赖氨酸的侧链氨基也参与缩合反应，因此从该赖氨酸(Lys，K)处继续进行氨基酸缩合反应就会形成分支链，形成分支骨架“>KY-WANG固相树脂”，在此基础上继续进行下一循环的赖氨酸Fmoc-Lys(Fmoc)-OH缩合，就形成四分支骨架“>K2KY-WANG固相树脂”；再继续进行Fmoc-Lys(Fmoc)-OH缩合，形成八分支骨架“>K4K2KY-WANG固相树脂”。本发明是以KY带有两个活性氨基的赖氨酸(Lys，K，Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)为分支点，同时缩合连接两个用于下一步的氨基酸。若连接的是XAXBXCXDXE-X，则形成的是含二拷贝XAXBXCXDXE-X的两分支(XAXBXCXDXE-X)2KY肽分子。或者先连接两个K(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)形成两分支骨架，且“K2”的两个用于下一步的氨基酸K各自带两个活性氨基，就形成了带有四个活性氨基的分支点供下一步缩合氨基酸(XAXBXCXDXE-X)。如此按照XAXBXCXDXE-X的序列进行缩合延长肽链即形成了含有四拷贝XAXBXCXDXE-X的四分支{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY肽分子。还可以先连接两个K(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)形成两分支骨架，再连接四个K(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)形成四分支骨架，且“K4”的四个用于下一步的氨基酸K各自带两个活性氨基，就形成了带有八个活性氨基的分支点供下一步缩合氨基酸(XAXBXCXDXE-X)。如此按照XAXBXCXDXE-X的序列进行缩合延长肽链即形成了含有八拷贝XAXBXCXDXE-X的八分支{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY肽分子。以此类推，可以形成含有十六拷贝、三十二拷贝、……XAXBXCXDXE-X的多分支肽分子。使用WANG固相树脂合成完成后，采用TFA法将肽链从WANG固相树脂上裂解下来得到以上的两分支、四分支、八分支、……的肽分子。多肽合成目前成为常规技术。多肽合成及纯化的原理和操作参见由盛树力主编，科学技术文献出版社(1998年)出版的“多肽激素的当代理论和应用”一书的第三章“多肽的化学合成和纯化”。本发明合成制备多肽化合物的方式可以参照以上固相合成方式，但并不局限于此合成方式。以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施例中所作的任何变动都将属于本发明。实施例1：拷贝肽片段的合成本发明的多肽化合物不论是两分支、还是四分支、八分支，都具有相同的拷贝肽片段XAXBXCXDXE-X。该拷贝肽片段中XA为极性氨基酸分子，选自半胱氨酸(Cys，C)、甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬酰胺(Asn，N)或谷氨酰胺(Gln，Q)；XB和XE为碱性氨基酸分子(可相同也可不相同)，选自精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)及组氨酸(His,H)中的一种或两种；XC和XD为非极性氨基酸分子(可相同也可不相同)，选自丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、脯氨酸(Pro，P)、苯丙氨酸(Phe，F)、色氨酸(Trp，W)及蛋氨酸(Met，M)中的一种或两种；X为空或任意一个氨基酸或任意多个氨基酸组成的肽片段或能将氨基酸、肽片段连接起来的化学基团，组合方式见表1-4，但不限于此。合成时，可采用有机化学Fmoc保护的氨基酸固相合成方法。具体操作如下：步骤一：选择商业原料“X-WANG固相树脂”或“XE-WANG固相树脂”作为起始，保护基团采用Fmoc保护法将X或XE末端的氨基保护起来；步骤二：选用XE或XD进行氨基酸的逐一缩合延长肽链，合成XAXBXCXDXE-X拷贝肽片段:本实施例中拷贝肽片段的合成是在多肽自动合成仪(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐个氨基酸缩合延伸，合成完成后采用TFA法将目的多肽从WANG固相树脂上裂解下来。