本发明属于生物技术领域。特别是涉及定量检测棉花材料群体中MON757转化体含量的方法。
背景技术：
转基因棉花是全球种植的主要转基因作物之一，也是我国种植面积最大的转基因作物。2014年，我国710万农户种植了转基因棉花390万公顷，占棉花总种植面积93％，高于2013年90％的比例。目前我国批准商业化种植的转基因棉花主要有国内研发的转cry1Ab/Ac融合基因的抗虫棉和孟山都公司的转基因cry1Ac基因的抗虫棉MON531转化体(http://www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/)。
转基因棉花MON757转化体是由孟山都公司研发的，采用MON531转化体同一质粒载体进行转化。MON757转化体与MON531转化体在棉花基因组的插入位点、插入片段结构都不相同(https://www.aphis.usda.gov/brs/aphisdocs/94_30801p.pdf)。目前，MON757转化体在美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、日本、韩国和南非等批准种植或允许用作食品饲料原(http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp？EventID＝55)，但在我国作为转化体尚未获得批准种植。然而，汪巧等2011年在检测我国市场上的转基因棉花时发现，转基因抗虫棉鄂杂棉1号与新棉33B(新棉33B是MON531转化体的衍生品种)具有相同构建，但转化事件并不相同，采用GenomeWalking的方法获得了鄂杂棉1号的旁侧序列，并建立了转化体特异性定性检测方法。
本实验室在偶然的实验中，通过序列比对发现，鄂杂棉1号旁侧序列与专利US6893826中公开的MON757转化体序列高度相似，因此可以确定鄂杂棉1号的转基因转化体来源于MON757转化体。
鄂杂棉1号中检出MON757转化体也说明以MON757转化体为亲本获得的育种后代已经流传到我国。对棉花材料中MON757转化体的含量测定，是检测转基因棉花质量的重要指标，也可以为转基因的标识提供技术依据。但是目前国内外尚未有MON757转化体定量PCR方法的报道。
技术实现要素：
针对上述领域中的空白，本发明提供一种可检测待测棉花中是否含有MON757转化体及其含量的试剂盒和方法，本发明公开的技术方案如下：
一种定量检测棉花材料群体中MON757转化体含量的方法，包括如下步骤：
(1)获取MON757转化体特异性片段序列的标准曲线方程，
所述曲线方程是以MON757转化体纯合材料的基因组DNA稀释成梯度浓度后作为模板，以梯度浓度的对数值为横坐标，对所述梯度浓度的模板进行MON757转化体荧光定量PCR反应所得的荧光信号值为纵坐标，拟合出曲线方程；
所述MON757转化体荧光定量PCR反应采用的引物和探针如下：
757-3QF：5‘-GGCATGCACATACAAATG-3’，
757-3QR：5‘-CCCATTATTATTCTGTTGTTG-3’，
探针：
757-3QP：5‘-FAM-ACGAACGGATAAACCCTTTCTGGA-BHQ1-3’；
(2)获取棉花内标准基因ACP1基因的标准曲线方程：
所述曲线方程是采用步骤(1)中获取MON757转化体特异性片段序列的曲线方程所采用DNA模板，以模板的浓度对数值为横坐标，对模板进行ACP1基因荧光定量PCR反应所得的荧光信号值为纵坐标，拟出出来的方程；
其中所述荧光定量PCR反应采用的引物、探针、PCR反应体系和程序采用国家标准《农业部1943号公告-1-2013》中所记载的定量检测ACP1基因的方法；
(3)随机选取待测棉花材料群体中的多个材料，研磨后混合提取待测DNA，
(4)以待测DNA为模板进行MON757转化体荧光定量PCR反应，读取荧光信号值并带入所述MON757转化体特异性片段序列的曲线方程计算得到待测DNA中MON757转化体的拷贝数；
以待测DNA为模板进行所述ACP1基因荧光定量PCR反应，读取荧光信号值并带入棉花内标准基因ACP1基因的标准曲线方程计算得到待测DNA中ACP1基因的拷贝数；
(5)MON757转化体含量＝(MON757转化体拷贝数/ACP1基因拷贝数)×2。
