本发明属于分子标记技术领域，更具体地说，涉及一种基于miRNA序列分析物种进化的方法。
背景技术：
现有的物种进化分析方法多用保守基因的DNA序列和氨基酸序列，或是基因组全序列，它们的假设前提都是基因或基因组受到进化的压力，用它们作为分子标记构建分子进化树，从而确认物种间的进化关系。申请人一直致力于确定物种进化地位的方法的研究，曾做过相关方面的专利申请，专利申请号：201410409580.X，申请日：2014年08月19日，专利名称：一种太湖新银鱼物种分子鉴定的引物和方法，既是利用生物体的DNA序列构建分子进化树从而确定物种的进化地位。又如，专利申请号：201310701214.7，申请日：2013年12月18日，专利名称：长爪沙鼠DNA序列；专利申请号：201310018341.7，申请日：2013年01月18日，专利名称：茄属物种鉴定基因、引物及检测方法，过去以来，人们一直停留在DNA序列或是氨基酸序列层面上去研究生物物种间的进化关系。然而，随着对RNA的深入研究发现，RNA在生物进化过程中也扮演着重要的角色，特别是miRNA具有重要的基因表达的调节功能，miRNA全称microRNA，是一段长度为20到25个核苷酸的小RNA分子，miRNA很可能在物种的进化过程中受到了选择的压力。经检索，《miRNA-9基因家族进化分析及其靶基因预测》(中国细胞生物学学报，2011，罗丹丹罗玉萍彭娟李思光)中对miRNA-9基因家族的进化历史作了深层研究，该文献查询不同物种中广泛存在的miRNA-9基因，通过序列比对并构建miR-9基因家族系统进化树对miRNA-9基因做进化分析，进一步分析其靶基因的生物学功能，从而预期获得miRNA-9基因序列在生物体内的角色及其可能的作用机制。《microRNA相关的生物信息学与进化分析》(复旦大学博士学位论文，生物信息学专业，杨桢，指导教师：钟扬教授，2011年4月10日)，该论文中也是通过对miRNA基因家族的研究从而预期获得miRNA基因在生物体的发育过程中所起到的作用。上述现有技术都是从miRNA基因家族进化历史的层面入手研究，并没有将miRNA基因的研究聚焦于-物种的进化分析，随着人类基因组计划完成和后基因组时代的到来，很多物种的必需基因及miRNA序列被获得。事实上，必需基因与miRNA也存在着对应关系不难看出，必需基因是生物进化过程中保留下的“生存关键基因”，而用于调节必需基因表达水平的miRNA序列自然在进化过程中扮演的角色不容忽视。因此，区别于传统的DNA序列或是氨基酸序列，如果以RNA中的miRNA为分子标记，对生物间的分子进化进行分析，该方法获得的结果对现行的方法将会是一个很好的补充，甚至具有更好的性能。
技术实现要素：
1.发明要解决的技术问题为提供一种对现有生物物种间进化关系分析方法的补充，提出了本发明的一种基于miRNA序列分析物种进化的方法。本发明的提出除了对现有采用DNA序列或氨基酸序列构建分子系统树从而确定物种进化地位的方法的补充，还通过引入必需基因，解决了如何利用仅仅有20～25个bp的miRNA序列来分析生物间进化关系的问题。2.技术方案本发明的一种基于miRNA序列分析物种进化的方法，采用miRNA序列作为分子标记进行物种进化分析。更进一步地，所述的miRNA序列为拼接的长miRNA序列。更进一步地，所述的长miRNA序列由至少6个miRNA成熟序列拼接而成。更进一步地，具体步骤如下：一、选择人类的若干必需基因；二、找出步骤一人类必需基因对应的miRNA，并获得该miRNA对应的miRNA成熟序列，通过序列比对找出待分析物种的相应的miRNA成熟序列，每种待分析物种的miRNA成熟序列至少包括6条；三、按照一定的顺序将步骤二中获得的待分析物种的miRNA成熟序列拼接成为长miRNA序列，构成新的分子标记，一定的顺序是指每种待分析物种的miRNA成熟序列拼接采用相同的顺序；四、利用新的分子标记序列和进化软件，构建物种分子进化树。更进一步地，步骤四中所述的进化软件为MEGA6.0软件，采用其中的NJ法构建分子进化树。3.有益效果采用本发明提供的技术方案，与现有技术相比，具有如下显著效果：(1)本发明的一种基于miRNA序列分析物种进化的方法，摆脱传统的进化相关的标记，没有从基因的保守性角度研究进化，而是独创性的从具有调节功能的miRNA序列做进化分析，miRNA序列分子标记是对现有的DNA序列分子标记的一个重要补充。(2)本发明的一种基于miRNA序列分析物种进化的方法，原有的进化分析方法只考虑保守基因，往往忽视调节基因的RNA和生物的必需基因在进化上的角色，考虑到生物生存所必需的基因，表明这些必需基因在进化上是重要的，必需基因对应的miRNA在进化上具有重要的信息量，从miRNA序列做进化分析获得的结果具有较高的可信度。