本发明属于药物领域，具体涉及从小豆蔻的干燥成熟果实中分离得到的一种高度氧化的新化合物及其制备方法和医药用途。
背景技术：
：植物小豆蔻为多年生草本。根茎粗壮，棕红色。叶两列，叶片狭长披针状，叶鞘具棕黄色柔毛。穗状花序由茎基部抽出。花序显著伸长，花排列稀疏，花冠白色。果实长卵圆形，果皮质韧，不易开裂。种子团分3瓣，每瓣种子5～9枚，种子气味芳香而峻烈。主产越南、斯里兰卡和印度南部的马拉巴(Malabar)海岸。实成熟时收采，除去残留的果柄，晒干。使用部分为姜科植物小豆蔻的干燥果实。药材小豆蔻为姜科植物小豆蔻Elettariacardamomum(L.)Maton的干燥近成熟果实，是藏医与维吾尔医用药，以“加素”之名始载于《四部医典》，现被多国药典收载。小豆蔻是世界著名的植物药与香料，被称为“香料之后”，原产于印度南部、斯里兰卡及瓜地马拉等地，在印度传统医学中使用历史超过两千年，具有祛风、健胃的功效。目前中医很少使用，小豆蔻曾以“豆蔻”之名收载于1953年版中国药典。小豆蔻已报道的成分主要为挥发油，以及多糖与蛋白质，推测还含有黄酮类化合物，但目前尚未见黄酮类成分单体的分离与鉴定。挥发油是小豆蔻中重要的活性成分，含量高达7％，超声提取得到的挥发油以α-乙酸松油脂、桉油精、芳樟醇、α-松油醇、乙酸芳樟酯为主，与超临界CO2提取所得成分类似；如以正己烷提取，挥发油组分有所不同，为柠檬烯、桉油精、萜品油烯、月桂烯。此外，还含有麝香草醇、橙花基醋酸酯、蒎烯、橙花叔醇、香桧烯等。小豆蔻药理活性多样，尤以抗肿瘤活性报道最多，涉及皮肤、肺、结肠等多个部位的肿瘤，对胃肠道也有较好的保护作用，此外，还具有抗菌、抗氧化、抗炎、镇痛等作用。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种从小豆蔻的干燥成熟果实中分离得到的一种高度氧化的新化合物；本发明的另一目的在于提供该新化合物的制备方法；本发明的再一目的在于提供该化合物用于制备治疗胃癌药物的医药用途。本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)小豆蔻的干燥成熟果实粉碎，用80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，依次用10％乙醇和75％乙醇洗脱，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1、45:1、20:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗胃癌的药物中的应用。所述的药物组合物在制备治疗胃癌的药物中的应用。本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水 性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。说明书附图图1为化合物(Ⅰ)结构式。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证药材和试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。小豆蔻的干燥成熟果实购自安徽亳州中药材市场，产地福建。制备方法：(a)小豆蔻的干燥成熟果实(10kg)粉碎至绿豆大小，用80％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(6L)，依次用石油醚(6L×3次)、乙酸乙酯(6L×3次)和水饱和的正丁醇(6L×3次)萃取，浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(305g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用纯净水溶解至2L，医用脱脂棉过滤，滤液用AB-8型大孔树脂分离，依次用10％乙醇(10L)和75％(12L)乙醇洗脱，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏(142g)；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