本发明涉及药物化合物制备领域，具体地说，涉及一种新型β-羰基丙烯酰胺类化合物、其制备方法及应用。
背景技术：
结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一种传染性疾病，从20世纪80年代开始，耐药结核病，尤其是耐多药结核的发病率不断上升，以及HIV/AIDS并发结核导致结核病疫情再度上升，全世界每年大约有140万人死于结核病，结核病成为全球关注的重大公共卫生问题和社会问题[Organization W H.[M].World Health Organization，2013]。目前临床上使用的一线和二线抗结核药物已经使用了半个世纪之久，治疗周期长，对耐药结核无效，同时对休眠结核作用不强，并且在过去的四十年中抗结核病药物研究进展缓慢[许寅等[J].上海医药.2013(13):3-7]。因此，加强抗结核病药物研究，积极研究开发抗结核病新药，防止耐药结核杆菌蔓延成为当今中国药学家的当务之急。
近五年抗结核新药研发工作取得了一定的进展，有一批处于临床前研究的先导物和进入临床研究的候选化合物，进入临床研究的化合物主要有氟喹诺酮、硝基咪唑、二芳基喹啉、乙二胺、恶唑烷酮等五大类化合物；其中，贝达喹啉于2012年12月被美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市用于治疗耐药结核病，Delamanid于2013年12月被欧洲药品管理局批准治疗耐药结核病。尽管贝达喹啉组治疗耐药结核病比安慰剂组的治愈率高，但是贝达喹啉组出现高死亡率[Diacon AH等[J].N Engl J Med.2014,371(8):723-732]，这可能与它引起QT间期延长，肝相关的不良反应有关[Kakkar AK等[J].Tuberculosis. 2014,94(4):357-362]。Delamanid也与QT间期延长有关，和其他抗结核药物联合应用的临床副作用也未明确[Szumowski JD等[J].Drug Des Devel Ther.2015,9:677-682]。因此，基于目前结核病发病情况，急需研发高效低毒的新型抗结核药物以满足临床需求。
技术实现要素：
(一)要解决的技术问题
针对现有的抗结核药物存在对耐药结核无效，对休眠结核作用不强，并且抗结核病药物研究进展缓慢的缺陷，本发明提供一种新的对结核病杆菌有抗性的化合物及其制备方法。
(二)技术方案
本发明的第一个目的是提供一种对结核病杆菌有抗性的β-羰基丙烯酰胺类化合物。
所述化合物的结构如式(I)所示：
式中：
R1可以在2、3、4、5、6位的任一位置上，所述R1独立选自：H、C1-C10烷基、C1-C4卤代烷基、C3-C7环烷基、C3-C9杂环烷基、C1-C4烷氧基、氰基、卤素、N(R4)2、硝基、羧基、芳基、C5-C6芳杂环基、4-12个氨基酸的短肽、Y-D-En+(X-)n；
R2、R3独立选自：H、C1-C14烷基、C3-C7环烷基、R4OH、C1-C4卤代烷基、C3-C18杂环烷基、C5-C6芳杂环基、4-12个氨基酸的短肽、Y-D-En+(X-)n；
其中，所述取代基R4独立选自：H、C1-C4烷基；
所述取代基Y-D-En+(X-)n结构式中，Y独立代表硫原子或氧原子，D独立代表C1-C12烷基或烷氧基，E独立代表C1-C6的二级或三级的环 烷胺基、杂环胺基、直链胺基，X独立代表卤原子，n为1或2。
优选地R1选自H、C1-C10烷基、C3-C7环烷基、C3-C9杂环烷基、C1-C4烷氧基、卤素、硝基、芳基、C5-C6芳杂环基；
R2、R3独立选自H、C1-C14烷基、R4OH和C3-C18杂环烷基。
进一步优选，R1选自甲氧基、溴或苯基；R2选自H或甲基；R3选自H、甲基、乙基、羟乙基、利奈唑胺基、环丝氨酸基或苄基。
更进一步地优选，R1选自甲氧基、溴或苯基；R2选自H或甲基；R3选自H、甲基、利奈唑胺基、环丝氨酸或苄基。
其中，本发明所述所述β-羰基丙烯酰胺类化合物优选：
(E)-4-氧代-4-(1,1'-联苯基)-2-丁烯酰胺；
(E)-4-氧代-4-(1,1'-联苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺；
(E)-4-氧代-4-(1,1'-联苯基)-N,N-N,N-二羟乙基-2-丁烯酰胺；
(R,E)-4-氧代-4-(1,1'-联苯基)-N-甲基-N-利奈唑胺基-2-丁烯酰胺；
(S,E)-4-氧代-4-(1,1'-联苯基)-N-甲基-N-环丝氨酸-2-丁烯酰胺；
(E)-4-氧代-4-(1,1'-联苯基)-N-甲基-N-苄基-2-丁烯酰胺；
(E)-4-氧代-4-(3-溴苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺；
(E)-4-氧代-4-(2,4二氯苯基)-N,N-二羟乙基-2-丁烯酰胺；
(E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺。
本发明所述的化合物还可为：