优选地所述MON757转化体荧光定量PCR反应的体系为：PremixExTaqTM10μL，10μmol/L上、下游引物各1.5μL，10μmol/L探针0.75μL，50×ROX0.4μL，DNA模板2μL，补超纯水至总体积20μL；
MON757转化体荧光定量PCR反应的程序为：95℃预变性2min，95℃变性5s，60℃退火和延伸34s，扩增反应进行40个循环，在60℃收集PCR扩增荧光信号。
由于转基因抗虫棉MON757转化体在美国等已经批准种植近20年，在我国进口的棉花及其加工产品中很难避免有上述成分。而且在我国部分省区的转基因棉花中也检测到这个转化体。
本发明通过序列比对发现，鄂杂棉1号旁侧序列与专利US6893826中公开的MON757转化体序列高度相似，因此可以确定鄂杂棉1号的转基因转化体来源于MON757转化体。
本发明还在以MON757转化体连接区序列(SeqIDNo.9)为靶标，设计了定量PCR引物和探针，并建立了MON757转化体特异性的定量PCR检测方法，适合棉花批量样品中MON757转化体的含量测定。基于实验数据，本发明提供了用于定量检测棉花批量样品中MON757转化体的含量的检测方法，以及试剂盒。
综上，因此本发明为特异性定量测定转基因抗虫棉MON757转化体提供了便利，这些方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。
附图说明
图1.转基因棉花MON757转化体定量PCR检测的引物和探针示意图
序列中小写字母为插入序列，大写字母为棉花基因组序列
图2.MON757转化体的定性PCR检测
1-6：MON757纯合样品；7-14：MON757杂合样品；15-20：非转基因样品；21-22：空白对照；M：DL2000
图3.单粒转基因棉花材料的MON757转化体定性PCR检测
A.鄂杂棉7号F1B.华惠4号
图4.定量PCR方法扩增曲线和标准曲线
A.MON757转化体；B.ACP1基因
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。
实施例1.引物和探针设计
本发明偶然通过序列比对发现，鄂杂棉1号旁侧序列(其全长序列Genbank登录号为AR656168，全长4973bp)与专利US6893826中公开的MON757转化体序列高度相似，因此可以确定鄂杂棉1号的转基因转化体来源于MON757转化体。
定性检测引物的设计：
本发明在MON757转化体插入位点两侧基因组上设计引物，以及插入序列上设计引物，三条引物如下：
757-GF：5‘-CTAACCTCAATGAGAGCTACC-3’(SeqIDNo.1)，
757-TF：5‘-TCATGTAGCAATGTCCTGCC-3’(SeqIDNo.2)，
757-GR：5‘-GTAATAACTTGATGATGATTTGAG-3’(SeqIDNo.3)，如图1所示。
其中757-GF/757-TF扩增区域为MON757转化体的5‘端棉花基因组与转基因序列的连接区，757-GF/757-TF对MON757转化体的扩增序列，184bp，如SeqIDNo.4所示；
757-GF/757-GR扩增片段为棉花基因组序列，位于棉花基因组(陆地棉)的Dt_chr11染色体的10276759-10277039位，扩增序列为291bp。而在含有转化体的基因组中，插入位点的引物之间的片段为包括完整插入片段的区域，预期超过10kb，这么长的片段在普通PCR条件下则不能获得扩增；因此即仅能在不含MON757转化体的样品中，获得棉花基因组序列的291bp的扩增产物，如SeqIDNo.5.所示；
三条引物联合使用，预计在杂合体中可以扩增出两条条带。
可用于常规PCR方法快速准确鉴定田间棉花单株或单粒棉花种子中的MON757转化体的纯杂合状态。
定量检测引物和探针的设计：
本发明以MON757转化体的转基因序列与3’端棉花基因组的连接区(SeqIDNo.9所示，其全长序列Genbank登录号为AR656167，全长513bp)为靶标，设计了用于MON757转化体特异性的定量PCR检测方法的引物和探针，适合棉花批量样品中MON757转化体的含量测定。具体如下：
2条引物为：757-3QF：5‘-GGCATGCACATACAAATG-3’(SeqIDNo.6)，757-3QR：5‘-CCCATTATTATTCTGTTGTTG-3’(SeqIDNo.7)，
