一种红曲米中桔霉素毒素的检测方法与流程

本发明属于检测领域，具体涉及一种红曲米中桔霉素毒素的检测方法。

背景技术：

桔霉素主要是由青霉属、曲霉属、红曲霉属所产生的一种次级代谢产物。桔霉素分布广泛，主要存在于小麦、玉米、燕麦等谷物产品，以及苹果、梨等水果的加工制品中。桔霉素具有良好的抑菌性，能抑制枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、灰色链霉菌等，在我国古代就被作为一种食品保藏剂涂抹在易腐烂的肉上。但由于桔霉素有很强的肾毒性而没有受到广泛应用，而且其污染问题越来越受到人们的关注，并被国际生命科学院自然毒素检测委员会欧洲分会列为必须检测的毒素之一。

中国是世界上红曲生产与应用最早、最广的国家，早在明朝就利用红曲霉制作红曲。而红曲米主要以大米为原料，由红曲霉发酵而来。由于红曲米不但可以活血化瘀，健脾消食，更可以降低血糖胆固醇，早在《本草纲目》中就有大量记载，并始终受到国内外的广泛关注。红曲米中桔霉素毒素含量也成为我国红曲产品出口检验检疫的主要内容。国内外基于不同的检测方法对农产品、食品、饲料中所含的桔霉素毒素含量设立了不同的限制标准，随着hplc技术的不断完善，检测工作日趋简单，而样品的前处理成了技术关键和难点。目前对于桔霉素毒素分离纯化方法较为复杂，普遍都是通过浓缩、过柱、萃取实现桔霉素毒素分离，最后通过tlc或者hplc进行定性定量检测。

技术实现要素：

针对本领域存在的问题，本发明的目的是提出一种检测红曲米中桔霉素毒素的方法。

实现本发明目的的技术方案为：

一种红曲米中桔霉素毒素的检测方法，包括步骤：

1)准确称取红曲米样品，磨碎后过20目筛；

2)将红曲米样品与甲醇混匀，反应，提取出桔霉素毒素溶液；其中红曲米样品和甲醇的质量体积比为1g：(2-10ml)；

3)步骤1)提取得到的桔霉素毒素溶液用高效液相色谱检测。

其中，所述甲醇为色谱级甲醇、或是用色谱级甲醇配置的质量浓度为70～90％的溶液。

优选地，所述甲醇为色谱级甲醇,红曲米样品和甲醇的质量体积比为1g：5ml。

其中，步骤2)中，红曲米样品与甲醇混匀后，60～70℃下保温0.5～2小时，保温期间间歇晃动或颠倒放置样品的容器。

进一步地，步骤2)中，红曲米样品与甲醇混匀后保温，再离心分离，离心的速度为5000～10000rpm，离心时间为5-15min；取上清液即为桔霉素毒素溶液。

其中，步骤3)中，高效液相色谱的条件为：色谱柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流动相为乙腈/异丙醇/0.08mol/l的磷酸溶液，乙腈/异丙醇/磷酸的体积比为35：10：55。

其中，用荧光检测器进行检测，检测波长为331nm激发波长和500nm发射波长；流速为1.0ml/min；柱温40℃；进样量50μl。

其中，步骤3)收集与桔霉素毒素标准品保留时间一致的峰的洗脱液，采用外标法进行定量测定，得到红腐乳样品中的桔霉素毒素含量，所述保留时间为前后0.05min。

所述外标法具体包括，用桔霉素标准品溶于色谱级甲醇，配制成0.01～10μg/g系列浓度的标准曲线工作液。采用高效液相色谱法对不同浓度的标准曲线工作液进行高效液相色谱(hplc)定量检测，并以桔霉素浓度作横坐标，以保留时间前后0.05min处的峰面积作纵坐标，根据浓度与峰面积的关系进行线性回归，绘制标准曲线，用于外标法测定。

本发明的有益效果在于：

本发明提出的方法，利用桔霉素易溶于乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂的理化性质，提出了一种更为简便的提取红曲米中桔霉素毒素的方法，有利于推动红曲以及红曲产业的发展。经试验证明，本发明的方法能够快速提取红曲米中桔霉素毒素，且效率高、耗时少、成本低、回收率高(0.1-1μg/g，回收率范围在80-110％；1-100μg/g，回收率范围在90-110％)，符合实验室质量控制规范-食品理化检测标准(gb/t27404)，另外，此方法也极大简便了红曲及其相关产品中桔霉素毒素的提取，具有极高的推广和应用价值。

附图说明

图1为桔霉素毒素含量检测标准曲线图谱。

图2为2μg/g桔霉素毒素标准品的hplc图谱。

图3为提取红曲米样品a中桔霉素毒素含量为21.34μg/g的hplc图谱；

图4为利用免疫亲和柱提取红曲米样品a中桔霉素毒素含量为24.31μg/g的hplc图谱。

具体实施方式

现以以下实施例来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中使用的手段，如无特别说明，均使用本领域常规的手段。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的桔霉素标准品是sigma公司(美国)的产品。色谱级的甲醇、乙腈、异丙醇和磷酸是fisher公司(美国)的产品。