(E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-N-甲基-N-乙基-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(2-硝基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(3-硝基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(4-硝基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(2,4-二氯苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(3,4-二氯苯基)-N-甲基-N-苄基-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(3-氯苯基)-N-甲基-N-苄基-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(4-氯苯基)-N-甲基-N-苄基-2-丁烯酰胺
(R,E)-4-氧代-4-(4-乙氧基苯基)-N-甲基-N-利奈唑胺基-2-丁烯酰胺
(S,E)-4-氧代-4-(4-乙氧基苯基)-N-甲基-N-环丝氨酸-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(3,5-二(三氟甲基)苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(4-N,N-二甲胺甲酰基苯基)-N-甲基-N-苄基-2-丁烯酰胺
本发明的第二个目的是提供β-羰基丙烯酰胺类化合物的合成方法，其具体合成路线如下：
其中，R1、R2、R3定义如上所述。
具体地，所述合成方法包括如下步骤：
(1)式(II)化合物与乙醛酸生成式(III)化合物；
(2)式(III)化合物与胺类化合物进行缩合反应得到式(I)类化合物；
其中，步骤(1)中，反应条件是以冰醋酸为反应溶剂，在催化量的浓硫酸作用下回流反应制备化合物(III)。
其中，步骤(2)中，反应条件是，化合物(III)以无水二氯甲烷为溶剂，首先与氯甲酸异丁酯反应生成混合酸酐，然后与胺类化合物进行缩合得到化合物(I)；或者化合物(III)以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，经碳二亚胺类缩合剂1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺活化，然后与胺类化合物进行缩合得到化合物(I)。
本发明还提供所述β-羰基丙烯酰胺类化合物在制备抗结核药物中的应用。
本发明进一步提供由所述β-羰基丙烯酰胺类化合物制备的抗结 核药物或组合物，任选所述药物中还含有药学上可接受的载体。
本发明提供的新型β-羰基丙烯酰胺类化合物具有抗结核分枝杆菌(包括多重耐药结核分枝杆菌)活性，因而该类化合物或其组合物，有望开发成为一类具有潜力的新型抗结核药物。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 β-联苯甲酰基丙烯酸(III-1)的合成
向500mL反应瓶中加入联苯乙酮(II-1)(62.48g，0.318mol)，一水合乙醛酸(28.85g，0.313mol)，浓度98％的乙酸(250mL)和浓度98％的浓硫酸(1mL)，搅拌，物料不能全溶，搅拌加热至115℃，回流约0.5h，反应体系呈黄色清液，同温继续反应至原料基本反应完全(TLC检测)，反应结束后减压蒸除乙酸，析出大量白色固体，加入石油醚：乙酸乙酯(体积比2：1，50mL)，室温搅拌0.5h后抽滤，40℃真空干燥，得49g类白色固体产物β-联苯甲酰基丙烯酸(III-1)，熔点：226.3-227.4℃，收率：62％。
产物分析结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.15(s,1H),8.14-8.12(m,2H),7.93(d,J＝15.6Hz,1H),7.90-7.88(m,2H),7.79-7.77(m,2H),7.54-7.50(m,2H),7.46-7.43(m,1H),6.76(d,J＝15.6Hz,1H)；HRMS-ESI(m/z):251.0714(M-H)-。
实施例2 (E)-4-氧代-4-(1,1’-联苯基)-2-丁烯酰胺(I-1)的合成(R1为苯基，R2为H，R3为H)
向100mL三口瓶中依次加入实施例1中制备的化合物(III-1)(2.52g，10mmol)，50mL无水二氯甲烷，电磁搅拌得白色悬浊液。滴加1.4mL无水TEA(10.0mmol)后溶清，得无色溶液。在内温-15℃及氮气保护下，恒压滴加2当量的氯甲酸异丁酯(IBCF)，控制反应温度不超过-10 ℃。滴加完毕后，TLC跟踪，5min反应完全。控制反应温度0℃以下，通入氨气，TLC跟踪，15min反应完全。饱和食盐水洗涤反应液3次，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩，经硅胶柱层析(PE:EA＝3:1)分离，真空干燥得黄色固体(E)-4-氧代-4-(4-联苯基)-2-丁烯酰胺(I-1)，(1.90g，收率76％)，mp:225.3-227.8℃。