采用多肽自动合成仪(ABI433A型)，先把X或XE固定在WANG固相树脂(WANG固相树脂为固相肽合成中Fmoc保护方式载体)上，再通过缩合连接氨基酸(XE、XD、XC、XB、XA或XD、XC、XB、XA)，实际的连接顺序为：WANG固相树脂-X-XEXDXCXBXA，就会得到固定在WANG固相树脂上的拷贝肽片段。最后采用TFA法将目的拷贝肽片段从WANG固相树脂上裂解下来，就得到了XAXBXCXDXE-X拷贝肽片段粗品。步骤三：纯化XAXBXCXDXE-X拷贝肽片段采用色谱柱(型号为DaisoC18，10μm,50×250mm)，色谱操作流动相A为(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流动相B为90％乙腈/水，流速为每分钟25毫升，紫外检测波长220纳米。收集流出峰溶液，再经过冷冻干燥。得到呈白色絮状的XAXBXCXDXE-X拷贝肽片段，经密封包装后放入冰箱保存待用；其纯度可＞99％。XA、XB、XC、XD、XE均可通过商业途经采购获得。在制备本发明的多肽化合物时，也可以用可外购的WANG固相树脂-X或WANG固相树脂-XE为原料，按照上述方法在X或XE的末端缩合氨基酸，得到本发明的拷贝肽片段，表1中列出部分合成得到的拷贝肽片段，并测得其质谱分子量。表1拷贝肽片段XAXBXCXDXE-X的各基团列表表1结果表明，本发明合成出的拷贝肽片段质谱分子量与理论分子量的差距不到1％，说明该拷贝肽片段确证为对应实施例的拷贝肽片段。此实施例部分是为了公开拷贝肽片段的内容，并不是对本发明的限制，实际合成时可按以下实施例中的说明进行。按照本发明阐述的方式制备分支骨架，其分支节点的氨基酸选取Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，其携带的两个活性氨基为后续的氨基酸缩合连接反应提供了分支的位点，可完成两分支骨架“>KY-WANG固相树脂”、四分支骨架“>K2KY-WANG固相树脂”或八分支骨架“>K4K2KY-WANG固相树脂”、……的合成。再按常规肽链延长反应选取胺基被保护起来的氨基酸，进行分支节点后的肽链延长从而制备出本发明的两分支肽类分子(XAXBXCXDXE-X)2KY、四分支肽类分子{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY或八分支肽类分子{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY。鉴于肽链的延长过程已是成熟技术，合成步骤的繁复细节在此不再赘述。实施例2：两分支肽类分子(XAXBXCXDXE-X)2KY的合成本发明提供的二拷贝XAXBXCXDXE-X多肽化合物(XAXBXCXDXE-X)2KY的结构与合成线路见式1，其中，XA为极性氨基酸分子，XB和XE为碱性氨基酸分子，XC和XD为非极性氨基酸分子，K为含有两个活性氨基的赖氨酸FmocLys-(Fmoc)-OH，X和Y为空或任意一个或多个氨基酸或化学基团:本实施例采用有机化学Fmoc保护的氨基酸固相合成方法。具体操作如下：步骤一：保护基团采用Fmoc保护法将赖氨酸的氨基保护起来；步骤二：合成(XAXBXCXDXE-X)2KY多肽化合物:本实施例中多肽的合成是在多肽自动合成仪(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐个氨基酸缩合延伸，合成完成后采用TFA法将目的多肽从WANG固相树脂上裂解下来。采用多肽自动合成仪(ABI433A型)，先把Y固定在WANG固相树脂(WANG固相树脂为固相肽合成中Fmoc保护方式载体)上，再通过缩合连接赖氨酸(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)，实际的连接顺序为：WANG固相树脂-Y-Lys,形成具有分支节点的两分支骨架“>KY-WANG固相树脂”；由于其末端的赖氨酸具有双活化的氨基，进而在“>KY-WANG固相树脂”中K的两个活性氨基末端与另外两个XAXBXCXDXE-X片段发生反应，就会得到两分支肽的延伸(XAXBXCXDXE-X)2KY-WANG固相树脂，即固定在WANG固相树脂上的二拷贝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物(XAXBXCXDXE-X)2KY-WANG固相树脂。