一种生物酶解法制备GABA的方法及装置与流程

本发明涉及生物技术领域，更具体的说，涉及一种可连续化运转的生物酶解法制备GABA的方法及装置。

背景技术：

γ-氨基丁酸(简称GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质，约30％的中枢神经突触部位以GABA为递质。当人体内GABA缺乏时，会产生焦虑、不安、疲倦、忧虑等情绪。

GABA作为一种具有重要生理功能的生物活性物质，在人体大脑皮质、海马、丘脑、基底神经节和小脑中起重要作用，并对机体的多种功能具有调节作用。最新的研究表明，GABA除具有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、营养神经细胞、增加生长激素分泌、健肝利肾、预防肥胖、促进乙醇代谢、改善更年期综合症等多种功效，因而越来越引起人们的注意。GABA既可以开发成为一种具有显著药理作用的药物，又可以开发成为一种具有保健性的食品，前景非常乐观。由于GABA天然存在量低，很难从一些天然动植物组织中大量提取分离，目前获得GABA的方法是化学合成法和生物法两大类，其中生物法包括植物富集法、微生物发酵法和生物酶解法等三种。

化学合成法主要是由吡咯烷酮在强碱性条件下水解开环制得。这种合成方法有化学物质残留，得到的产品不属于天然产物，主要应用于化工和医药领域，不适合在食品中应用。

生物法中的植物富集法是利用植物组织代谢过程中的内源酶转化制备GABA。例如，CN 103181523A号专利公开了一种稻谷内源性酶激活法生产 高GABA功能食品材料的方法，在明确稻米内源性谷氨酸脱羧酶特性和活性调节机制的基础上，采用谷氨酸脱羧酶激活技术，生产高GABA含量的稻米健康食品；以富含GABA的发芽糙米为原料，采用钝化分解GABA的转氨酶预处理，生产留胚GABA精白米；采用含有谷氨酸脱羧酶激活剂和特殊缓冲体系的天然培养液进行发芽；以米糠、米胚芽作为GAD源，将其固定化后生产富集GABA的食品配料，并将其应用到GABA营养配合米粉生产中。本发明方法简便，可以加速开发富含GABA功能因子的食品材料，可作为或者用于抗高血压、增进脑机能及肝功能的功能食品。此种方法是以获得较高含量GABA的某种食品为主要目的，而不是以获得GABA纯品为目的的。

生物法中的微生物发酵法以能产谷氨酸脱羧酶(GAD)的微生物为生产菌进行发酵，在培养基中添加L-谷氨酸(L-Glu)或L-谷氨酸钠等GABA前体物，在发酵培养过程中，用微生物产生的GAD的脱羧作用，将L-谷氨酸/L-谷氨酸钠转化为GABA，再分离纯化得到GABA纯品；如果利用的是酵母菌、乳酸菌和曲霉菌等食品安全级微生物可酵制得的GABA产品可以用于食品行业。高产微生物的获得、发酵生产过程的控制、GABA的分离纯化都制约了该方法的大规模推广应用。

生物酶解法是以L-谷氨酸为底物，在合适的pH和温度条件的反应体系下，使用谷氨酸脱羧酶将L-谷氨酸脱羧降解为GABA产品。采用该方法制备效率高，产品较单一，易于分离纯化，具有较高的工业生产价值。但由于谷氨酸脱羧酶(GAD)价格较为昂贵，使用成本比较高。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种生物酶解法制备GABA的方法及装置，解决现有生物酶解法制备GABA的工艺中酶的利用效率和酶解效率不高、生产成本高昂等问题。

本发明为了解决上述问题，采用的技术方案为：提供一种生物酶解法制备GABA的方法，包括如下步骤：

S100、脱羧反应：将味精渣和谷氨酸脱羧酶加入装有缓冲液的反应器中 形成反应液，在30℃～45℃的温度下进行脱羧反应，生物酶解产生GABA；

S200、膜分离：将反应液中的一部分泵入膜分离系统，产生的GABA穿过滤膜进入滤出液中，谷氨酸脱羧酶和未反应的L-谷氨酸被截留并回流进入反应器中；

S300、收集：收集所述滤出液，干燥得到GABA粉末，或者层析分离后干燥得到GABA精粉。

在本发明提供的生物酶解法制备GABA的方法中，所述步骤S100中，反应液的pH为3.0～5.0，反应液中味精渣的质量分数为5％～30％，反应液中谷氨酸脱羧酶的质量分数为0.5％～4％。

