一种卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的捕集方法、提取方法及测定方法与流程

本发明涉及一种卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的捕集方法、提取方法及测定方法，属于卷烟主流烟气的理化检验
技术领域：
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背景技术：
：羰基化合物是卷烟主流烟气中的一类重要有害成分，被列入加拿大政府46种有害成分名单和who“烟草制品管制研究小组”建议的管制成分清单，因而准确测定卷烟烟气中的挥发羰基化合物对于卷烟危害性评价有重要意义。目前，国内有关卷烟主流烟气中羰基化合物的检测普遍采用《yc/t254-2008》所规定的高效液相色谱法，此方法的缺点是样品测定时间长，消耗有机溶剂多，同时由于液相色谱紫外检测器灵敏度有限，对于测定含量较低的样品中的羰基化合物则灵敏度不够。烟草特有亚硝胺包括n-亚硝基降烟碱(nnn)、4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(nnk)、n-亚硝基假木贼碱(nab)和n-亚硝基新烟碱(nat)。国际癌症研究机构(iarc)(1986)在实验动物中有足够的证据后认为nnk和nnn在人体中可能有致癌性。由于nab对实验动物的致癌性的证据较少，并且nat对实验动物的致癌性的资料不充分，所以iarc认为nab和nat对人体的致癌性尚不能确定。羰基化合物和烟草特有亚硝胺由于生物毒性较强，被列入hoffman清单。加拿大政府也早在1998年就将它们规定为烟草生产企业必须披露含量的化学成分。世界卫生组织在《烟草制品管制的科学基础第951号技术报告》中公布了卷烟烟气9种优先级成分，甲醛、乙醛、丙烯醛、nnn和nnk名列其中，受到重点研究和管控。因此，建立准确、高效的卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的检测方法，对卷烟监测、推进履约工作等方面具有重要意义。羰基化合物和烟草特有亚硝胺的同时检测难点在于目标物的捕集。在主流烟气中羰基化合物主要存在于气相物里，而烟草特有亚硝胺主要在粒相物中分布，因此，传统的滤片不能够有效的同时捕集卷烟主流烟气中的羰基化合物和烟草特有亚硝胺。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的捕集方法，实现了一次抽吸烟即可同时捕集卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺。本发明第二个目的在于提供一种卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的提取方法，节省了大量有机溶剂的消耗。本发明第三个目的在于提供一种卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的测定方法。为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的捕集方法，包括以下步骤：1)将0.20mol/l的盐酸与无水乙醇按照1:1的体积比配制成预处理液；2)取预处理液于标准滤片上，平衡2h，得预处理滤片；3)取标准滤片作为辅助滤片，将卷烟主流烟气依次通过所述预处理滤片和辅助滤片，对卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺进行捕集；所述羰基化合物为甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮和丁醛；所述烟草特有亚硝胺为nnn、nnk、nat和nab。步骤2)中预处理液的体积为2ml。所述标准滤片为未经预处理液处理的剑桥滤片。所述预处理滤片设置于滤片夹持器中烟气进入的一端，所述辅助滤片设置于滤片夹持器中烟气流出的一端。所述预处理滤片和辅助滤片均正面朝上。一种卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的提取方法，包括以下步骤：a)样品的捕集：将0.20mol/l的盐酸与无水乙醇按照1:1的体积比配制成预处理液；取预处理液于标准滤片上，平衡2h，得预处理滤片；取标准滤片作为辅助滤片，将卷烟主流烟气依次通过所述预处理滤片和辅助滤片，对卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺进行捕集；所述羰基化合物为甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮和丁醛；所述烟草特有亚硝胺为nnn、nnk、nat和nab；b)样品的提取：将捕集羰基化合物和烟草特有亚硝胺的预处理滤片和辅助滤片置于0.01mol/l的盐酸中震荡，然后过滤，即得提取液。所述预处理滤片设置于滤片夹持器中烟气进入的一端，所述辅助滤片设置于滤片夹持器中烟气流出的一端。