此步骤中，合成时可以按照实施例1先合成好XAXBXCXDXE-X片段，再与WANG固相树脂-Y-Lys缩合；或者，在“>KY-WANG固相树脂”中K的两个活性氨基末端依次连接X、XE、XD、XC、XB、XA。最后采用TFA法将目的多肽化合物从WANG固相树脂上裂解下来，就得到了(XAXBXCXDXE-X)2KY多肽化合物粗品。步骤三：纯化(XAXBXCXDXE-X)2KY多肽化合物采用色谱柱(型号为DaisoC18，10μm,50×250mm)，色谱操作流动相A为(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流动相B为90％乙腈/水，流速为每分钟25毫升，紫外检测波长220纳米。收集流出峰溶液，再经过冷冻干燥。得到呈白色絮状的(XAXBXCXDXE-X)2KY多肽化合物，经密封包装后放入冰箱保存待用；其纯度可＞99％。XA、XB、XC、XD、XE均可通过商业途经采购获得。在制备本发明的多肽化合物时，也可以用可外购的WANG固相树脂-Y为原料，按照上述方法在Y的末端缩合氨基酸，得到本发明的多肽化合物。按照本实施例方法合成一系列两分支肽类分子(XAXBXCXDXE-X)2KY，见表2。表2两分支肽分子(XAXBXCXDXE-X)2KY的各基团列表实施例3：四分支肽类分子{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY的合成本发明提供的四拷贝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY的结构与合成线路见式2，该结构也可以表达为(XAXBXCXDXE-X)4K2KY，各基团的定义同实施例2:本实施例采用有机化学Fmoc保护的氨基酸固相合成方法。具体操作如下：步骤一：保护基团采用Fmoc保护法将赖氨酸的氨基保护起来；步骤二：合成{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY多肽化合物:本实施例中多肽的合成是在多肽自动合成仪(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐个氨基酸缩合延伸，合成完成后采用TFA法将目的多肽从WANG固相树脂上裂解下来。采用多肽自动合成仪(ABI433A型)，先把Y固定在WANG固相树脂(WANG固相树脂为固相肽合成中Fmoc保护方式载体)上，再通过缩合连接赖氨酸(赖氨酸Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)，实际的连接顺序为：WANG固相树脂-Y-Lys,形成具有分支节点的两分支骨架“>KY-WANG固相树脂”；由于其末端的赖氨酸具有双活化的氨基，与另外两个赖氨酸(K，此时其两个氨基被保护)的羧基发生缩合反应就会得到两分支骨架的延伸K2KY-WANG固相树脂，此时在KY的赖氨酸氨基端上连接有两个具有双活化氨基的赖氨酸(K)，形成具有分支节点的四分支骨架“>K2KY-WANG固相树脂”；在“K2”的每个具有双活化氨基的赖氨酸(K)上继续进行与两个XAXBXCXDXE-X片段的缩合，就得到了固定在WANG固相树脂上的四拷贝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY-WANG固相树脂。此步骤中，合成时可以按实施例1先合成好XAXBXCXDXE-X片段，再与K2KY-WANG固相树脂缩合；或者在“>K2KY-WANG固相树脂”中K的两个活性氨基末端依次连接X、XE、XD、XC、XB、XA。最后采用TFA法将目的多肽化合物从WANG固相树脂上裂解下来，就得到了{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY多肽化合物粗品。步骤三：纯化{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY多肽化合物同实施例2。最终得到呈白色絮状的{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY多肽化合物，经密封包装后放入冰箱保存待用；其纯度可＞99％。