探针为：757-3QP：5‘-FAM-ACGAACGGATAAACCCTTTCTGGA-BHQ1-3’(SeqIDNo.8)。
实施例2.转基因抗虫棉MON757转化体的定性PCR检测方法
1实验材料
1.1转基因抗虫棉材料
鄂杂棉1号(润富棉839)(生厂商：湖北中香米业有限责任公司，生产批号：2009-10，审定编号：鄂审棉001-2000)，2010年购自湖北省棉花种子市场。在中国农业科学院植物保护研究所温室种植，经单株筛选鉴定、自交繁殖等获得MON757转化体的纯合材料和杂合材料。
鄂杂棉7号F1(别名宏杂棉071)(生厂商：湖北省仓谷满种业有限公司，审定编号：鄂审棉2004003)，2014年购自湖北省棉花种子市场。
华惠4号(生厂商：湖北惠民农业科技有限公司，生产批号：201310，审定编号：国审棉2000010)，2014年购自湖北省棉花种子市场。
1.2试剂
分子生物学试剂，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker等购自大连宝生物工程有限公司。
其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京三博生物技术有限责任公司合成。
1.3实验仪器
PCR扩增仪：型号S1000(Bio-Rad公司)
核酸电泳仪：DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)
凝胶成像系统：BiospectrumAC(UVP公司)
其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。
2实验方法和过程
2.1样品前处理
温室种植的棉花材料，分别取单株叶片。鄂杂棉7号F1和华惠4号样品随机选取60粒种子，单粒研磨。
2.2棉花基因组DNA提取
依照植物DNA提取试剂盒(TIANGEN生物技术有限公司)的操作手册，进行棉花材料总DNA的提取。取5μl提取的DNA溶液，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。
2.3温室种植单株棉花材料的检测
采用建立的由3条引物757-GF、757-GR和757-TR组成的MON757转化体定性PCR检测方法，选择纯合、杂合和不含MON757转化体的温室棉花材料单株进行验证。
PCR反应体系：GoGreenMasterMix10μL，引物757-GF、757-GR和757-TR(10μmol/L)各1μL，DNA模板2μL，补超纯水至总体积20μL。反应程序：95℃预变性4min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，扩增反应进行35个循环，72℃保温10min。
在MON757转化体杂合样品中，三条引物分别扩增插入位点的棉花基因组序列和5’连接区序列，获得291和184bp的两种扩增产物；在MON757转化体纯合样品中，仅能获得5’连接区序列的184bp的扩增产物，而基因组引物之间的片段为包括完整插入片段的区域(预期超过10kb)，在普通PCR条件下则不能获得扩增；而不含MON757转化体的样品中，仅能获得棉花基因组序列的291bp的扩增产物。
验证结果表明，如图1所示，纯合MON757转化体植株仅扩增得到一条184bp的片段，杂合植株得到184bp和291bp两条条带，不含MON757转化体的植株只得到一条291bp的条带，这与预期结果完全一致。因此，建立的MON757转化体定性PCR方法能有效地鉴别MON757转化体及其存在状态。
2.4棉花种子样品中MON757转化体的定性PCR检测
分别随机抽取鄂杂棉7号F1和华惠4号样品的60个单粒，采用建立的MON757转化体特异性定性PCR方法进行鉴定(图3)，结果表明鄂杂棉7号F1样品中MON757转化体纯合、杂合和不含有的分别为0、2和58粒，而华惠4号样品中这三类分别为6、22和32粒。参照国家标准中转基因含量的计算方法进行计算：
MON757转化体含量＝(纯合MON757转化体数量+杂合MON757转化体数量/2)/60。
计算结果表明，鄂杂棉7号F1和华惠4号样品的MON757转化体含量分别为1.67％和28.33％。
实施例3.转基因抗虫棉MON757转化体的定量PCR检测方法
1实验材料
1.1转基因抗虫棉材料
