本发明属于化学分析领域，具体涉及一种利用hplc高效测定柑橘果实中酚类化合物的方法。
背景技术：
：：酚类物质具有抗炎抗氧化、抗过敏、抗癌、抗突变、抑菌等多种作用，目前对果实中酚类物质测定的研究报道较多。在众多检测方法中，高效液相色谱法较为常用，其具有以下优点：分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广等。目前，用hplc法测定柑橘果实中酚类物质含量的相关研究较多，但现有研究在测定柑橘中酚类物质还存在样品提取步骤繁琐、溶剂耗费量大、分离时间长、分离物质种类少等不足。如《高效液相色谱法同时测定柑橘果实中18种类黄酮的含量》中记载的方法需耗时60分钟，且在提取时需耗费大量的试剂且提取步骤繁琐；再如《phenoliccompoundscharacterizationandbiologicalactivitiesofcitrusaurantiumbloom》中的方法虽可检测6种酚酸和6种类黄酮物质，但各需耗费60分钟的检测时间；又如中国专利《利用hplc测定葡萄和柑橘果实中17种酚类物质的方法》也存在着在提取时需进行繁琐萃取、浓缩和再溶解步骤，以及检测时间长的缺点。重要的是，现有技术在单独测柑橘类黄酮或酚酸方面已比较成熟，但对类黄酮和酚酸物质同时测定方面还存在以下问题：检测物质少、样品处理繁琐、检测时间较长等。如已有研究报道，在用超高效液相检测脐橙果实种类黄酮时均未检测到柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素三种黄烷酮类酚类物质。再如，在进行样品处理时，现有技术常需要进行冷冻干燥或者长时间的震荡提取。综上所述，本领域亟需一种简单高效的hplc检测柑橘中酚类化合物的方法。技术实现要素：针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种利用hplc高效测定柑橘果实中酚类化合物的方法，该方法包括如下步骤：(1)将柑橘果实研磨后，置于提取液中进行超声辅助提取，离心后进行膜过滤，取上清液作为样品；所述提取液由甲醇、水和甲酸按体积比70∶28∶2的比例组成；(2)利用高效液相色谱仪对步骤(1)所得样品进行检测，色谱条件为：色谱柱c18：5um,4.6mm×150mm；流动相a为10％甲酸，流动相b为乙腈；流速：0.8ml/min；柱温30℃；梯度洗脱：0～25min，95％流动相a，5％流动相b—85％流动相a，15％流动相b；25～42min，85％流动相a，15％流动相b—78％流动相a，22％流动相b；42～50min，78％流动相a，22％流动相b—64％流动相a，36％流动相b；50～55min，64％流动相a，36％流动相b—95％流动相a，5％流动相b。所述酚类化合物为没食子酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、芥子酸、绿原酸、阿魏酸、芦丁、柚皮苷、柚皮素和新橙皮苷。优选的，步骤(1)中，研磨前，将柑橘置于超低温冰箱中保存，保存温度为-80℃。优选的，步骤(1)中，柑橘果实与提取液的重量体积比(g/ml)为1:3。优选的，步骤(1)中，超声功率为(5000r/min)，超声辅助提取时间为30分钟。优选的，步骤(1)中，进行膜过滤时，采用0.45μm微孔有机滤膜。可选的，步骤(2)中，所用高效液相色谱仪为安捷伦1260高效液相色谱系统。结合本发明的实施例的实验数据和现有技术的报道，可以知道本方法最大的优点在于保证检测酚类物质多元化的同时，样品前期处理简单、操作简便，如很多研究报道的样品预处理需要冷冻干燥或者震荡提取12h等。同时本方法重复性好(rsd小于3.52％)，精密度高(0.38％～1.90％)，加样回收率高(90.26％～118.85％)，因此能有效检测柑橘中的酚类物质，如已有研究报道，在用超高效液相检测脐橙果实种类黄酮时均未检测到柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素三种黄烷酮类酚类物质，而本方法检测限低于0.03μg·g-1，能在果肉和果皮中检测到这3种黄烷酮。因此本方法能在更高效利用柑橘中酚类物质方面有一定的参考价值。本发明的有益效果：(1)本发明在对柑橘进行提取时，提取方法简单，无需繁琐的提取步骤；(2)本发明可以精确的同时检测柑橘中10种酚类物质；(3)本发明检测时间短，检测限、精密度和回收率方面的效果优良。附图说明图1为9种酚类化合物混合标准溶液的hplc图；图1为混合标准品50min内分别在280nm，320nm，367nm，283nm波长下的的色谱图，最初的波长为280nm，在4min时切换到320nm，在23min时切换到367nm，在26min时切换到283nm；根据保留时间的不同，峰依次为没食子酸，绿原酸，咖啡酸，阿魏酸，芥子酸，芦丁，柚皮苷，新橙皮苷，柚皮素；图2为对羟基苯甲酸标准溶液的hplc图；图2为对羟基苯甲酸标准品在260nm波长下的色谱图。