按照本实施例方法合成一系列四分支肽类分子{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY，具体基团的选择见表3。表3四分支肽类分子{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY的各基团列表实施例XAXBXCXDXEXY实施例XAXBXCXDXEXY4-1TKLPR空G4-9SKLIK空G4-2SRPLRGA4-10CRLAKA空4-3CRLPRGG4-11SRLFRGW4-4TRPLR空G4-12TKPPR空G4-5SKLLKG空4-13TRPLK空G4-6QKAPH空G4-14SKILR空G4-7YRFMKAC4-15CHVMKPI4-8CKWAH空A4-16NHLWHND实施例4：八分支肽类分子{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY的合成本发明提供的八拷贝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY的结构与合成线路见式3，该结构也可以表达为(XAXBXCXDXE-X)8K4K2KY，各基团的定义同实施例2:本实施例采用有机化学Fmoc保护的氨基酸固相合成方法。具体操作如下：步骤一：保护基团采用Fmoc保护法将赖氨酸的氨基保护起来；步骤二：合成{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY多肽化合物:本实施例中多肽的合成是在多肽自动合成仪(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐个氨基酸缩合延伸，合成完成后采用TFA法将目的多肽从WANG固相树脂上裂解下来。采用多肽自动合成仪(ABI433A型)，先把Y固定在WANG固相树脂(WANG固相树脂为固相肽合成中Fmoc保护方式载体)上，再通过缩合连接赖氨酸(Lys,K)，实际的连接顺序为：WANG固相树脂-Y-Lys,形成具有分支节点的两分支骨架“>KY-WANG固相树脂”；由于其末端的赖氨酸具有双活化的氨基，与另外两个赖氨酸(K，此时其两个氨基被保护)的羧基发生缩合反应就会得到两分支骨架的延伸K2KY-WANG固相树脂，此时在KY的赖氨酸氨基端上连接有两个具有单活化氨基的赖氨酸(K，此时其两个氨基被保护)，形成四分支骨架“>K2KY-WANG固相树脂”；在“K2”的两个具有单活化氨基的赖氨酸末端再分别与另外两个赖氨酸(K，此时其两个氨基被保护)的羧基发生缩合反应就会得到四分支骨架的延伸K4K2KY-WANG固相树脂，此时在K2KY的末端赖氨酸氨基端上连接有四个具有双活化氨基的赖氨酸(K)，形成具有分支节点的八分支骨架“>K4K2KY-WANG固相树脂”；在“>K4K2KY-WANG固相树脂”的“K4”每个具有双活化氨基的赖氨酸(K)上继续进行与两个XAXBXCXDXE-X片段的缩合，就得到了固定在WANG固相树脂上的八拷贝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY-WANG固相树脂。此步骤中，合成时可以先合成好XAXBXCXDXE-X片段，再与{(K)2K}2KY-WANG固相树脂缩合；或者在“>K4K2KY-WANG固相树脂”中K的两个活性氨基末端依次连接X、XE、XD、XC、XB、XA。最后采用TFA法将目的多肽化合物从WANG固相树脂上裂解下来，就得到了{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY多肽化合物粗品。步骤三：纯化{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY多肽化合物同实施例2。最终得到呈白色絮状的{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY多肽化合物，经密封包装后放入冰箱保存待用；其纯度可＞99％。按照本实施例方法合成一系列八分支肽类分子{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY，具体基团的选择见表4。