为90:1(10个柱体积)、45:1(9个柱体积)、20:1(8个柱体积)、10:1(8个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分3(35g)用200-300目正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1(8个柱体积)、20:1(10个柱体积)和10:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(10g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶ODS-C18分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(23mg)。结构确证：白色针状结晶，易溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮和甲醇；HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z899.4004，结合核磁特征可得分子式为C45H64O17，不饱和度为14。核磁共振氢谱数据δH(ppm,DMSO-d6,600MHz)：H-2(2.47，dd，J＝12.0，2.4)，H-2(2.53，d，J＝12.0)，H-4(1.58，bt，J＝14.4，3.6)，H-4(1.94，t，J＝12.6)，H-5(4.20，t，J＝17.4)，H-6(1.44，q，J＝12.0)，H-6(1.72，m)，H-7(5.11，dd，J＝4.8，11.4)，H-10(1.70，m)，H-10(2.12，m)，H-11(3.96，t，J＝8.4)，H-12(2.22，d，J＝8.4)，H-12(2.11，d，J＝8.4)，H-14(1.94，d，J＝10.2)，H-14(3.68，d，J＝10.2)，H-15(4.16，m)，H-16(5.41，ddd，J＝1.2，7.2， 15.6)，H-17(5.92，dd，J＝4.8，16.2)，H-18(2.66，m)，H-20(4.99，s)，H-22(2.02，m)，H-22(3.70，m)，H-23(4.05，m)，H-24(1.84，m)，H-24(1.99，m)，H-25(5.21，m)，H-27(1.23，d，J＝6.6)，H-28(1.05，s)，H-29(0.95，s)，H-30(5.69，s)，H-32(0.90，d，J＝6.6)，H-33(6.05，s)，H-35(3.72，s)，H-36(3.69，s)，3-OH(4.24，d，J＝12.6)，19-OH(5.46，s)，26-OH(3.20，br，s)，H-3’(1.20，s)，H-4’(1.20，s)，H-5’(1.20，s)，H-2”(2.34，m)，H-3”(1.65，m)，H-4”(0.95，t，J＝7.2)；核磁共振碳谱数据δC(ppm,DMSO-d6,150Hz)：172.4(C，1-C)，42.1(CH2，2-C)，219.1(C，3-C)，39.8(CH2，4-C)，65.6(CH，5-C)，33.1(CH2，6-C)，72.5(CH，7-C)，41.3(C，8-C)，101.8(C，9-C)，42.1(CH2，10-C)，71.3(CH，11-C)，44.1(CH2，12-C)，156.5(C，13-C)，36.4(CH2，14-C)，78.7(CH，15-C)，132.4(CH，16-C)，132.5(CH，17-C)，39.7(CH，18-C)，99.5(C，19-C)，73.2(CH，20-C)，150.9(C，21-C)，31.6(CH2，22-C)，64.6(CH，23-C)，35.6(CH2，24-C)，73.5(CH，25-C)，213.1(C，26-C)，19.6(CH3，27-C)，17.0(CH3，28-C)，21.0(CH3，29-C)，114.3(CH，30-C)，166.7(C，31-C)，10.9(CH3，32-C)，120.5(CH，33-C)，166.7(C，34-C)，51.1(CH3，35-C)，51.0(CH3，36-C)，178.0(C，1’-C)，39.0(C，2’-C)，27.1(CH3，3’-C)，27.1(CH3，4’-C)，27.1(CH3，5’-C)，172.4(C，1”-C)，36.4(CH2，2”-C)，18.5(CH2，3”-C)，13.6(CH3，4”-C)；碳原子标记参见图1。