图3为“塔罗科血橙”品种果肉样品中酚类化合物第一次波长(主要检测咖啡酸、芥子酸、绿原酸、阿魏酸、没食子酸、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素，下同)的hplc图，其中1.没食子酸；2.绿原酸；3.咖啡酸；4.芥子酸；5.柚皮苷；图4为“塔罗科血橙”品种果肉样品中酚类化合物第二次波长(主要检测芦丁、对羟基苯甲酸，下同)的hplc图，其中1.对羟基苯甲酸；2.芦丁；图5为“塔罗科血橙”品种果皮样品中酚类化合物第一次波长的hplc图，其中1.没食子酸；2.绿原酸；3.咖啡酸；4.阿魏酸；5.芥子酸；6.柚皮苷；7.新橙皮苷；8.柚皮素；图6为“塔罗科血橙”品种果皮样品中酚类化合物第二次波长的hplc图，其中1.对羟基苯甲酸；2.芦丁；图7为“沃柑”品种果肉样品中酚类化合物第一次波长的hplc图，其中1.没食子酸；2.绿原酸；3.咖啡酸；4.芥子酸；5.柚皮苷；图8为“沃柑”品种果肉样品中酚类化合物第二次波长的hplc图，其中1.对羟基苯甲酸；2.芦丁；图9为“沃柑”品种果皮样品中酚类化合物第一次波长的hplc图，其中1.没食子酸；2.绿原酸；3.咖啡酸；4.阿魏酸；5.芥子酸；6.柚皮苷；7.新橙皮苷；8.柚皮素；图10为“沃柑”品种果皮样品中酚类化合物第二次波长的hplc图，其中1.对羟基苯甲酸；2.芦丁。具体实施方式下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述
发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。实施例1试剂与仪器：标准品：柚皮素(naringenin)、柚皮苷(naringin)、新橙皮苷(neohesperidin)、咖啡酸(caffeicacid)、芥子酸(sinapicacid)、绿原酸(chlorogenicacid)、阿魏酸(ferulicacid)、没食子酸(gallicacid)、芦丁(rutin)和对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoicacid)，均购自sigma公司，纯度均在98％以上。甲醇、甲酸和乙腈均为色谱纯，购自麦克林公司；水为实验室密理博超纯水。超声波清洗机，离心机，安捷伦1260高效液相色谱系统，c18色谱柱：4.6mm×150mm，5um。1、标准曲线的绘制：用色谱纯甲醇分别将每瓶定量的20mg标准品溶解，定容于10ml棕色容量瓶中，配制成2mg/ml的标准品溶液。全程都进行避光处理，将上述母液用流动相分别配制成0.25、0.5、1、2、5、10、25、50、100mg/l的浓度梯度，再配制成混合标准溶液，避光保存于-20℃以下的环境中。在色谱条件下进行色谱分析，并且计算出各标准品的回归方程和相关系数。2、样品中酚类物质的提取：从-80℃冰箱中取果实至研钵中，准确称取0.5g混合样放入2ml离心管中，避光条件下加入1.5ml提取液(甲醇∶水∶甲酸＝70∶28∶2)，充分混匀。将离心管放入超声装置中辅助提取，超声30min后，在4℃、5000r/min离心条件下离心15min。用0.45μm微孔滤膜过滤上清液，贮存于-20℃用于酚酸及类黄酮的分析。3、对样品进行高效液相色谱分析：色谱条件：使用安捷伦1260液相色谱仪，c18色谱柱：5um,4.6mm×150mm；柱温30℃；进样量20ul；流动相：a为10％甲酸溶液(体积比)，b为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序表1所示；流速为0.8ml/min。表1流动相配比与洗脱时间table3flowmatchingratioandelutiontime柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素用283nm波长检测；咖啡酸、芥子酸、绿原酸、阿魏酸用320nm波长检测；对羟基苯甲酸用260nm波长检测；没食子酸用280nm波长检测；芦丁用367nm波长检测。由于实验所用安捷伦1260仪器的检测器只能在方法中设置波长，而不能自动检测并调整到最适波长进行测定。对于可以自动检测并调整最适波长的仪器，可以不必进行手工设定。芦丁和芥子酸出峰时间相近，对羟基苯甲酸和绿原酸出峰时间相近，在样品中无法准确设置切换波长的时间，即检测时一个样测定两次，第一次检测0min设置波长为280nm，4min转换为320nm，25min转换283nm，在此波长条件下能检测出咖啡酸、芥子酸、绿原酸、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素、没食子酸；第二次检测时0min设置波长为260nm，20min转换为367nm，在此波长条件下能检验出对羟基苯甲酸、芦丁。4、将样品溶液的分析结果与标准曲线比较，计算出样品溶液中的酚类化合物含量。标准曲线线性回归方程、相关系数、最低检测限、相对标准偏差和回收率的结果如表2所示。表2当前第1页12当前第1页12