所述预处理滤片和辅助滤片均正面朝上。步骤b)中震荡具体为：室温下以150r/min的转速旋转震荡40min。步骤b)中过滤为用0.22μm水相滤膜过滤。一种卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的测定方法，包括以下步骤：将上述步骤b)所得提取液与衍生化试剂混合反应15min，过滤，之后进行高效液相色谱测定。所述衍生化试剂的制备方法为：取1.0g的2,4-二硝基苯肼加入25ml磷酸，然后用乙腈定容至50ml即得。上述过滤为0.22μm有机相滤膜过滤。所述高效液相色谱测定用于检测卷烟主流烟气中的羰基化合物甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮和丁醛。所述高效液相色谱的测定条件为：色谱柱：acclaimexplosivee2色谱柱；柱温：30℃；流动相a：水，流动相b：乙腈；柱流量：1.0ml/min；进样体积：10μl；检测器：紫外串联荧光检测器。所述acclaimexplosivee2色谱柱，具体为250mm×4.6mm，填料粒度5μm；柱温：30℃。上述高效液相色谱测定时利用流动相a和流动相b进行梯度洗脱。所述梯度洗脱程序为：初始a为50％，b为50％；20mina为50％，b为50％；25mina为40％，b为60％；30mina为40％，b为60％；35mina为20％，b为80％；40mina为10％，b为90％；41mina为50％，b为50％；45mina为50％，b为50％。所述紫外检测器检测波长为365nm。所述荧光检测器激发波长为284nm，发射波长为330nm。上述卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的测定方法，还包括以下步骤：将上述步骤b)所得提取液进行高效液相色谱-串联质谱进行测定。所述高效液相色谱-串联质谱用于检测卷烟主流烟气中的烟草特有亚硝胺nnk、nnn、nat和nab。所述提取液在进行高效液相色谱-串联质谱测定前加入5μl浓度为1mg/ml的内标储备液。所述内标储备液中nab-d4、nat-d4、nnk-d4和nnn-d4的浓度均为1mg/ml。所述高效液相色谱-串联质谱的高效液相色谱的测定条件为：色谱柱：proshellc18柱；流速：0.22ml/min；柱温：60℃；进样量：10μl；流动相a：水，流动相b：0.1％的乙酸甲醇溶液；所述高效液相色谱-串联质谱的质谱测定条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测。上述色谱柱proshellc18柱，2.5μm，2.1mm×50mm。所述0.1％的乙酸甲醇溶液指乙酸的体积分数为0.1％的乙酸甲醇溶液。上述利用流动相a和b进行洗脱为梯度洗脱。所述洗脱梯度为：初始a为100％，b为0；3.0mina为10％，b为90％；4.0mina为10％，b为90％；5.0mina为0，b为100％；6.0mina为100％，b为0％；10.0mina为100％，b为0。所述多反应监测nnk、nnn、nat、nab的定量离子对依次为208＞122，178＞148，190＞160，192>162；定性离子对依次为208>79,178>105，190>79，192>133；nnk-d4、nnn-d4、nat-d4、nab-d4的定量离子对依次为212>126、182>152、194>164、196>166。本发明的有益效果是：本发明卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的捕集方法，是一种原位捕集方法，通过对滤片进行预处理，一次吸烟即可实现对主流烟气中羰基化合物(甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛)和烟草特有亚硝胺(nnn、nnk、nat、nab)12种代表性有害成分的同时捕集，使得工作效率提高了一倍，同时也能够消除溶液法捕集造成的死体积较大的影响。本发明卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的提取方法，先利用预处理滤片对羰基化合物和烟草特有亚硝胺进行捕集，再将捕集后的滤片置于0.01mol/l的盐酸中震荡萃取，过滤，即得提取液。本发明卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的提取方法简单，且用盐酸水溶液进行萃取，节省了大量有机试剂的消耗，在降低成本的同时，减少了检测工作对于环境和检测人员健康的危害。本发明卷烟主流烟气中主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的测定方法，建立在上述捕集、提取方法之上，消耗有机溶剂极少，符合绿色化学的要求，更加环保高效，且灵敏度高、重复性和回收率好，可以实现对主流烟气中有害成分的高通量检测。