桔霉素标准曲线的制作方法如下：

用1ml色谱级甲醇溶1mg固体桔霉素标准品，配制成1mg/g桔霉素标准溶液，再用色谱级甲醇分别配制成2μg/g，1μg/g，0.5μg/g，0.1μg/g，0.05μg/g，0.01μg/g标准曲线工作液。采用高效液相色谱法对不同浓度的标准曲线工作液进行hplc定量检测，并以桔霉素浓度作横坐标，以保留时间前后0.05min处的峰面积作纵坐标，根据浓度与峰面积的关系进行线性回归，并绘制标准曲线。

高效液相色谱法条件：色谱柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流动相：乙腈/异丙醇/磷酸(磷酸浓度0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；荧光检测器：安捷伦g1321；检测波长：331nm和500nm；流速：1.0ml/min；柱温40℃；进样量：50μl。

绘制的标准曲线如图1所示。根据标准曲线得到的标准曲线方程为：y＝206.631416x+0.6943595(y为峰面积，x为桔霉素毒素含量)，r2＝0.99924。图2为2μg/g桔霉素毒素标准品的hplc图谱。

利用免疫亲和柱提取红曲米样品中桔霉素毒素含量步骤如下：

取1g粉碎后的样品，加入20ml70％甲醇，65℃水浴30min(每10min上下颠倒30s)，用定性滤纸过滤；取1ml滤液至50ml离心管，加入39mlpbs缓冲液，用微纤维滤纸过滤；取10ml上述滤液过柱，并用10ml0.1％吐温-20-pbs洗柱，最后用1ml洗脱液(甲醇：0.1％磷酸＝7：3)过柱将桔霉素洗脱至剂量瓶中；进行hplc定量检测，以外标法定量进行数据处理。红曲米样品重复3次，取平均值。

实施例1：

分别利用2种方法对红曲米样品a进行桔霉素毒素提取，然后进行hplc定量检测。具体步骤如下：

1、利用本方法提取红曲米中桔霉素毒素含量

准确称取1g已磨碎筛分(过20目筛)的红曲米样品a，置于50ml离心管内，加入5ml色谱级甲醇，65℃水浴60min，期间每10min上下颠倒30s，8000rpm离心10min之后，静置取上清至2ml微量进样瓶中，采用高效液相色谱法(hplc)对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理。红曲米样品a重复3次，取平均值。

2、利用免疫亲和柱作为对照提取红曲米中桔霉素毒素含量

准确称取1g已充分混匀的红曲米样品a，置于50ml离心管内，加入20ml70％甲醇，65℃水浴30min(每10min上下颠倒30s)，用定性滤纸过滤。取1ml滤液至50ml离心管，加入39mlpbs缓冲液，用微纤维滤纸过滤。取10ml上述滤液过柱，并用10ml0.1％吐温-20-pbs洗柱，最后用1ml洗脱液(甲醇：0.1％磷酸＝7：3)过柱将桔霉素洗脱至剂量瓶中。采用高效液相色谱法(hplc)对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理。红曲米样品a重复3次，取平均值。

高效液相色谱法条件：色谱柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流动相：乙腈/异丙醇/磷酸(0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；荧光检测器：安捷伦g1321；检测波长：331nm和500nm；流速：1.0g/min；柱温40℃；进样量：50μl。

收集与桔霉素毒素标准品保留时间(保留时间约0.05min)一致的峰的洗脱液，得到红曲米样品a中的桔霉素毒素含量。参见图3和图4。

检测结果如表1所示。其中，处理样品1-3为利用本方法提取1g红曲米样品中桔霉素毒素含量；处理对照1-3为利用免疫亲和柱提取1g红曲米样品中桔霉素毒素含量；桔霉素毒素含量(μg/g)为1g红曲米样品中桔霉素毒素含量的实际检测值；平均值(μg/g)为1g红曲米样品中3次重复检测桔霉素毒素含量的平均值；回收率(％)为样品检测平均值(μg/g)/对照检测平均值(μg/g)*100％。

利用本方法提取1g红曲米样品中桔霉素毒素含量平均值为22.04μg/g；利用免疫亲和柱提取1g红曲米样品中桔霉素毒素含量平均值为24.12μg/g，回收率为91.40％(22.04μg/g/24.12μg/g)。以上回收率均符合实验室质量控制规范-食品理化检测标准(gb/t27404)(0.1-1μg/g，回收率范围在80-110％；1-100μg/g，回收率范围在90-110％)，说明本发明提取的桔霉素毒素的方法是可行的，且该方法更加简便。

表1红曲米样品a中桔霉素毒素含量检测

实施例2、红曲米中桔霉素毒素的检测

分别利用2种方法对红曲米样品b进行桔霉素毒素提取，然后进行hplc定量检测。具体步骤如下：

1、利用本方法提取红曲米中桔霉素毒素含量

准确称取1g已充分混匀的红曲米样品b，置于50ml离心管内，加入5ml色谱级甲醇，65℃水浴60min，期间每10min上下颠倒30s，8000rpm离心10min之后，静置取上清至2ml微量进样瓶中，采用高效液相色谱法(hplc)对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理。红曲米样品b重复3次，取平均值。