在本发明提供的生物酶解法制备GABA的方法中，所述步骤S200中，将反应液连续泵入膜分离系统，或者，每间隔10～30min将反应液泵入膜分离系统一次。

在本发明提供的生物酶解法制备GABA的方法中，所述步骤S200还包括：

S201、一级膜分离：反应液使用截留分子量为50～500KDa的滤膜分离，得到第一透过液和第一截留液，所述第一截留液回流进入反应器中；

S202、二级膜分离：将第一透过液使用截留分子量为100～500Da的滤膜分离，得到第二透过液和第二截留液，所述第二截留液回流进入反应器中；所述第二透过液即为所述滤出液。

在本发明提供的生物酶解法制备GABA的方法中，所述步骤S201中，进口压力为0.1MPa～0.35MPa；所述步骤S202中，进口压力为1.0MPa～2.5MPa。

在本发明提供的生物酶解法制备GABA的方法中，所述步骤S200和S300之间还包括步骤：

S205、补料：向所述反应器中补加含有味精渣的缓冲液，维持反应液中味精渣的质量分数为5％～30％。

本发明还提供一种生物酶解法制备GABA的装置，包括依次连接的：

反应器，其中容纳反应液，反应液中的味精渣和谷氨酸脱羧酶发生脱羧反应，生物酶解产生GABA；

膜分离系统，将反应液中的一部分进行膜分离，使得谷氨酸脱羧酶、L- 谷氨酸与生物酶解产生的GABA分离，生物酶解产生的GABA穿过滤膜进入滤出液中，被截留并回流进入反应器中；

收集器，收集所述滤出液，用于干燥得到GABA粉末，或者用于层析分离后干燥得到GABA精粉。

在本发明提供的生物酶解法制备GABA的装置中，所述膜分离系统包括一级膜分离装置、二级膜分离装置；

所述一级膜分离装置使用截留分子量为50～500KDa的滤膜分离所述反应液，得到第一透过液和第一截留液，所述反应器与所述一级膜分离装置之间设置有第一回流管，所述第一截留液通过所述第一回流管回流进入反应器中，所述第一透过液进入暂储罐；

所述二级膜分离装置使用截留分子量为100～500Da的滤膜分离所述第一透过液，得到第二透过液和第二截留液，所述反应器与所述第二膜分离装置之间设置有第二回流管，所述第二截留液通过所述第二回流管回流进入反应器中；所述第二透过液即为所述滤出液，流入所述收集器。

在本发明提供的生物酶解法制备GABA的装置中，连通所述反应器与所述一级膜分离装置的管道上设置有第一循环泵；连通所述暂储罐与所述二级膜分离装置的管道上设置有第二循环泵。

在本发明提供的生物酶解法制备GABA的装置中，还包括补料器，所述补料器容纳含有味精渣的缓冲液，连通所述补料器与所述反应器的管道上设置有补料泵。

实施本发明，具有如下有益效果：本发明将味精渣作为酶解制备GABA的原料，实现了资源的充分利用；谷氨酸脱羧酶可以持续的将味精渣中的L-谷氨酸和谷氨酸钠酶解成GABA，并通过膜分离系统持续的将生物酶解产生的GABA滤出，谷氨酸脱羧酶和未反应的L-谷氨酸则回流进入反应器继续脱羧反应，滤出GABA降低了对谷氨酸脱羧酶的酶活抑制，可循环的连续化过程提高了酶的利用效率和酶解效率，低成本、高效率的制备纯度较高的GABA产品。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明生物酶解法制备GABA的装置较佳实施例的结构示意图；