附图说明图1为本发明实施例1卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的测定方法的流程图；图2为实施例1羰基化合物标准工作溶液的色谱图；图3为实施例1样品主流烟气中羰基化合物的色谱图；图4为实施例1烟草特有亚硝胺系列标准工作溶液的色谱图；图5为实施例1样品主流烟气中烟草特有亚硝胺的色谱图。具体实施方式本发明实施例中所用试剂与仪器：标准物质：甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的2，4-二硝基苯腙衍生物标准品购自于德国dr.ehrenstorfer公司；氘代-n-亚硝基假木贼碱，纯度≥99％；氘代-n-亚硝基新烟碱，纯度≥99％；氘代-4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮，纯度≥99％；氘代-n-亚硝基降烟碱，纯度≥99％；n-亚硝基假木贼碱，纯度≥98％；n-亚硝基新烟碱，纯度≥98％；4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮，纯度≥98％；n-亚硝基降烟碱，纯度≥98％。试剂：乙腈(色谱纯，韩国duksanpurechemicals公司)；甲醇(色谱纯，美国fisher公司)；乙酸铵，分析纯，纯度≥98％；乙酸，分析纯，纯度≥98％；实验用水为milli-q纯水系统所制去离子水；2,4-二硝基苯肼(dnph)(ar，天津市瑞金特化学品有限公司)(使用前重结晶)；磷酸(ar，美国sigma-aldrich公司)。仪器：高效液相色谱仪(安捷伦公司)；液相色谱-串联质谱联用仪(美国ab公司)；sm450直线型吸烟机(英国cerulean公司)；电子分析天平，感量：0.0001g，(瑞士mettler公司)；hy-6双层调速振荡器(国华电器有限公司)；有机相针式滤器，13mm×0.22μm(上海安谱科学仪器有限公司)。实施例1本实施例卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的捕集方法，包括以下步骤：1)将浓度为0.20mol/l的盐酸水溶液与无水乙醇按照体积比1：1配制成预处理液；2)准确移取2ml预处理液均匀添加于剑桥滤片上，继续平衡两小时，得预处理滤片；3)取标准滤片作为辅助滤片，在滤片夹持器中放入一张预处理滤片和一张辅助滤片，预处理滤片设置于滤片夹持器中烟气进入的一端，辅助滤片设置于滤片夹持器中烟气流出的一端，均为正面朝上，使卷烟主流烟气依次通过预处理滤片和辅助滤片，对卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺进行捕集。本实施例卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的提取方法，包括以下步骤：a)样品的捕集：将0.20mol/l的盐酸水溶液与无水乙醇按照1:1的体积比配制成预处理液；取2ml预处理液于剑桥滤片上，平衡2h，得预处理滤片；取标准滤片作为辅助滤片，在滤片夹持器中放入一张预处理滤片和一张辅助滤片，预处理滤片设置于滤片夹持器中烟气进入的一端，辅助滤片设置于滤片夹持器中烟气流出的一端，均为正面朝上，用sm450直线型吸烟机按照gb/t19609规定进行4支卷烟的抽吸，使卷烟主流烟气依次通过预处理滤片和辅助滤片，对卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺进行捕集；b)样品的提取：抽吸完毕，将两张滤片取出，用25mg的脱脂棉球擦拭捕集器，同滤片一起放入100ml锥形瓶中，准确加入50ml浓度为0.01mol/l的盐酸水溶液，室温下以150r/min转速，旋转震荡40min，萃取液经0.22μm水相滤膜过滤，即得。本实施例卷烟主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的测定方法，如图1所示，包括以下步骤：1.样品的捕集：同上述步骤a)；2.样品的提取：同上述步骤b)，得提取液；3.样品的测定3.1羰基化合物的测定3.1.1衍生化试剂的配制称取1.0g的2,4-二硝基苯肼(dnph)固体于50ml棕色容量瓶中，加入25ml磷酸后用乙腈定容，即得。3.1.2衍生化处理移取2ml上述所得提取液加入到5ml容量瓶中，同时加入3ml衍生化试剂进行衍生化，混合均匀后，等待15分钟至反应完全，得反应液，取适量反应液用0.22μm有机相滤膜过滤后，转移至2ml色谱瓶中，得待测液。