产物分析结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.12(d,J＝8.4Hz,2H),7.99(s,1H),7.89(d,J＝8.4Hz,2H),7.85-7.74(m,3H),7.58-7.49(m,3H),7.49-7.42(m,1H),6.98(d,J＝15.6Hz,1H)；MS-ESI(m/z):274.16(M+Na)+。
实施例3 (E)-4-氧代-4-(1,1'--联苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-2)的合成(R1为苯基，R2为甲基，R3为甲基)
向200mL圆底烧瓶中依次加入实施例1中制备的化合物(III-1)(6.68g，26.48mmol)，无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF，30mL)，HOBt(6.06g，44.84mmol)，EDCI(11.8g，61.55mmol)，室温电磁搅拌得棕色悬浊液A。另取一个25mL圆底烧瓶，依次加入二甲胺盐酸盐(3.0g，36.79mmol)，5mL无水DMF，DBU(6.0g，10mmol)，室温电磁搅拌得无色溶液B。2h后将无色溶液B加入棕色悬浊液A中，TLC跟踪，24h后基本反应完全。加入100mL水淬灭，250mL二氯甲烷萃取3次，饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥。过滤，常温减压浓缩，用乙酸乙酯与石油醚重结晶后真空干燥得黄色固体(E)-4-氧代-4-(1,1'-联苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-2)(3.90g，收率53.2％)。
产物分析结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.13-8.12(m,2H),7.95(d,J＝15.0Hz,1H),7.72-7.74(m,2H),7.64-7.65(m,2H),7.54(d,J＝15.0Hz,1H),7.46-7.50(m,2H),7.40-7.43(m,1H),3.20(s，3H),3.10(s，3H)；MS-ESI(m/z):280.1。
实施例4 (R,E)-4-氧代-4-(1,1'-联苯基)-N-甲基-N-利奈唑胺基-2-丁烯酰胺(I-3)的合成(R1为苯基，R2为甲基，R3利奈唑胺基)
同实施例3化合物的制备方法，以(III-1)与N-甲基利奈唑胺碱盐酸盐反应制得(R,E)-4-氧代-4-(1,1'-联苯基)-N-甲基-N-利奈唑胺基-2-丁烯酰胺(I-3)。
产物分析结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.09-8.13(m,2H),7.79-7.90(m,2H),7.46-7.53(m,3H),7.18-7.23(m,5H),7.06-7.10(m,1H),7.01-7.05(m,1H),4.92-4.96(m,1H),4.11-4.17(m,2H),4.01-4.05(m,2H),3.72-3.74(m,5H),3.24(s，1H),3.05(s，1H),2.92-2.96(m,4H)；MS-ESI(m/z):544.22(M+H)+。
实施例5 (S,E)-4-氧代-4-(1,1'-联苯基)-N-甲基-N-环丝氨酸-2-丁烯酰胺(I-4)的合成(R1为苯基，R2为甲基，R3为环丝氨酸)
同实施例3化合物的制备方法，以(III-1)与N-甲基环丝氨酸盐酸盐反应制得(S,E)-4-氧代-4-(1,1'-联苯基)-N-甲基-N-环丝氨酸-2-丁烯酰胺(I-4)。
产物分析结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.09-8.11(m,2H),8.01(d,J＝15.0Hz,1H),7.72-7.73(m,2H),7.63-7.65(m,2H),7.48-7.49(m,2H),7.42-7.46(m,1H),7.10(d,J＝15.0Hz,1H),4.86-4.94(m,2H),4.04-4.08(m,1H),3.26(s，3H)；MS-ESI(m/z):351.12(M+H)+。
实施例6 (E)-4-氧代-4-(1,1'-联苯基)-N-甲基-N-苄基-2-丁烯酰胺(I-5)的合成(R1为苯基，R2为甲基，R3为苄基)
同实施例3化合物的制备方法，以(III-1)和N-甲基苄胺盐酸盐反应制得(E)-4-氧代-4-(1,1'-联苯基)-N-甲基-N-苄基-2-丁烯酰胺(I-5)。
产物分析结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.10-8.09(m,2H),7.94(d,J＝15.0Hz,1H),7.73-7.75(m,2H),7.60-7.62(m,2H),7.50(d,J＝15.0Hz,1H),7.42-7.50(m,4H),7.33-7.38(m,4H),3.16(s，3H),2.78(m，2H)；MS-ESI(m/z):355.10。