图2为本发明生物酶解法制备GABA的方法较佳实施例的流程图。

具体实施方式

下面将结合实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

味精渣是味精生产过程中的副产物，将提取L-谷氨酸后的上清液干燥即可得到。味精生产过程通常是在玉米淀粉糖等底物中接种谷氨酸棒状杆菌等产谷氨酸的微生物后，经发酵生成L-谷氨酸，发酵液在除去菌体后，用酸调pH至谷氨酸的等电点，使大部分L-谷氨酸析出，再把析出的L-谷氨酸用碱中和得到谷氨酸钠。析出了L-谷氨酸的上清液中L-谷氨酸的含量达1.2％～1.5％，甚至高达2％，将提取L-谷氨酸后的上清液干燥即可得到上述的味精渣。味精渣中L-谷氨酸含量可达20％以上，谷氨酸钠含量也可达1％～5％，然而味精渣通常被当作廉价原料用作饲料或肥料，造成资源的大量浪费。

本发明的主要创新点在于，使用味精渣作为酶解制备GABA的原料，味精渣价廉且来源广泛，在适宜的酶解条件下味精渣中的L-谷氨酸、谷氨酸钠都可以被脱羧生成GABA，另外，反应液在反应器和膜分离系统之间循环流动，持续滤出生成的GABA以避免其对谷氨酸脱羧酶的反馈抑制，实现脱羧反应、膜分离、收集的连续化生产过程，并可通过补加原料持续的连续化生产，大大降低成本、提高效率。

图1示出了本发明生物酶解法制备GABA的装置较佳实施例的结构示意图，如图1所示，包括通过管道依次连接的反应器10、膜分离系统20、收集器30，其中：

反应器10，其中容纳反应液，反应液中的味精渣和谷氨酸脱羧酶发生脱羧反应，生物酶解产生GABA；

膜分离系统20，将反应液中的一部分进行膜分离，使得谷氨酸脱羧酶、L-谷氨酸与生物酶解产生的GABA分离，生物酶解产生的GABA穿过滤膜进入滤出液中，被截留并回流进入反应器10中；

收集器30，收集滤出液，用于干燥得到GABA粉末，或者用于层析分离后干燥得到GABA精粉。

在本发明的另一优选实施例中，膜分离系统20包括一级膜分离装置21、二级膜分离装置22；

一级膜分离装置21使用截留分子量为50～500KDa的滤膜分离反应液，得到第一透过液和第一截留液，反应器10与一级膜分离装置21之间设置有第一回流管11，第一截留液通过第一回流管11回流进入反应器10中，第一透过液进入暂储罐23；连通反应器10与一级膜分离装置21的管道上设置有第一循环泵41；连通暂储罐23与二级膜分离装置22的管道上设置有第二循环泵42。

二级膜分离装置22使用截留分子量为100～500Da的滤膜分离第一透过液，得到第二透过液和第二截留液，反应器10与二级膜分离装置22之间设置有第二回流管12，第二截留液通过第二回流管12回流进入反应器10中；第二透过液即为滤出液，流入收集器30。

在本发明的另一优选实施例中，生物酶解法制备GABA的装置还包括补料器50，补料器50容纳含有味精渣的缓冲液，连通补料器50与反应器10的管道上设置有补料泵43。

图2示出了本发明生物酶解法制备GABA的方法较佳实施例的流程图，如图2所示，包括如下步骤：

S100、脱羧反应：将味精渣和谷氨酸脱羧酶加入装有缓冲液的反应器10中形成反应液，在30℃～45℃的温度下进行脱羧反应，生物酶解产生GABA；

S200、膜分离：将反应液中的一部分泵入膜分离系统20，产生的GABA穿过滤膜进入滤出液中，谷氨酸脱羧酶和未反应的L-谷氨酸被截留并回流进 入反应器10中；

S300、收集：收集滤出液，干燥得到GABA粉末，或者层析分离后干燥得到GABA精粉。

本实施例的步骤S100中，味精渣中的L-谷氨酸、谷氨酸钠都可以与谷氨酸脱羧酶发生脱羧反应生成GABA，但是由于L-谷氨酸是微溶的，溶解在反应液中的L-谷氨酸量比较小，限制了脱羧反应的酶解效率，味精渣中的谷氨酸钠起到了很好的补充作用，因此在本步骤的开始阶段谷氨酸脱羧酶更多的与谷氨酸钠结合进行脱羧反应，快速酶解生成GABA。