红外提示其含有羟基(3459cm-1)和羰基(1723cm-1)基团。由于C-16/C-17的共轭双键含有较大的耦合常数(16.2Hz)，故为反式结构。NOESY谱中，H-20和H-33相关性的增强以及H-33和H-22相关性的减弱表明C-21/C-33的双键为反式构结构。NOESY谱中，H-5/H-7、H-7/H3-29、H3-29/H-11、H-11/H-15、H-15/H-17、H-17/H-18和3-OH/26-OH的相关性表明这些质子为α构型。H3-32/19-OH、H3-32/H-20、H-20/19-OH、H-23/H-26和H-23/H-3的交叉峰，表明这些基团为β构型。最终确定该化合物结构如图1所示。实施例2：化合物(Ⅰ)药理作用试验一、材料和仪器人胃癌细胞株SGC-7901，购于赛尔试剂公司；化合物(Ⅰ)自制，归一化纯度大于98％；CTX(环磷酰胺，阳性药)、胰蛋白酶、MTT、二甲基亚砜(DMSO)、琼脂糖、冰醋酸购于美国Sigma公司；RPMI-1640培养基、PBS磷酸盐缓冲溶液购于美国GIBCO公司；胎牛血清购于山东银香伟业公司；台盼蓝购自北京中杉金桥生物技术有限公司；TUNEL试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物公司；甲醛购自美国Fisher公司；过氧化氢酶购自天津市天新精细化工开发中心。WD-9403C紫外分析仪购自德国Biometra公司；RKI-1002型二氧化碳培养箱购自日本Ikemoto公司；超净工作台购自苏州净化实验设备有限公司；超速离心机购自北京医疗器械厂；低速离心机购自北京医疗器械厂；WilovertS型倒置显微镜购自日本Olympus公司；压力蒸汽灭菌器购自上海博讯实业有限公司；恒温金属水浴箱购自杭州奥盛仪器有限公司；恒温磁力搅拌器购自天津劳尔科技有限公司；细胞计数板购自上海精密仪器公司；超纯水器购自英国PURELABulTRAGENETIC。二、试验方法1、胃癌细胞SGC-7901的培养1.1细胞复苏(1)从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速置于37℃-42℃，75％酒精中，然后移至同温水浴锅中；(2)轻轻晃动l-3min冻存管，使冻存液融化，迅速移至超净台中；(3)将含有细胞的冻存液吸入无菌离心管，加入适量RPIM-1640培养基；(4)吹打混匀后放入低速离心机，800rpm/min离心3分钟，去除上清液；(5)加入适量培养基吹匀，将细胞悬液依据浓度接种到10mL培养皿中；(6)置于含5％二氧化碳、37℃饱和湿度的培养箱中培养。1.2细胞传代(1)待培养皿中的细胞贴壁约80％时，在超净台中用移液管吸取旧的培养基吹打数次培养皿中细胞，以吹掉死亡细胞；(2)用移液管吸去旧培养基，加入适量0.25％胰酶消化细胞，置于30℃培养箱中消化；(3)约3min后将培养皿置于倒置显微镜下观察，待细胞周边发亮、回缩变圆后则说明细胞已经从壁上脱离；(4)迅速于超净台中吸去胰酶。加入适量培养基反复吹打细胞，使细胞完全脱离培养皿；(5)将细胞悬液按浓度分别接种至不同的培养皿中，补足培养基；(6)重新置于含5％CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养。2、细胞计数(1)准备好细胞计数板及盖玻片，二者均用酒精擦拭干净，将盖玻片盖在计数板上；(2)待酒精挥发后，吸出适量细胞悬液，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间，注意不要溢出盖玻片及两侧的玻璃槽，静置后计数；(3)在显微镜下找到4个大格，每个大格又分为16个小格，分别计数4个大格中的细胞数，取平均值。压线细胞计左侧和上方的，不计右侧和下方的；(4)细胞浓度(个/mL)＝每个方格的平均细胞数×10000；(5)将细胞悬液稀释成实验所需浓度。