3.1.3标准工作溶液的配制分别准确称取30mg的丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的2，4-二硝基苯腙衍生物标准品，40mg甲醛和50mg乙醛的2，4-二硝基苯腙衍生物标准品至不同的25ml的容量瓶中，精确至0.1mg，分别用乙腈定容作为一级储备液，此溶液密封于4℃存放，有效期为一年；然后分别移取1.0ml的乙醛dnph溶液，0.75ml的丙酮dnph溶液，0.5ml甲醛、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的dnph溶液至25ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，此为二级储备液，密封于4℃存放，有效期为20天；然后分别移取0.05ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、2.0ml、4.0ml、7.0ml和10.0ml的二级储备液至10ml的容量瓶中，用乙腈定容，配置8级具有一定浓度梯度的标准工作溶液，有效期为20天，具体如表1所示，单位μg/ml。表1羰基化合物的标准工作溶液名称12345678甲醛0.02260.09040.18070.36140.90351.80703.16234.5176乙醛0.08440.33750.67491.34993.37476.749411.811416.8734丙酮0.04550.18180.36370.72741.81843.63686.36439.0919丙烯醛0.03050.12210.24410.48821.22052.44114.27196.1027丙醛0.03030.12110.24230.48461.21152.42304.24026.0574巴豆醛0.03050.12220.24440.48881.22202.44404.27696.10992-丁酮0.03120.12500.25000.50001.24992.49984.37476.2495丁醛0.02650.10610.21220.42431.06082.12163.71285.30403.1.4标准工作溶液及待测液的测定标准工作曲线的制作：利用高效液相色谱仪对标准工作溶液进行测定，色谱测定条件如下：色谱柱：acclaimexplosivee2色谱柱，250mm×4.6mm，填料粒度5μm；柱温：30℃；流动相a：水；流动相b：乙腈；柱流量：1.0ml/min；进样体积：10μl。检测器：紫外串联荧光检测器，紫外检测器波长为365nm，荧光检测器激发波长284nm，发射波长330nm。流动相采用梯度洗脱，洗脱梯度如表2所示。所得标准工作溶液的色谱图如图2所示，纵坐标为丰度，横坐标为时间。根据标准工作溶液的高效液相色谱分析结果，分别以8种羰基化合物浓度与响应峰面积绘制标准曲线，如表3所示。表2洗脱梯度浓度时间/min流动相a/％流动相b/％05050205050254060304060352080401090415050455050表3羰基化合物的标准工作曲线和检测限注：检出限以3倍信噪比(s/n＝3)计算。采用高效液相色谱上述所得待测液进行测定，所得色谱图如图3所示；紫外串联荧光检测器进行检测，外标法定量，高效液相色谱分析条件同标准工作溶液的测定，测定结果如表4所示。表4主流烟气中羰基化合物的检测结果化合物含量(μg/支)甲醛83.2乙醛574.7丙酮239.3丙烯醛65.0丙醛53.9巴豆醛18.22-丁酮56.1丁醛30.73.2烟草特有亚硝胺的测定3.2.1系列标准工作溶液及内标储备液的配制内标储备液的配制：各称取约10.0mg的nab-d4、nat-d4、nnk-d4和nnn-d4，用甲醇完全溶解后，分别转移至4个10ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度均为1.0mg/ml的内标储备液。该内标储备溶液于-18℃条件下避光保存，有效期为六个月。系列标准工作液的配制：各称取10.0mg的nab、nat、nnk和nnn，用甲醇完全溶解后，分别转移至4个10ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度均为1.0mg/ml的标准储备液。该储备液于-18℃条件下避光保存，有效期为六个月。一级混合标准溶液：分别移取nab、nat、nnk和nnn的标准储备液1.0ml、4.0ml、4.0ml和4.0ml至100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成nab、nat、nnk和nnn浓度分别为10μg/ml、40μg/ml、40μg/ml和40μg/ml的一级混合标准溶液。该溶液置于-18℃冰箱内避光保存，有效期为六个月。二级混合标准溶液：移取1.0ml一级混合标准溶液至100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成nab、nat、nnk和nnn浓度分别为0.1μg/ml、0.4μg/ml、0.4μg/ml和0.4μg/ml的二级混合标准溶液。该溶液置于-18℃冰箱内避光保存，有效期为三个月。系列标准工作溶液：向7个不同的100ml容量瓶中分别加入10ml0.1mol/l乙酸铵溶液，然后分别移取不同的二级混合标准溶液置于不同的100ml容量瓶中，再分别加入5μl浓度为1mg/ml的内标储备液，接着加入适当体积的甲醇，最后用0.1mol/l乙酸铵溶液定容至刻度，即配制成7级标准工作溶液，其内标浓度均为50.0ng/ml，具体参数见表5。