重组核酸片段RecCR010212及其检测方法与流程

文档序号:12167215阅读:来源:国知局

技术特征:

1.重组核酸片段,其选自:

i)包含SEQ ID NO:1所示序列190-737位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列;

ii)包含SEQ ID NO:1所示序列的序列或其片段或其变体或其互补序列;

iii)包含SEQ ID NO:2所示序列1065-1127位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列;

iv)包含SEQ ID NO:2所示序列的序列或其片段或其变体或其互补序列;以及

以上片段的组合。

2.检测权利要求1所述片段的引物,其中所述引物选自:

(I)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列1-190位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列737-1061位核苷酸的序列的反向引物;

(II)以下第一组引物对与第二组引物对的组合,其包含

(a)第一组引物对:特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1-190位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第191-736位核苷酸的序列的反向引物;和

(b)第二组引物对:特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第191-736位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第737-1061位核苷酸的序列的反向引物;

(III)特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第190-191位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第736-737位核苷酸的序列的反向引物;

(IV)特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第190-191位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第737-1061位核苷酸的序列的反向引物;

(V)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1-190位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第736-737位核苷酸的序列的反向引物;和/或任选地,

(VI)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列1-1065位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列1127-1656位核苷酸的序列的反向引物;

(VII)以下第三组引物对与第四组引物对的组合,其包含

(c)第三组引物对:特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1-1065位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1066-1126位核苷酸的序列的反向引物;和

(d)第四组引物对:特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1066-1126位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1127-1656位核苷酸的序列的反向引物;

(VIII)特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第1065-1066位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第1126-1127位核苷酸的序列的反向引物;

(IX)特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第1065-1066位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1127-1656位核苷酸的序列的反向引物;

(X)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1-1065位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第1126-1127位核苷酸的序列的反向引物。

3.检测权利要求1所述片段的引物,其中所述引物选自:

(I)扩增SEQ ID NO:1所示序列的引物对

5’-CGAAACCCAACAAAGACAATGAA-3’,

5’-AGCCTGAACAGCCTGATGAACGA-3’;以及

(II)测序SEQ ID NO:1所示序列的引物

5’-CCGAATGTGATGGTGGTTTA-3’,

5’-TCAACTCGACGGCGTTCGT-3’,

5’-AGCCTGAACAGCCTGATGAACGA-3’;和/或任选地

(III)扩增SEQ ID NO:2所示序列的引物对

5’-AGGAGTCTCGGGAAGAAGGC-3’,

5’-AAAGTTGCGGCAATGGTCTA-3’;以及

(IV)测序SEQ ID NO:2所示序列的引物

5’-CCAAGGCATGTATGAATAGG-3’,

5’-ACCATGTTCGGATAGACAG-3’,

5’-TTCTCATCAAGGACCGTAAA-3’,

5’-TAGACTCAACCATGACTATG-3’,

5’-AAAGTTGCGGCAATGGTCTA-3’。

4.选育含有权利要求1所述的重组核酸片段的水稻植株的方法,其包括以不含目的基因组片段的水稻受体植物亲本作为轮回亲本,将其与含有目的基因组片段的水稻供体植物进行杂交,然后将所得到的杂交种与轮回亲本进行回交,再将所得到的回交种进行自交的步骤,其中利用分子标记对重组植株进行前景选择和背景选择。

5.如权利要求4所述的方法,其中用于所述前景选择的分子标记选自Pi31、Pi2ID01和Pi2ID05中的一种或多种;和/或

任选地,利用水稻全基因组育种芯片进行所述背景选择。

6.如权利要求4或5所述的方法,其中所述重组核酸片段含有抗稻瘟病基因,并且所述方法包括以下步骤:

1)将轮回亲本与供体植物进行杂交,将所得到的杂交种与轮回亲本进行回交,获得回交一代,利用正向选择标记Pi31和负向选择标记Pi2ID01、Pi2ID05对其进行抗稻瘟病基因组片段的单侧同源重组片段筛选,并利用水稻全基因组育种芯片对其进行背景选择;

2)选择背景回复较好的重组单株与轮回亲本再次进行回交,获得回交二代,利用正向选择标记Pi31对其进行检测,选择含有抗稻瘟病基因组片段的重组单株,然后利用水稻全基因组育种芯片对其进行背景选择;

3)选择背景回复好的重组单株与轮回亲本又一次进行回交,获得回交三代,利用正向选择标记Pi31和负向标记Pi2ID01、Pi2ID05对其进行抗稻瘟病基因组片段的另一侧同源重组片段筛选,并利用水稻全基因组育种芯片对其进行背景选择;以及

4)选择导入片段小,且背景回复好的重组单株,将选中的重组单株自交一次,获得自交种,利用正向选择标记Pi31对其进行检测,并利用水稻全基因组育种芯片对其进行背景选择,最终获得含纯合抗稻瘟病基因组重组核酸片段且背景回复的水稻植株。

7.如权利要求4至6中任一项所述的方法,其中利用分子标记对重组植株进行前景选择时采用的扩增引物如下:

扩增分子标记Pi31的引物对,其包括:

正向引物:5’-ATCCAAACCCGTTGTTGCAC-3’,

反向引物:5’-CGGCAATTGCCACGATGATA-3’;

扩增分子标记Pi2ID01的引物对,其包括:

正向引物:5’-CGTAAACTTGTTAGGTGGGTG-3’,

反向引物:5’-AAAATATGAGGAACTGGGCA-3’;以及

扩增分子标记Pi2ID05的引物对,其包括:

正向引物:5’-CCTTATCACAGCCACATAGAGC-3’,

反向引物:5’-TGGGATTCATTGGGTGAGTAT-3’。

8.检测权利要求1所述的重组核酸片段的方法,其包括采用权利要求2或3所述的引物,以待测基因组为模板进行PCR反应,并分析PCR产物的步骤。

9.检测权利要求1所述的重组核酸片段的试剂盒,其包括权利要求2或3所述的引物。

10.筛选含有权利要求1所述的重组核酸片段的水稻植株或种子的方法,其包括检测待测水稻植株或种子的基因组中是否含有权利要求1所述的重组核酸片段的步骤;

优选地,采用权利要求2或3所述的引物,或者采用权利要求8所述的方法,或者采用权利要求9所述的试剂盒来进行检测。

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