实施例7 (E)-4-氧代-4-(3-溴苯基)-2-丁烯酸(III-2)的合成
同实施例1化合物的制备方法，以3-溴苯乙酮(II-2)和一水合乙醛酸为原料，反应制得黄色固体(E)-4-氧代-4-(3-溴苯基)-2-丁烯酸(III-2)(14.40g，收率64％)，mp:161.1-163.4℃。
产物分析结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):13.18(s,1H),6.97(d,J＝15.6Hz,1H),7.84(d,J＝15.6Hz,1H),7.97-7.95(m,2H),7.79-7.77(m,2H)。
HRMS-ESI(m/z):252.9489(M-H)-。
实施例8 (E)-4-氧代-4-(3-溴苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-6)的合成(R1为溴，R2为甲基，R3为甲基)
同实施例3化合物的制备方法，以实施例7中制备的化合物(III-2)和二甲胺盐酸盐为原料制得目标化合物(E)-4-氧代-4-(3-溴苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-6)。
产物分析结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04-8.12(m,2H),7.90(d,J＝15.6Hz,1H),7.36-7.40(m,2H),7.06(d,J＝15.6Hz,1H),3.20(s，3H),3.15(s，3H)；MS-ESI(m/z):281.07,283.09。
实施例9 (R,E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-N-甲基-N-利奈唑胺基-2-丁烯酰胺(I-7)的合成(R1为甲氧基，R2为甲基，R3为利奈唑胺基)
同实施例3化合物的制备方法，以化合物(E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-2-丁烯酸(III-3)和N-甲基利奈唑胺碱盐酸盐为原料制得目标化合物(R,E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-N-甲基-N-利奈唑胺基-2-丁烯酰胺(I-7)。
产物分析结果如下：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.01-8.05(m,2H),7.74-7.80(m,1H),7.39-7.47(m,2H),7.16-7.22(m,1H),7.03-7.10(m,3H),4.90-4.93(m,1H),4.11-4.14(m,1H),3.85-3.87(m,3H),3.78-3.79(m,2H),3.72-3.74(m,5H),3.22(s，1H),3.03(s,1H),2.94-2.95(m,4H)；MS-ESI(m/z):497.11。
实施例10 (S,E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-N-甲基-N-环丝氨酸-2-丁烯 酰胺(I-8)的合成(R1为甲氧基，R2为甲基，R3为环丝氨酸)
同实施例3化合物的制备方法，以化合物(E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-2-丁烯酸(III-3)和N-甲基环丝氨酸盐酸盐为原料制得目标化合物(S,E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-N-甲基-N-环丝氨酸-2-丁烯酰胺(I-8)。
产物分析结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.01-8.03(m,2H),7.96(d,J＝15.0Hz,1H),7.10(d,J＝15.0Hz,1H),6.95-6.97(m,2H),4.87-4.92(m,2H),4.02-4.08(m,1H),3.89(s，3H),3.26(s，3H)；MS-ESI(m/z):305.08(M+H)+。
实施例11 (E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-9)的合成(R1为甲氧基，R2为甲基，R3为甲基)
同实施例3化合物的制备方法，以化合物(E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-2-丁烯酸(III-3)和二甲胺盐酸盐为原料制得目标化合物(E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-9)。