2、利用免疫亲和柱作为对照提取红曲米中桔霉素毒素含量

准确称取1g已充分混匀的红曲米样品b，置于50ml离心管内，加入20ml70％甲醇，65℃水浴30min(每10min上下颠倒30s)，用定性滤纸过滤。取1ml滤液至50ml离心管，加入39mlpbs缓冲液，用微纤维滤纸过滤。取10ml上述滤液过柱，并用10ml0.1％吐温-20-pbs洗柱，最后用1ml洗脱液(甲醇：0.1％磷酸＝7：3)过柱将桔霉素洗脱至剂量瓶中。采用高效液相色谱法(hplc)对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理。红曲米样品b重复3次，取平均值。

高效液相色谱法条件：色谱柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流动相：乙腈/异丙醇/磷酸(0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；荧光检测器：安捷伦g1321；检测波长：331nm和500nm；流速：1.0g/min；柱温40℃；进样量：50μl。

收集与桔霉素毒素标准品保留时间(保留时间约0.05min)一致的峰的洗脱液，得到红曲米样品b中的桔霉素毒素含量。

检测结果如表2所示。其中，处理样品1-3为利用本方法提取1g红曲米样品中桔霉素毒素含量；处理对照1-3为利用免疫亲和柱提取1g红曲米样品中桔霉素毒素含量；桔霉素毒素含量(μg/g)为1g红曲米样品中桔霉素毒素含量的实际检测值；平均值(μg/g)为1g红曲米样品中3次重复检测桔霉素毒素含量的平均值；回收率(％)为样品检测平均值(μg/g)/对照检测平均值(μg/g)*100％。

利用本方法提取1g红曲米样品中桔霉素毒素含量平均值为0.40μg/g；利用免疫亲和柱提取1g红曲米样品中桔霉素毒素含量平均值为0.41μg/g，回收率为98.46％(0.40μg/g/0.41μg/g)。以上回收率均符合实验室质量控制规范-食品理化检测标准(gb/t27404)(0.1-1μg/g，回收率范围在80-110％；1-100μg/g，回收率范围在90-110％)，说明本发明提取的桔霉素毒素的方法是可行的，且该方法更加简便。

表2红曲米样品b中桔霉素毒素含量检测

实施例3、红曲米中桔霉素毒素的检测

分别利用2种方法对红曲米样品c进行桔霉素毒素提取，然后进行hplc定量检测。具体步骤如下：

1、利用本方法提取红曲米中桔霉素毒素含量

准确称取1g已充分混匀的红曲米样品c，置于50ml离心管内，加入5ml色谱级甲醇，65℃水浴60min，期间每10min上下颠倒30s，8000rpm离心10min之后，静置取上清至2ml微量进样瓶中，采用高效液相色谱法(hplc)对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理。红曲米样品c重复3次，取平均值。

2、利用免疫亲和柱作为对照提取红曲米中桔霉素毒素含量

准确称取1g已充分混匀的红曲米样品c，置于50ml离心管内，加入20ml70％甲醇，65℃水浴30min(每10min上下颠倒30s)，用定性滤纸过滤。取1ml滤液至50ml离心管，加入39mlpbs缓冲液，用微纤维滤纸过滤。取10ml上述滤液过柱，并用10ml0.1％吐温-20-pbs洗柱，最后用1ml洗脱液(甲醇：0.1％磷酸＝7：3)过柱将桔霉素洗脱至剂量瓶中。采用高效液相色谱法(hplc)对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理。红曲米样品c重复3次，取平均值。

高效液相色谱法条件：色谱柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流动相：乙腈/异丙醇/磷酸(0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；荧光检测器：安捷伦g1321；检测波长：331nm和500nm；流速：1.0g/min；柱温40℃；进样量：50μl。

收集与桔霉素毒素标准品保留时间(保留时间约0.05min)一致的峰的洗脱液，得到红曲米样品c中的桔霉素毒素含量。

检测结果如表3所示。其中，处理样品1-3为利用本方法提取1g红曲米样品中桔霉素毒素含量；处理对照1-3为利用免疫亲和柱提取1g红曲米样品中桔霉素毒素含量；桔霉素毒素含量(μg/g)为1g红曲米样品中桔霉素毒素含量的实际检测值；平均值(μg/g)为1g红曲米样品中3次重复检测桔霉素毒素含量的平均值；回收率(％)为样品检测平均值(μg/g)/对照检测平均值(μg/g)*100％。

利用本方法提取1g红曲米样品中桔霉素毒素含量平均值为5.53μg/g；利用免疫亲和柱提取1g红曲米样品中桔霉素毒素含量平均值为5.35μg/g，回收率为103.35％(5.53μg/g/5.35μg/g)。以上回收率均符合实验室质量控制规范-食品理化检测标准(gb/t27404)(0.1-1μg/g，回收率范围在80-110％；1-100μg/g，回收率范围在90-110％)，说明本发明提取的桔霉素毒素的方法是可行的，且该方法更加简便。

表3红曲米样品c中桔霉素毒素含量检测

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。