本实施例的步骤S200中，利用滤膜的截留作用将反应液中的未反应底物、谷氨酸脱羧酶予以截留并回流进入反应器10中，避免了价格较高的谷氨酸脱羧酶的流失，提高酶的利用效率，本发明也因此可以添加较高浓度的谷氨酸脱羧酶来加快脱羧反应的速度，同时保证了反应器10中谷氨酸脱羧酶维持在较高浓度范围内，使得反应器10中始终维持较高的酶解效率；另外，持续滤出GABA可以避免其对谷氨酸脱羧酶的反馈抑制，进一步提高了谷氨酸脱羧酶的酶解效率，快速、高效的得到GABA。

本实施例的步骤S300中，滤出液可以干燥得到GABA粉末，或者通过进一步的层析去除杂质，干燥得到纯度更高的GABA精粉。

在本发明的另一优选实施例中，除具有前述技术特征外，反应液的pH为3.0～5.0，虽然随着反应的进行反应液的pH会在一定范围内变化，但是缓冲液的存在保证的反应液处在较佳的pH下，在该pH范围内，谷氨酸钠也可以很好的作为谷氨脱羧酶的底物，作为一个很好的补充以提高GABA的生成速度。反应液中味精渣的质量分数为5％～30％，反应液中谷氨酸脱羧酶的质量分数为0.5％～4％，限于味精渣中L-谷氨酸的溶解度，增加反应液中味精渣的质量分数并不能提高反应液中L-谷氨酸的溶解量，这也是常规工艺中通常只添加较低浓度的谷氨酸脱羧酶的原因，一方面其价格较贵，一次使用后即丢弃的特点使得较大量的添加造成浪费，另一方面添加较大量的谷氨酸脱羧酶也不能明显提高反应速度；本实施例中，膜分离系统20会截留谷氨酸脱羧酶并回流进入反应器10实现反复利用的目的，添加较大量的谷氨酸脱羧酶不会 照成明显的成本提高，另外由于味精渣中谷氨酸钠的存在，增加谷氨酸脱羧酶可以提高GABA的生成速度、提高底物的酶解效率。

在本发明的另一优选实施例中，除具有前述技术特征外，步骤S200中将反应液泵入膜分离系统20的过程可以是连续泵入，也可以是间歇性泵入。连续泵入是指膜分离系统20持续工作，反应液也持续泵入膜分离系统20，根据膜分离系统20的出液速率，以与出液速率相当的速率向膜分离系统20中补充反应液，截留液也持续的回流进入反应器10中。间歇性泵入是指每隔一段时间，例如10～30min，将反应液泵入膜分离系统20一次，膜分离系统20在间隔时间中完成泵入反应液的分离，并将截留液回流进入反应器10中。无论连续泵入还是间断性泵入，都以分离GABA，并回流谷氨酸脱羧酶和未反应的L-谷氨酸为目的。

在本发明的另一优选实施例中，除具有前述技术特征外，步骤S200还包括：

S201、一级膜分离：反应液使用截留分子量为50～500KDa的滤膜分离，得到第一透过液和第一截留液，第一截留液回流进入反应器10中；一级膜分离将反应液中不溶解物、分子量较大的大分子物质、细胞碎片等截留，即，没有溶解的L-谷氨酸和分子量较大的谷氨酸脱羧酶被截留，GABA和其它小分子物质则进入第一透过液。根据选用的滤膜类型和设备，过滤过程出液速率可以做相应调整，在通常的0.5～5m³的反应液体系中，一级膜分离的出液速率为1.0m³/h～10m³/h，进口压力为0.1MPa～0.35MPa。

S202、二级膜分离：将第一透过液使用截留分子量为100～500Da的滤膜分离，得到第二透过液和第二截留液，第二截留液回流进入反应器10中；第二透过液即为滤出液；谷氨酸脱羧酶和一些其它的蛋白类物质被截留，GABA和很少一部分的其它小分子物质会进入第二透过液。类似的，在通常的0.5～5m³的反应液体系中，二级膜分离的出液速率为0.2m³/h～2m³/h，进口压力为1.0MPa～2.5MPa。

在本发明的另一优选实施例中，除具有前述技术特征外，步骤S200和S300之间还包括步骤：

S205、补料：向反应器10中补加含有味精渣的缓冲液，维持反应液中味精渣的质量分数为5％～30％。与反应液泵入膜分离系统20的过程类似，该补料过程也可以使用连续泵入，也可以是间断性泵入，使得反应液中有足够反应底物存在。另外，补料时的料液体积应该与滤出液的体积相当，避免反应液的体积有较大波动。