产物分析结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.02-8.03(m,2H),7.95(d,J＝15.0Hz,1H),7.11(d,J＝15.0Hz,1H),6.93-6.97(m,2H),4.82-4.90(m,2H),4.01-4.05(m,1H),3.89(s，3H),3.25(s，3H),3.12(s，3H)；MS-ESI(m/z):233.07。
实施例12 (E)-4-氧代-4-(4-N,N-二甲胺基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-10)的合成(R1为二甲胺基，R2为甲基，R3为甲基)
同实施例3化合物的制备方法，以化合物(E)-4-氧代-4-(4-N,N-二甲基苯基)-2-丁烯酸(III-4)和二甲胺盐酸盐为原料制得目标化合物(E)-4-氧代-4-(4-N,N-二甲基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-10)。
产物分析结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.99-8.01(m,2H),7.99(d,J＝15.0Hz,1H),7.46(d,J＝15.0Hz,1H),6.69-6.71(m,2H),3.18(s，3H),3.09(s，6H),3.08(s，3H)；MS-ESI(m/z):246.12。
实施例13 (E)-4-氧代-4-(4-氧化吡啶基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺 (I-11)的合成(R1为氧化吡啶基，R2为甲基，R3为甲基)
同实施例3化合物的制备方法，以化合物(E)-4-氧代-4-(4-氧化吡啶基苯基)-2-丁烯酸(III-5)和二甲胺盐酸盐为原料制得目标化合物(E)-4-氧代-4-(4-氧化吡啶基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-11)。
产物分析结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.29-8.30(m,3H),8.15-8.17(m,2H),7.96-7.99(m,1H),7.72-7.74(m,2H),7.57-7.58(m,2H),3.20(s，3H),3.10(s，3H)；MS-ESI(m/z):296.06。
实施例14 (E)-4-氧代-4-(4’-N-甲基哌嗪基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-12)的合成(R1为N-甲基哌嗪基，R2为甲基，R3为甲基)
同实施例3化合物的制备方法，以化合物(E)-4-氧代-4-(4’-N-甲基哌嗪基苯基)-2-丁烯酸(III-6)和二甲胺盐酸盐为原料制得目标化合物(E)-4-氧代-4-(4’-N-甲基哌嗪基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-12)。
产物分析结果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.95-8.00(m,3H),7.47(d,J＝15.0Hz,1H),6.88-6.90(m,2H),3.46-3.48(m,4H),3.17(s，3H),3.07(s，3H),3.08(s，3H),2.64(br.4H),2.41(br.3H)；MS-ESI(m/z):302.30(M+H)+。
实施例15 β-羰基丙烯酰胺类化合物的活性测试
化合物抗结核分枝杆菌活性的测定采用MABA法。
菌株:结核分枝杆菌标准株H37Rv(ATCC27294)、结核分枝杆菌临床耐药株5112、5120。5112对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇耐药。5120对异烟肼、链霉素、乙胺丁醇耐药。
将结核分枝杆菌H37Rv和临床耐药株5112、5120接种于含0.2％(v/v)甘油、0.05％吐温-80和10％OADC的7H9液体培养基中。待培养至对数生长期，经8μm孔径的滤膜过滤后，3000r/min离心10min收集菌体并用新鲜的7H9培养基重悬。酶标仪测定菌在OD570nm的吸收值，并计算其菌浓度。在96孔黑壁透明底板中，化合物用7H9培养基(含10％ADC)二倍稀释成各种所需浓度(100μl)。每孔加入结核 分枝杆菌100μl，使其终浓度为5×105cfu/ml。37℃孵育7天，第7天每孔加入12.5μl的20％吐温-80和20μl阿尔玛蓝(Alamar blue)。孵育24h后，测定其在530nm激发光和590nm发射光下的荧光值。最低抑菌浓度(MIC)定义为降低测定菌阳性对照孔荧光值至少90％的最低浓度。
部分实施例中制备的化合物抗结核分枝杆菌活性测定结果如表1所示。
表1 所制备化合物的抗结核分枝杆菌活性
*：高活性的抗结核化合物(对照)
由上表可知，化合物I-1至I-12均具有较好的抗结核分枝杆菌活性，特别是化合物I-2、I-6，抗菌活性显著，由此可见，本专利所述的化合物或其组合物可用于制备新型抗结核药物。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。