鄂杂棉1号(润富棉839)(生厂商：湖北中香米业有限责任公司，生产批号：2009-10，审定编号：鄂审棉001-2000)，2010年购自湖北省棉花种子市场。
MON757转化体的纯合材料：鄂杂棉1号在中国农业科学院植物保护研究所温室种植，经单株筛选鉴定、自交繁殖等获得MON757转化体的纯合材料和杂合材料，用于定量检测方法标准曲线的制备。
鄂杂棉7号F1(别名宏杂棉071)(生厂商：湖北省仓谷满种业有限公司，审定编号：鄂审棉2004003)，2014年购自湖北省棉花种子市场。
华惠4号(生厂商：湖北惠民农业科技有限公司，生产批号：201310，审定编号：国审棉2000010)，2014年购自湖北省棉花种子市场。
1.2试剂
分子生物学试剂，如PremixExTaqTM(ProbeqPCR)等购自大连宝生物工程有限公司。
其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物和探针由北京三博生物技术有限责任公司合成。
1.3实验仪器
定量PCR扩增仪：型号ABI7500(ABI公司)
其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。
2实验方法和过程
2.1样品前处理
鄂杂棉7号F1和华惠4号样品随机选取600粒种子，研磨混匀。
2.2棉花基因组DNA提取
依照植物DNA提取试剂盒(TIANGEN生物技术有限公司)的操作手册，进行棉花材料总DNA的提取。取5μl提取的DNA溶液，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。
3定量PCR方法标准曲线的建立
将MON757转化体纯合材料的基因组DNA溶液用超纯水依次稀释至每微升22000、2200、220、44、22个棉花基因组拷贝。以模板拷贝数的对数值为横坐标，以Cq值为纵坐标建立MON757转化体特异性片段序列和棉花内标准基因的标准曲线。
MON757转化体的定量PCR反应体系：PremixExTaqTM(ProbeqPCR)10μL，上下游引物(10μmol/L)各1.5μL，探针(10μmol/L)0.75μL，50×ROX0.4μL，DNA模板2μL，补超纯水至总体积20μL。
使用ABIPRISM7500荧光定量PCR仪(美国)扩增，反应程序：95℃预变性2min，95℃变性5s，60℃退火和延伸34s，扩增反应进行40个循环。PCR扩增荧光信号在60℃收集。
建立的MON757转化体特异性的定量PCR扩增标准曲线。标准曲线的线性回归方程为y＝-3.456x+39.000，线性决定系数(R2)为0.998，扩增效率为94.7％，其中y为Cq值，x为拷贝数的对数值(图4，A)。
参照国家标准《农业部1943号公告-1-2013》，以每微升11000、1100、110、22、11个棉花基因组拷贝的MON757转化体纯合材料基因组DNA为模板，以国家标准《农业部1943号公告-1-2013》中公开的ACP1基因的引物，探针，PCR程序和体系,制备标准曲线方程，y为Cq值，x为拷贝数的对数值，建立的棉花内标准基因ACP1基因的标准曲线回归方程为y＝-3.553x+40.494，线性决定系数(R2)为0.999，扩增效率为91.2％(图4，B)。
MON757转化体和ACP1基因的标准曲线参数完全符合实时荧光PCR方法实验室质量要求，可以用于定量检测。
2.4棉花种子样品中MON757转化体的定量PCR检测
采用建立的MON757转化体定量PCR方法测定鄂杂棉7号F1和华惠4号样品中MON757转化体和ACP1基因的拷贝数。
采用国家标准《农业部1943号公告-1-2013》中公开的ACP1基因的引物/探针(第6页A2.1)，PCR程序和体系(第4页7.5.2节)测定ACP1基因的拷贝数。
由于在棉花基因组中ACP1基因的拷贝数为2，所以样品中棉花基因组拷贝数为ACP1基因的拷贝数的1/2。因此按照以下公式定量计算样品中MON757转化体的含量。
MON757转化体含量＝(MON757转化体拷贝数/ACP1基因拷贝数)*2
检测结果表明，鄂杂棉7号F1和华惠4号的MON757转化体含量分别为1.56％和25.88％，这与通过定性PCR鉴定单粒纯杂合估算的1.67％和28.33％比较吻合，说明定量检测方法的检测结果准确可靠。