(3)本发明的一种基于miRNA序列分析物种进化的方法，选用至少6条必需基因的所对应的待分析物种的miRNA序列，拼接成为长miRNA序列作为分子标记，因为miRNA一般长度在22bp左右，拼接后的总序列大于100bp，作为分子标记进化分析具有较高的可靠性。当然，如果选择更多的miRNA序列，如20条序列，获得结果可能具有更高的可信度。(4)本发明的一种基于miRNA序列分析物种进化的方法，采用待分析物种的miRNA序列相应的成熟序列而非前体序列，用它拼接成长miRNA成熟序列做为分子标记，具有以下优势：其一，miRNA在细胞内真正发挥调控功能的是成熟序列而非前体序列，基于本发明的构思，用它可让结果更能真实反映序列在进化过程中发挥的“调节功能”；其二，因为需要多条miRNA序列的拼接，长度一致和保守性较高的成熟序列更利于拼接和拼接后的序列比对，而前体序列这些方面的序列特征可能会对进化分析产生干扰。附图说明图1为实施例1中的分子树系统图。具体实施方式必需基因对于生物来说十分重要，大量的实验证明必需基因的突变或是敲除往往导致整个生物体的死亡，因此，必需基因在生物的进化过程中实际上扮演着一个极其重要的角色。miRNA往往调节着一些靶基因的基因表达水平，与靶基因间存在一定的对应关系。那些调节必需基因的miRNA对物种的进化过程中起着重要的调节功能。本发明从人类的必需基因出发，利用必需基因与miRNA间的关系，获得进化程度最高生物的必需基因对应的miRNA成熟序列，并按照一定的顺序组装起来，拼成一个长RNA序列，用这个序列做分子标记，研究物种间的分子进化关系。具体步骤入如下：一、选择人类的若干必需基因；二、找出步骤一人类必需基因对应的miRNA，并获得该miRNA对应的miRNA成熟序列，通过序列比对找出待分析物种的相应的miRNA成熟序列，每种待分析物种的miRNA成熟序列至少包括6条；三、按照一定的顺序将步骤二中获得的待分析物种的miRNA成熟序列拼接成长miRNA序列，构成新的分子标记；四、利用新的分子标记序列和MEGA6.0软件，采用其中的NJ法构建分子进化树。为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。实施例1本实施例的一种基于miRNA序列分析物种进化的方法，随机选择人类6个必需基因，分别为APC、EIF2AK3、POLG、SOX9、WT1(来自于必需基因数据库网站，http://tubic.tju.edu.cn/deg/)。找出这些必需基因对应的miRNA，它们分别是miRNA-7、miRNA-9、miRNA-10a、miRNA-31、miRNA-34、miRNA-92(必需基因与miRNA的对应关系来自于相应数据网站，http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw/html/search.html)，并根据miRBase的数据库(www.mirbase.org/)获得人类的这些miRNA的成熟序列。本实施例需要进行进化分析的研究对象有5个物种，分别为佛罗里达文昌鱼，海七鳃鳗，小家鼠，黑猩猩，意蜂，通过Blast序列比对，找到这些物种6个miRNA的序列6条。拼接这些序列整理成为一条整体的序列(序列如下表1所示)。表1新形成的碱基序列分析系统发生：利用ClustalX2.0软件对所有已经搜索下载获得物种的miRNA的成熟核酸序列进行多序列比对分析。然后利用MEGA6.0软件中的NJ法，建立生物的分子系统树。获得进化树的结果与解释：利用MEGA6.0软件运用NJ法构建拼接而成的长miRNA成熟序列的进化树，如图1所示(Mmu:小家鼠，ptr:黑猩猩，ame意蜂，bfl：佛罗里达文昌鱼，pma：海七鳃鳗)，可以看出，小家鼠和黑猩猩在一个分支上，而小家鼠和黑猩猩都是哺乳纲动物；佛罗里达文昌鱼和海七鳃鳗在进化树看是相关联的，而佛罗里达文昌鱼属于头索纲文昌鱼科，海七鳃鳗属于圆口纲，它们都属于脊椎动物与无脊椎动物间的过渡类型；易蜂在这里被定义为其外群，分子系统树显示的待分析物种间的进化关系与预测的一致。以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，实施例中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的情况并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的分析方法及实施例，均应属于本发明的保护范围。