3、细胞活力测定(1)取待测定的SGC-7901胃癌细胞悬液0.9mL；(2)向细胞悬液中加入台盼蓝吹打混匀；(3)采用细胞计数板盲法计数至少200个细胞，倒置显微镜下观察；(4)镜下观察 细胞染色情况，细胞内染成淡蓝色者为死细胞，未染色者为活细胞，以活细胞所占细胞总数的百分比反映细胞的活力(％)。4、MTT检测细胞生长抑制率实验分组：①阴性对照组；②化合物(Ⅰ)组1，化合物(Ⅰ)(50μmol/L)；③化合物(Ⅰ)组2，化合物(Ⅰ)(100μmol/L)；④CTX组1，CTX(50μmol/L)；⑤CTX组2，CTX(100μmol/L)；⑥联合用药组1，化合物(Ⅰ)(25μmol/L)+CTX(25μmol/L)；⑦联合用药组2，化合物(Ⅰ)(50μmol/L)+CTX(50μmol/L)。(1)取对数生长期的SGC-7901细胞，用细胞计数板计数，调节细胞浓度为5×l05/mL；(2)使用加样器以每孔100μL接种于96孔板。注意接种时只接种到中间的60个孔，周边36孔以PBS填充，同时铺3个96孔板；(3)将铺好的96孔板置于37℃，5％CO2细胞培养箱中，待24h细胞贴壁后取出；(4)将96孔板分为化合物(Ⅰ)组，(0、50、100μmol/L)，CTX组(0、50、100μmol/L)，2药联合组(0/0、25/25、50/50μmol/L)，同时设立不含细胞的空白对照组(只加培养基)分别予以不同处理；(5)各药物每个浓度设5个复孔，分别培养24、48及72h；(6)分别在特定的结束时间点取出96孔板，每孔加入MTT(5g/L)溶液20μL，放回培养箱继续培养4h，终止培养。(7)小心吸去孔内上清液，每孔加入150μLDMSO，平板摇床振荡10min使结晶充分溶解，显微镜下观察颗粒消失。(8)于酶标仪490nm波长处测定各孔的光密度(OD)值，计算各时间点的细胞生长抑制率。抑制率＝[1-(加药组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)]×100％。5、TUNEL法检测细胞凋亡指数5.1细胞爬片的制备(1)盖玻片的处理：将盖玻片置于浓硫酸中浸泡过夜，次日先用自来水冲洗数次，再置于无水乙醇中浸泡4h，然后用去离子水冲洗干净，放在供干箱中烘干后进行高压消毒，取出直接放入超净台中备用。6孔板置于超净台内紫外线照射30min；(2)放置盖玻片：在六孔板的每孔中准备放盖玻片的位置滴入少量培养基后再放置盖玻片，使得盖玻片与孔板考培养基的张力粘合到一起，防止加细胞悬液时盖玻片飘起，造成双层细胞贴壁；(3)取对数生长期的SGC-7901细胞，消化吹打成细胞悬液，用细胞计数板调整细胞浓度为l×106/mL。(4)用加样器在放有盖玻片的每孔分别加入1mL细胞悬液，同时铺3板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h待细胞贴壁；(5)24小时细胞贴壁后在超净台中将6孔板分为阴性对照组和实验组分别予以不同处理，阴性对照组加1mL培养基，实验组再分为化合物(Ⅰ)组、CTX组及联合用药组3个亚组，每孔加1mL药物。化合物(Ⅰ)组终浓度为100μmol/L，CTX组终浓度为100μmol/L，2药联合组终浓度为2种药物各为50μmol/L每组设2个复孔。(6) 置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中继续培养。5.2TUNEL法操作步骤(1)细胞爬片加药培养24h时取出6孔板，按照TUNEL说明书依次进行如下步骤；(2)小心吸弃每孔里的上清液；(3)每个孔加入PBS(4℃)2mL，平板摇床冲洗5min×3次；(4)每孔加入1mL预冷细胞固定液，4℃冰箱固定30min。(5)吸弃固定液，每个孔加入PBS(4℃)2mL，平板摇床冲洗5min×3次。(6)浸入封闭液中，室温(15℃-25℃)封闭10min。(7)每个孔加入PBS(4℃)2mL，平板摇床冲洗5min×3次。样品周围用吸水纸吸干。(8)每个样本滴加50μLUTdT酶反应液，37℃，避光湿润反应60min。(9)每个孔加入PBS(4℃)2mL，平板摇床冲洗5min×3次。样品周围用吸水纸吸干。(10)滴加50μLStreptavidin-HRP工作液，37℃，避光湿润反应30min。(11)每个孔加入PBS(4℃)2mL，平板摇床冲洗5min×3次。