实施例1

1、向反应器10中加入0.5m³的pH缓冲液，开启加热和搅拌，待温度升至30℃时，向其中加入5％味精渣和0.5％GAD，酶解反应10min；

2、开启第一循环泵41，使得酶解反应液连续泵入一级膜分离装置21，第一透过液从透过端进入暂储罐23，而含有酶和底物的循环液则从循环端重新回到反应器10中继续反应；其中一级膜分离装置21中的滤膜的截留分子量为50KDa，膜产水量为1.0m³/h，进口压力为0.35MPa。

3、10min后，开启第二循环泵42，将暂储罐23中的第一透过液连续泵入二级膜分离装置22，第二透过液从透过端进入收集器30中，而含有其他较大分子和二价离子的循环液则从循环端重新回到反应器10中继续反应；其中第二膜分离装置22中的滤膜的截留分子量为100Da，膜产水量为0.2m³/h，进口压力为2.5MPa。

4、开启补料泵43，以与第二透过液相同的流速向反应器10中补加含有10％的味精渣的缓冲液；

5、持续循环反应约24h，第二透过液中基本无GABA检出，结束反应，放出反应器10中的物料，用水反洗膜分离装置；

6、取出收集器30中的GABA溶液，经树脂柱层析分离后，真空浓缩，喷雾干燥得到GABA粉末，经HPLC检测GABA含量为98.55％。

实施例2

1、向反应器10中加入5m³的pH缓冲液，开启加热和搅拌，待温度升至37℃时，向其中加入30％味精渣和4％GAD，酶解反应30min；

2、开启第一循环泵41，使得酶解反应液间歇性泵入一级膜分离装置21， 第一透过液从透过端进入暂储罐23，而含有酶和底物的循环液则从循环端重新回到反应器10中继续反应；其中一级膜分离装置21中的滤膜的截留分子量为500KDa，膜产水量为10m³/h，进口压力为0.1MPa。

3、10min后，开启第二循环泵42，将暂储罐23中的第一透过液间歇性泵入二级膜分离装置22，第二透过液从透过端进入收集器30中，而含有其他较大分子和二价离子的循环液则从循环端重新回到反应器10中继续反应；其中二级膜分离装置22中的滤膜的截留分子量为500Da，膜的纯水通量为2m³/h，进口压力为1.0MPa。

4、开启补料泵43，以与第二透过液相同的流速向反应器10中补加含有15％的味精渣的缓冲液；

5、持续循环反应约48h，第二透过液中基本无GABA检出，结束反应，放出反应器10中的物料，用水反洗膜分离装置；

6、取出收集器30中的GABA溶液，真空浓缩后，喷雾干燥得到GABA粉末，经HPLC检测GABA含量为90.43％。

实施例3

1、向反应器10中加入2m³的pH缓冲液，开启加热和搅拌，待温度升至40℃时，向其中加入20％味精渣和1.5％GAD，酶解反应15min；

2、开启第一循环泵41，使得酶解反应液连续泵入一级膜分离装置21，第一透过液从透过端进入暂储罐23，而含有酶和底物的循环液则从循环端重新回到反应器10中继续反应；其中一级膜分离装置21中的滤膜的截留分子量为300KDa，膜产水量为2.0m³/h，进口压力为0.15MPa。

3、10min后，开启第二循环泵42，将暂储罐23中的第一透过液连续泵入二级膜分离装置22，第二透过液从透过端进入收集器30中，而含有其他较大分子和二价离子的循环液则从循环端重新回到反应器10中继续反应；其中二级膜分离装置22中的滤膜的截留分子量为220Da，膜的纯水通量为0.4m³/h，进口压力为1.2MPa。

4、开启补料泵43，以与第二透过液相同的流速向反应器10中补加含有 15％的味精渣的缓冲液；

5、持续循环反应约36h，第二透过液中基本无GABA检出，结束反应，放出反应器10中的物料，用水反洗膜分离装置；

6、取出收集器30中的GABA溶液，真空浓缩后，喷雾干燥得到GABA粉末，经HPLC检测GABA含量为91.58％。

显然，上面描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。