1.一种定量检测棉花材料群体中MON757转化体含量的方法,包括如下步骤:
(1)获取MON757转化体特异性片段序列的曲线方程,
所述曲线方程是以MON757转化体纯合材料的基因组DNA稀释成梯度浓度后作为模板,以梯度浓度的对数值为横坐标,对所述梯度浓度的模板进行MON757转化体荧光定量PCR反应所得的荧光信号值为纵坐标,拟合出来的方程;
所述MON757转化体荧光定量PCR反应采用的引物和探针如下:
757-3QF:5‘-GGCATGCACATACAAATG-3’,
757-3QR:5‘-CCCATTATTATTCTGTTGTTG-3’,
探针:
757-3QP:5‘-FAM-ACGAACGGATAAACCCTTTCTGGA-BHQ1-3’;
(2)获取棉花内标准基因ACP1基因的标准曲线方程:
所述曲线方程是采用步骤(1)中相同的MON757转化体纯合材料的基因组DNA,稀释成梯度浓度后为模板,以模板的浓度对数值为横坐标,对模板进行ACP1基因荧光定量PCR反应所得的荧光信号值为纵坐标,拟合出来的方程;
其中所述荧光定量PCR反应采用的引物、探针、PCR反应体系和程序采用国家标准《农业部1943号公告-1-2013》中所记载的定量检测ACP1基因的方法;
(3)随机选取待测棉花材料群体中的多个材料,研磨后混合提取待测DNA,
(4)以待测DNA为模板进行MON757转化体荧光定量PCR反应,读取荧光信号值并带入所述MON757转化体特异性片段序列的曲线方程计算得到待测DNA中MON757转化体的拷贝数;
以待测DNA为模板进行所述ACP1基因荧光定量PCR反应,读取荧光信号值并带入棉花内标准基因ACP1基因的标准曲线方程计算得到待测DNA中ACP1基因的拷贝数;
(5)MON757转化体含量=(MON757转化体拷贝数/ACP1基因拷贝数)×2。
2.根据权利要求1所述的方法,所述MON757转化体荧光定量PCR反应的体系为:PremixExTaqTM10μL,10μmol/L上、下游引物各1.5μL,10μmol/L探针0.75μL,50×ROX0.4μL,DNA模板2μL,补超纯水至总体积20μL;
MON757转化体荧光定量PCR反应的程序为:95℃预变性2min,95℃变性5s,60℃退火和延伸34s,扩增反应进行40个循环,在60℃收集PCR扩增荧光信号。
3.根据权利要求2所述的方法,所述MON757转化体特异性片段序列的曲线方程为:
y=-3.456x+39.000,R2=0.998。
4.一种用于荧光定量PCR方法定量检测棉花材料群体中MON757转化体含量的试剂盒,其特征在于,包括荧光定量PCR反应的引物和探针,序列如下:
757-3QF:5‘-GGCATGCACATACAAATG-3’,
757-3QR:5‘-CCCATTATTATTCTGTTGTTG-3’,
探针为:
757-3QP:5‘-FAM-ACGAACGGATAAACCCTTTCTGGA-BHQ1-3’。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,还包括(1)曲线方程说明书,
记载有MON757转化体特异性片段序列的曲线方程y=-3.456x+39.000,R2=0.998;
以及棉花内标准基因ACP1基因的标准曲线方程y=-3.553x+40.494,R2=0.999。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒,还包括用于制备标准曲线的作为标准品的MON757转化体纯合材料的基因组DNA。