(12)滴加100μLDAB工作液，室温显色反应10min。(13)每个孔加入PBS(4℃)2mL，平板摇床冲洗5min×3次。(14)光学显微镜下观察拍照:随机选取10个高倍(×100)视野，每个视野计数100个细胞，计算调亡指数的平均值。凋亡指数(AI)＝(阳性细胞数/总细胞数×100％)。阳性细胞的细胞核呈棕褐色。6、统计学分析采用SPSS11.5分析，组间比较用Oneway-ANOVA法进行分析，两两比较采用LSD-t法，P<0.05为差异有统计学意义。三、结果及结论1、MTT检测药物对SGC-7901胃癌细胞的生长抑制率经3次重复MTT，检测结果显示，单个药物作用于胃癌细胞72h后，100μmol/L的药物组较50μmol/L的药物组对胃癌细胞的生长抑制率均较高，差异有统计学意义(P<0.05)。50μmol/L化合物(Ⅰ)对胃癌细胞的生长抑制作用与联合用药25/25μmol/L组差异无统计学意义(P>0.05)。50μmol/L的CTX对胃癌细胞生长抑制作用与联合用药25/25μmol/L组比，差异有统计学意义(P<0.05)。联合用药50/50μmol/L对胃癌细胞生长抑制率高于各高浓度单药组(100μmol/L)对胃癌细胞的生长抑制率，差异有统计学意义(P<0.001)，见表1。2、TUNEL法检测各组凋亡指数化合物(Ⅰ)、CTX及联合用药组均对胃癌细胞SGC-7901有抑制生长的作用，各组与阴性对照组比较差异均有统计学意义(P<0.001)，阴性对照组有少量细胞的胞核被染成棕褐色，各个单药组与联合用药组凋亡细胞较阴性对照组相比均有增加，联合用药组细胞凋亡指数最高，对胃癌细胞抑制效果更显著。见表2。结论表明，化合物(Ⅰ)单独作用于胃癌细胞可以抑制胃癌细胞的增殖，促进细胞的凋 亡，随着浓度的增大，对胃癌细胞的抑制生长作用呈增强趋势。化合物(Ⅰ)与CTX联合应用后促进胃癌细胞的凋亡效果更显著，细胞的生长抑制率及凋亡指数均较单独用药组升高。因此，化合物(Ⅰ)可以单独开发成治疗胃癌的药物，也可以与CTX等抗癌药物联合开发成复方药物治疗胃癌。表1各组不同时间点对胃癌细胞抑制率(n＝5，均值±偏差)*P<0.05，**P<0.01组别n24h48h72h化合物(Ⅰ)50μmol/L(1)514.87±5.1916.29±4.5355.70±6.67化合物(Ⅰ)50μmol/L(2)531.00±6.3659.42±7.7474.32±5.84CTX50μmol/L(3)524.87±9.0436.83±5.2140.58±7.15CTX100μmol/L(4)542.86±6.2844.21±8.4450.31±4.63联合用药25/25μmol/L(5)536.43±8.1338.76±10.8758.55±9.53联合用药50/50μmol/L(6)549.38±2.2474.56±10.5996.12±2.25F/17.918**29.646**47.625**P(1):(2)/0.001<0.001<0.001(3):(4)/<0.0010.1690.025(5):(6)/0.005<0.001<0.001(1):(5)/<0.001<0.0010.49(3):(5)/0.010.713<0.001(2):(6)/<0.0010.008<0.001(4):(6)/0.13<0.001<0.001表2药物作用24h后各组细胞的凋亡指数(n＝3，均值±偏差)**P<0.01实施例3片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。实施例4口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。实施例5胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。实施例6注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。实施例7无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。当前第1页1 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