表5烟草特有亚硝胺的系列标准工作溶液浓度(μg/ml)名称1234567nnn0.00050.0010.0020.0040.0080.020.1nnk0.00050.0010.0020.0040.0080.020.1nat0.00050.0010.0020.0040.0080.020.1nab0.0001250.000250.00050.0010.0020.0050.0253.1.4系列混合标准工作溶液及待测液的测定标准曲线的制作：取系列标准工作溶液进行液相色谱-串联质谱分析，分析条件色谱柱：proshellc18柱(2.5μm，2.1mm×50mm)或等效柱；流速：0.22ml/min；柱温：60℃；进样量：10μl；流动相a：水，流动相b：0.1％乙酸甲醇溶液；梯度洗脱条件见表6。串联质谱仪测定条件如下：离子源：电喷雾离子源(esi)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(mrm)，各分析物的定量离子对、定性离子对见表7。所得系列标准工作溶液的色谱图如图4所示，其中图4中(a)、(b)、(c)、(d)分别为nnn、nnk、nat、nab的色谱图。表6液相色谱梯度洗脱条件时间(min)流动相a(％)流动相b(％)010003.010904.010905.001006.0100010.01000程序运行结束，以目标分析物峰面积和相应同位素峰面积之比对目标分析浓度作回归分析，即得各目标分析物的标准曲线，参数见下表8。表7目标分析物的定量离子对和定性离子对分析物定量离子对(m/z)定性离子对(m/z)nnk208>122208>79nnk-d4212>126n/annn178>148178>105nnn-d4182>152n/anat190>160190>79nat-d4194>164n/anab192>162192>133nab-d4196>166n/a表8烟草特有亚硝胺的标准曲线和检测限注：检出限以3倍信噪比(s/n＝3)计算。向上述步骤2样品的提取中所得的提取液中加入5μl浓度为1mg/ml的内标储备液，得待测液；采用高效液相色谱-串联质谱对上述所得待测液进行测定，测定条件与系列标准工作溶液的测定条件相同，所得色谱图如图5所示，其中(a)、(b)、(c)、(d)分别为nnn、nnk、nat、nab的色谱图，将测得的目标分析物峰面积和相应同位素峰面积之比代入标准曲线计算得到待测物含量，结果如表9所示。表9主流烟气中烟草特有亚硝胺的检测结果化合物含量(μg/支)nnn0.0035nnk0.0042nat0.0100nab0.0016实施例2按照实施例1的方法对另一样品b进行测定，结果如表10所示。表10样品b主流烟气中羰基化合物和烟草特有亚硝胺的检测结果化合物含量(μg/支)nnn0.0278nnk0.0107nat0.0480nab0.0062甲醛73.1乙醛590.7丙酮249.0丙烯醛61.9丙醛55.2巴豆醛20.22-丁酮61.5丁醛33.8实施例3按照实施例1的方法对另一样品c进行测定，结果如表11所示。表11样品c主流烟气中羰基化合物和特有亚硝胺的检测结果化合物含量(μg/支)nnn0.0060nnk0.0055nat0.0153nab0.0022甲醛80.6乙醛584.6丙酮239.2丙烯醛68.0丙醛58.1巴豆醛16.82-丁酮54.3丁醛31.3实施例4按照实施例1的方法对另一样品d进行测定，结果如表12所示。表12样品d主流烟气中羰基化合物和特有亚硝胺的检测结果实验例对实施例1中的样品进行低、中、高不同浓度水平的标准溶液加标回收率试验，每个样品分别测定3次，计算本方法中甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛、nnn、nnk、nat、nab的回收率及加标后测定值的相对标准偏差，结果见表13。可以看出，在3个加标水平上，利用此方法检测主流烟气中甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛、nnn、nnk、nat、nab的平均回收率在90.8％～101.2％之间。样品测试结果的平均相对偏差小于6.8％；说明本法的回收率较高，重复性较好。表13方法的回收率与重复性(n＝3)化合物低浓度/％中浓度/％高浓度/％平均回收率％rsd/％nnn102.8107.193.6101.26.8nnk89.795.696.694.04.0nat97.896.194.196.02.0nab94.193.497.995.12.5甲醛97.391.992.293.83.2乙醛92.997.897.896.22.9丙酮96.295.095.895.60.7丙烯醛90.790.291.790.80.8丙醛97.797.596.797.30.5巴豆醛97.694.394.395.42.02－丁酮97.294.694.895.51.5丁醛93.191.592.692.40.9当前第1页12