表4八分支肽类分子{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY的各基团列表实施例XAXBXCXDXEXY实施例XAXBXCXDXEXY8-1TKLPR空G8-9SKLIK空G8-2SRPLRGA8-10CRLAKA空8-3CRLPRGG8-11SRLFRGW8-4TRPLR空G8-12TKPPR空G8-5SKLLKG空8-13TRPLK空G8-6QKAPH空G8-14SKILR空G8-7YRFMKAC8-15CHVMKPI8-8CKWAH空A8-16NHLWHND由于本发明的多肽化合物是一类具有生物活性的有机分子，它们的氨基酸序列和结构决定了它们的生物学作用。单一氨基酸在蛋白质或肽序列中的改变都有可能导致其生物学活性的改变，下面通过具体实验例来对本发明提供的多肽化合物的生物活性及其功效进行阐述。实验例一：本发明多肽化合物在禽类动物(鸡)中的免疫效果实验新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus,NDV)能够与鸡红细胞发生凝集现象，这是一种特异性的抗体中和反应，其原理是根据病毒的血凝素可凝集红细胞，但若先用特异性抗体与病毒作用，然后再加入红细胞后则不出现红细胞凝集，称为血凝抑制试验(HemagglutinationInhibitiontest,HI),检测所用的抗血清稀释的最高倍数即是抗体的滴度。待测抗体的滴度越高，说明免疫的效果越好。HI方法具有以下优点：1.敏感性强，可以检测到微量的抗体，结果也较为准确，是较敏感的血清学检测反应之一；2.特异性强，病毒凝集红细胞只能被特异性的抗体所抑制；3.检测速度快，1次HI试验只需2小时左右即可判定结果；4.HI试验对环境要求不高，操作简单快捷，一次可检测大量的样品。将本发明实施例2-1至实施例2-16、实施例4-1至实施例4-16、实施例8-1至实施例8-16的多肽化合物在雏鸡中进行抗体滴度的检测：给SPF雏鸡接种鸡新城疫活疫苗(CS2株，成都天邦生物制品有限公司出品)和本发明的多肽化合物，然后检测多肽化合物在SPF雏鸡体内对新城疫活疫苗的HI抗体生成效果，从而得到本发明多肽化合物对新城疫活疫苗(抗原)的免疫效果。实验方法为：选取7日龄无特定病原(SpecificPathogenFree)鸡(简称为SPF雏鸡)。将SPF雏鸡分为8组，每组12只。在SPF雏鸡的翅膀腋部皮下按以下组别接种。然后各组同时饲养在隔离器内。接种后第14天翅下静脉采血约1ml，分离血清进行HI检测，以实施例2-5、2-6、4-9、4-12、8-13和8-14(依序对应表5中实验组1-实验组6)为例，检测结果见表5(仅列出部分多肽化合物的检测结果)，其它实施例结果与表5差别不大，不一一赘述。具体操作参见由郭鑫主编，中国农业大学出版社2007年出版的《动物免疫学实验教程》。空白组：注射0.3ml生理盐水；对照组：接种0.3ml鸡新城疫活疫苗(简称“疫苗”，CS2株)；实验组：接种混合有0.2μg本发明多肽化合物的疫苗0.3ml。表5SPF雏鸡免疫实验结果注：阴性是指HI的抗体滴度为零；实验期间各组SPF雏鸡饮食活动未见异常，未见不良反应，未发生SPF雏鸡死亡，表明本发明的多肽化合物使用安全。表5结果表明疫苗中添加了本发明多肽化合物(实验组1-8)后，HI的抗体滴度均值比空白组和对照组(仅有疫苗)有所提高，说明本发明多肽化合物与疫苗联用具有良好的免疫增强效果，与对照组相比平均提高HI抗体滴度1以上。实验例二：本发明多肽化合物在多拷贝基团相同的情况下，不同分支对免疫效果的影响实验按实验例一方法对两组本发明的多肽化合物(组Ⅰ和组Ⅱ)进行免疫效果的实验，这两组多肽化合物中同一组的多肽化合物多拷贝基团相同，仅是分支数量不同，这两组化合物是从实施例中随机选取的。以实施例2-1、2-3、4-1、4-3、8-1和8-3为例，检测结果见表6，其它实施例结果与表5差别不大，不一一赘述。实验分组：空白组：注射0.3ml生理盐水；对照组：接种0.3ml鸡新城疫活疫苗(简写“疫苗”，CS2株)；实验组：接种混合有0.2μg实施例的疫苗0.3ml；实验期间各组SPF雏鸡饮食活动未见异常，未见不良反应，未发生SPF雏鸡死亡，表明本发明的多肽化合物使用安全。表6结果表明，随着多肽片段拷贝数量的增加，也就是分支数量的增多，对雏鸡的免疫应答效果有所增强，免疫增强效果得到进一步提升，意味着生物学效果与肽片段拷贝数量呈正相关的作用机制。表6SPF雏鸡免疫实验结果注：阴性是指HI的抗体滴度为零。以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下所做出的若干改进和润饰也应视为本
发明内容。当前第1页1 2 3